专利名称:重组人类白细胞介素-2的提纯的制作方法
人体白细胞介素-2(IL-2)，从前称做T细胞生长因子(TCGF)，是一种可溶性蛋白，可以从被外源凝集素或抗原激活的T细胞中获得，它具有调节淋巴细胞反应性的功能，并有助于对抗原特异的效应性T淋巴细胞的体外长期培养。还知道IL-2具有增加胸腺细胞有丝分裂和诱导细胞毒性T淋巴细胞的反应。据此，这种淋巴细胞调节物质对增强体液和细胞免疫应答及把免疫缺陷状态恢复到正常的体液及细胞免疫状态是有作用的。这些被确认了的IL-2的免疫学活性指明，IL-2在医学免疫治疗免疫性疾病，包括肿瘤疾病，细菌或病毒感染，免疫缺陷病，自身免疫病等等时是有用的(佩珀马斯特·B等人;免疫药理学进展，507.1980)。最近，在美国医学会的杂志第249卷第2期第166～171页(1983年1月14日)上的一篇综述性文章中，讨论了各种不同的淋巴因子，特别包括了人体的IL-2的临床应用。
最近已从应用多步骤的高效能的液相层析(HPLC)法，把由诱导的人体恶性细胞中获得的IL-2提纯为均质性物质。这种均质性的人体IL-2显示出了一种每毫克为1.4×106单位的特殊活性(例如，参见欧洲专利申请号83.109202.8，公开号106179)。
塔尼古奇(Taniguchi)等人于1983年2月9日在宾西法尼亚州费城的第三届重组DNA(脱氧核糖核酸)年会上，报道了IL-2基因的克隆化和其顺序的排列，并且还报道了人体IL-2的不成熟型式的表达(“自然”，302期305～310〔1983〕)。IL-2蛋白体氨基酸序列是由cDNA(互补DNA)而来，此cDNA是从由刀豆球蛋白A诱导的Jurkat细胞中得到的mRNA(信使核糖核酸)中制备出来。整个cDNA克隆长为800个碱基对，编码一种153个氨基酸的蛋白质。同样参见欧洲专利申请。公开号91539。
其他小组也报道了IL-2基因的克隆化和其顺序的排列。见德沃斯(Deves)等人所写的“人体IL-2cDNA的分子克隆化及其在大肠杆菌F.coli中的表达”。“核酸研究”。1983年11卷4307～4323页。还可见欧洲专利申请，公布号118977。
尽管这些参考资料描述了IL-2在转化的宿主细胞中，特别是在E.coli中的表达，但都没有公开过使该技术领域：
的专业人员能够获得均质的或基本上纯净的成熟的重组人体IL-2的纯化过程。
本发明是一种纯化重组IL-2特别是重组的成熟的人体IL-2的方法。本发明提供了一种提纯重组的成熟的人体IL-2使之达到均质性的方法，该方法克服了先有的提纯方法的局限性。这个方法包括(1)培养一种含有可能编码出成熟的人体IL-2的DNA序列的转化的生物体。
(2)制造一种(1)步骤中转化的生物体的培养以表达和积累成熟的人体IL-2。
(3)溶解(2)步骤已转化的生物体的培养物以得到一种细胞溶胞的混合物。
(4)把细胞膜成分从步骤(3)中的细胞溶胞混合物中分离出来。
(5)用提取液清洗分离出的细胞膜成分以得到含有IL-2的洗液。
(6)用层析法纯化(5)步骤的洗液以得到基本上纯净的或均质的重组人体IL-2。
本发明的附图的简介如下图1描绘了pIL2-2B的DNA核苷酸序列及相应的成熟的人体IL-2的氨基酸顺序(箭头代表成熟的IL-2蛋白质的氨基末端。
图2以图的方式解释了从pBR322来的pRC2的结构。
图3图解了含有一个PL启动子的pRC23的结构。
图4表示了为表达Ser-IL-2的结构基因的构成。
图5图解了一个不带启动子系统(pRC201/IL-2)的成熟的IL-2表达载体的结构。
图6图解了含有一个PL启动子系统(pRC233/IL-2)。
本发明的过程是依赖于出人意外地发现了由微生物所表达的IL-2蛋白质倾向于伴随着宿主微生物的膜碎片，主要是微生物的内膜(脂质双层膜通常伴有疏水蛋白质)。因而，在重新获得IL-2的过程中把这些膜从转化微生物中分离，保证了在整个提纯过程的最后时刻获得高产和纯净水平的IL-2。
虽然本发明的过程中可以应用不同的已知的细胞溶解的方法，如酶解或化学溶解，但最好用超声波破碎方法。然后用已知的方法如离心方法把细胞的外膜及内膜同其他细胞成分分开。
一旦细胞膜从溶解的混合物中分离出来，就用提取液清洗之，倾向于用盐和清洁液，以获得含有至少约为百分之五十的IL-2的溶液。在一个比较好的实施例中，细胞膜是用盐和清洁液分四步清洗的。第一步最好用盐溶液清洗细胞膜，最好用1摩尔的氯化钠溶液。第二步中，用清洁液清洗细胞膜碎片，最好用百分之一的去利通(Triton)X-100溶液。第三步，用另一种盐溶液清洗细胞膜碎片，最好用1.75摩尔至2摩尔的盐酸胍溶液。最后一步清洗用的还是一种盐溶液，最好用约4摩尔至7摩尔的盐酸胍溶液。第4步，即最后一步所得的洗液中含有大约至少百分之五十的IL-2。
最后一步的IL-2洗液进一步用层析法提纯，最好用反相高效能液相层析。这一步得到的是几乎是百分之百纯净的或均匀性质的活性IL-2。还可以预见，对IL-2的多克隆或单克隆抗体的抗体亲和层析柱，可以做为高效能液相层析的替代物使用。其他的层析法也可应用，如染料亲和柱(如普施安红色琼脂糖〔Procion red agarose〕，记载于欧洲专利申请第83103582.9号，1983年10月26日公开号为92163的公报中)，或者葡聚糖聚丙烯酰胺(Sephacryl)S200柱。在本发明的另一个较好的实施例中，层析包括多个步骤，即在高效能液相层析之后接着用染料亲和层析。
依照本发明，前面所提到的纯化了的IL-2可以像其他已知的免疫调节因子化合物一样，用于相似的目的，如做为处理免疫抑制条件的一种方法。它可用于药用上可接受的口服、注射、或局部使用的成分和方式。剂量与剂量率可以与现在所用于临床应用的已知的免疫调节化合物相平行，典型的是每日为1～200×106单位。本发明的这些医药组合物包含着所说的IL-2及与它相容的药用的可接受的载体材料。任何常规的载体材料都可应用。载体材料可以是有机或无机的、适于肠道的、经由皮肤的，或非肠道的用药的。适宜的载体包括水、明胶，阿拉伯树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、聚(亚烷基)二醇，特别是聚乙二醇和凡士林及类似物。进一步讲，药物制剂可以包含其他的药用活性剂。其他的添加剂，如调味剂、安定剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂及其类似物，可以依照可被用于实践的药用化合物的合成过程来加入。
药物制剂可以用任何的常规形式，包括有1.用于口服的固体形式，像片剂、囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂及类似物;2.用于口服的液体形式，如溶液，糖浆，悬浮液，酒剂及类似物;3.非肠道应用的制剂，如消毒液、悬浮液或乳剂，以及4局部应用的制剂，如溶液、悬浮液、软膏、乳剂、胶体、微粒粉剂、烟雾剂及类似物。药物制剂可以是消毒的和(或)可以含有辅药的，如含有保护剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于产生不同渗透压的盐和(或)缓冲剂。
非肠道剂型可以是输液的或注射液的，该注射液可以用于静脉注射或肌肉注射。制剂中还可以包含其他的医药活性物质。其他的添加剂，如保护剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂及类似物，可以依照制药化合物所能接受的实际情况来加入。
IL-2表达载体的结构和能够表达IL-2的转化物的结构在此给以更详细的描述。
图1绘出了成熟的IL-2蛋白体的氨基酸序列。蛋白体可以用它的成熟的形式表达出来，如果基因的起始密码子是ATG，那么在氨基末端就有一个甲硫氨酸。在表达之后，甲硫氨酸可以或不可以被宿主细胞去掉。
本发明所用的表达载体是从pBR322诱导出的，该pBR322是含有从噬菌体λDNA中分离出的PL启动子的。选用PL启动子，是因为它是个很强有力的启动子，而且能被λcI阻遏物方便有效地控制，可以定位在微生物染色体上的基因，适合的载体或者是与含有PL启动子的载体相同的载体都可以方便有效地控制该启动子。编码阻遏物的基因带有一个cIts突变，它使阻遏物成为温度敏感型的。一个可以用于本发明的，含有cI突变的载体是pRK248cIts，它是已有技术，卡恩(Kahn)等人在《酶学方法》1979年第68卷268页上
描述过它。在30℃时，阻遏物功能正常，从37～42℃时，它就灭活了。这样，PL启动子在30℃时被阻遏(被关闭)，在42℃时阻遏作用消失(被开启)。控制PL启动子的能力使得人们能在大约30～36℃时，使培养物生长而不表达出基因产物，在最适时间把温度从大约30℃转变到42℃以生产出所希望的成熟的人体IL-2产物。
用于本发明的较好的载体同样还包含有一个EcoRI限制位点(大肠杆菌限制性内切酶RI切点)，它是在SD序列远端的(在3′方向的下方)。以下的叙述是用于解释制备一种较好的载体pRC23的，此后，IL-2基因被引入到它上边的。然而，也可用其他的载体。
依照图2、3所描述的过程，pBR322的20个微生物用EcoRI内切酶酶解，然后用在两个反应中，1.用SL核酸酶处理以去掉5′悬垂，2.用DNA聚合酶Ⅰ的大片段(Klenow片段)处理以填补终端。两个反应都是用苯酚提取继之以乙醇沉淀而终止。从每一个反应中得到的DNA都被连接到一种合成的BglⅡ内切酶接头上，用BglⅡ和pstⅠ内切酶酶解，通过1%琼脂糖的凝胶电泳。两个反应中的3600个碱基对的和760个碱基对的片段从凝胶电泳中回收出来。为了制造pBC2，从Klenow反应中得到的3600个碱基对的片段被连接到从SL反应中得到的760个碱基对的片段上。把连接的混合物转移到大肠杆菌RRL上，转化物质用每毫升含50微克氨苄青霉素的培养基来选出。含有所要的质粒结构的转換物，即质粒上含有一个BgLⅡ切点，其位置在EcoRL切点附近的，是用分离的质粒DNA的切点分析法来鉴定的。pRC23的制造是用含有一个“同意突变”或计算机产生的核糖体结合位点(RBS)的合成的寡核苷酸(谢勒等人〔Scherer〕，核酸研究，1980年第8卷3895页〕连接到一个含有λPL启动子的250个碱基对BgLⅡ-HaeⅢ片段上，而且把连接的产物插入到pRC2上。
为了分离出含有λPL启动子的250个碱基对的DNA片段，1微克含有450个碱基对的BgLⅡ-HpaⅠ DNA片段(从λ噬菌体DNA序列的＃35260碱基对到35710碱基对)，同HaeⅢ相酶解，其产物用5%聚丙烯酰胺制备的凝胶电泳分离出来。大约200毫微克的含有250碱基对BgLⅡ-HaeⅢ的片段，同图3所示的每一种合成的寡核苷酸的60微微摩尔相连接，这些合成的寡聚核苷酸含有大部分的“同意突变”RBS序列，这是由正如谢勒等人所描述的计算机分析所得出来的。连接好的分子用BgLⅡ和EcoRL内切酶来酶解(以消除寡聚体)，并且用凝胶电泳纯化。此后，连接好的产物就插入到pRC2中，而这个pRC2又是已被BgLⅡ和被EcoRL酶解了的。大肠杆菌RRL(pRK248cIts)品系的转化是用标准的方法来完成的，转化的物质是用含有氨苄青霉素(每毫升50微克)的培养基在30℃时来选择的。得到了50个转化物，从其中的8个中分离出了DNA，而且用HincⅡ内切酶酶解分析了它们。这8个之中的6个显示出了所期望的限制性内切酶切的型式，而且用马克萨姆-吉尔伯特(Maxam-Gilbert)核苷酸序列分析法分析了其中的一个，肯定了所期望的结构(称为pRC23)。
制造一个包含着编码成熟人体IL-2的DNA的质粒表达载体。
1.编码人体IL-2的mRNA的分离mRNA是从H33HJ-JAI细胞(1982年8月26日储存在美国培养物样板收集中心，储存号是CRL-8163)中分离出来的，这些细胞是用PHA和PMA诱导后的Jurkat细胞系FHCRC的一个克隆。在RPMI1640组织培养基中生长出12000毫升的H33HJ-JAI克隆细胞培养物(106细胞/毫升)，同时在配养基中加入10%的牛胎儿血清，50单位/毫升的青霉素，50微克/毫升的链霉素，50微克/毫升的庆大霉素及300微克/毫升新鲜的左旋-谷酰胺。用离心方法收集这些细胞，并且把它们重新悬浮在6升上述的培养液中，其中不要血清，但进而加入1%的PHA和10毫微克/毫升的PMA。这些细胞分成了6升一份，放入灭了菌的玻璃摇瓶内，然后，再把它们放到一个滚动磨中去(每分钟10转，37℃)。
8小时以后，用离心法收集细胞，用标准的酚氯仿提取方法来提取mRNA。在酚氯仿提取之后，用乙醇沉淀之，用调整离心使RNA成为小球状，再使之悬浮于0.5摩尔的盐溶液中，在整个RNA群体中的聚合A尾端的mRNA，是用使该物质通过低(dT)纤维素柱的方法收集。乙醇沉淀的mRNA再悬浮于水中，其浓度为500微克/毫升。30毫微克的RNA微量注入到非洲蟾蜍(Xenopus)的卵母细胞中。在无菌巴思液中孵化24小时之后，把4个卵转移到无菌的1.5毫升的Eppenderf离心管内，再加以500～1500微升的新鲜无菌巴思溶液。48小时之后，200微升的适于卵条件的培养基就收获到了，并且用标准的CTLL细胞3H-Tdr掺入试验(吉利恩等人〔Gillis〕。免疫学杂志1978年120卷2027页)测定IL-2的活性。用卵母细胞翻译的mRNA制剂是产生IL-2的显著活性，把这些mRNA制剂混合起来，用标准的蔗糖密度梯度离心技术标出它们的大小，并且用乙醇沉淀以建立cDNA文库。
2cDNA(互补脱氧核糖核酸)的合成合成双链互补DNA(ds cDNA)，用的是3.5微克提纯了的mRNA(大约是蔗糖梯度的10S)，采用以下的方法(格布勒和霍夫曼〔Gubler and Heffman〕。基因。25，263-269〔1983〕)。
(a)第一条cDNA链的合成mRNA悬浮于17.5毫升的含有50毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCI)，PH8.3，10毫摩尔的氯化镁，10毫摩尔二硫苏糖醇，4毫摩尔焦磷酸钠，1.25毫摩尔腺嘌呤脱氧(核糖核苷三磷酸，1.25毫摩尔脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸，1.25毫摩尔三磷酸脱氧胸腺嘧啶核苷，0.5毫摩尔三磷酸脱氧胞嘧啶核苷，100微克/毫升的寡脱氧胸腺嘧啶核苷12～18，及10居里的32P-dCTP(阿默沙姆〔Amersham〕3000居里/毫摩尔)。在43℃孵育5分钟，加入3000单位AMV逆转转录酶/毫升(生命科学公司)，这个混合物在43℃孵育30分钟。该反应在加入乙二胺四乙酸(EDTA)到20毫摩尔时停止，用酚-甲酚提取，再用乙醇沉淀法浓缩之。第一条合成链的结果，用不溶的三氯醋酸测定其放射活性，计算出产量为58.6毫微克(1.7%)。
(b)第二条链的合成cDNA-mRNA杂交物再悬浮到5.8微升的水中，在这个溶液中加入7.7微升的第二条链合成混合物，该溶液含有20毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH7.5，5毫摩尔的氯化镁，10毫摩尔的硫酸胺，100毫摩尔的氯化钾，0.15毫摩尔的β-铺酶1，50微克/毫升的牛血清清蛋白，40毫摩尔的三磷酸脱氧核苷(dNTPs)，8.5单位/毫升的大肠杆菌中得到的H RNA酶(貝西斯达〔Bethesda〕研究室)，230单位/毫升的DNA聚合酶1(伯林格-曼海姆公司〔Boehringer Mannheim〕)，10单位/毫升的从大肠杆菌中得到的DNA连接酶(新英格兰生物制品公司〔New England Biolabs〕)。该混合物在12℃条件下孵育60分钟，再在22℃条件下孵育60分钟。反应在加入乙二胺四乙酸(EDTA)到20毫摩尔时停止，并用酚-甲酚提取。cDNA是通过含有10毫摩尔的三乙醇胺(TEAB)缓冲液的颗粒很细的葡聚糖G-50层析柱而与游离的核苷相分开。该反应的产量是107毫微克的双链互补脱氧核糖核酸(ds cDNA)(91%)。
(c)复性和转化用标准的方法加入脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸(dGTP)使64毫微克的双链互补脱氧核糖核酸获得尾端。把pBR322 DNA同EcoRV(新英格兰生物制品公司)相酶接，并且用三磷酸脱氧胞嘧啶核苷(dCTP)使其尾端化，用这样的方法制备载体。把100毫微克的尾端化的pBR322 DNA及1.25毫微克的尾端化的cDNA插入体(比率为80∶1)放在250微升0.01摩尔三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH7.5，1毫摩尔乙二胺四乙酸(EDTA)，0.15摩尔氯化钠的溶液中，在58℃条件下培养90分钟使它们复性，并且转化到有活性的大肠杆菌RRI细胞中。转化了的细胞放置到含有100微克/毫升氨苄青霉素(布里斯托尔实验室〔Bristol labs〕)的LB培养基板上，在37℃条件下孵育12小时。整个3200个菌落用来产生IL-2互补脱氧核糖核酸文库。
3.为得到IL-2基因序列筛选互补脱氧核糖核酸文库为了测定IL-2基因的拷貝cDNA的全长，用了一个合成的脱氧寡核苷酸探针，该探针是对应人体IL-2互补脱氧核糖核酸序列的第45～65核苷酸的，如塔尼古奇(Taniguchi)及其他人发表的(自然302 305～310 1983)。该探针〔ACAATGTACAGGATGCAACTC)是用固相磷酸二酯方法合成的，并用高效液相层析(HPLC)提纯它，再用32P三磷酸腺苷(32P-ATP)(ICN药剂。7000居里/毫摩尔)和多聚核苷酸激酶标记它(新英格兰生物制品公司)。代
互补脱氧核糖核酸文库的菌落，用格鲁斯坦(Grustein)和霍格内斯(Hogness)方法转移到硝化纤维滤器中(酶学方法68 379〔1979〕)。经过在30℃的16小时的杂交之后，用4XSSC在45℃条件下冲洗滤器45分钟，干燥，放射自显影。这时发现了一个阳性菌落，并且发现它含有整个的IL-2编码序列。该菌落被标为pIL-2B，并用它来制备一种脱氧核糖核酸，这种脱氧核糖核酸是用于核苷酸序列分析的及用在大肠杆菌中表达的。核苷酸序列分析表明，它与塔尼古奇等人发表的序列是相等的，只是有二点不同pIL-2B含有一个插入体，它起始于塔尼古奇所定名的序列的第十七位核苷酸，而且在第503位上有一个G的代換。
4.制造含有编码Ser-IL-2的脱氧核糖核酸的大肠杆菌质粒载体用于IL-2的一个大肠杆菌的表达载体，是用3段制造的(见图4)(1)带有λP2启动子的载体pRC23;(2)一个合成的连接物及(3)一个从IL-2互补脱氧核糖核酸中分离出来的Hgi AI-AhaⅢ片段。制备脱氧核糖核酸的载体，是把50毫微克的pRC23脱氧核糖核酸与EcoRI和EcoRV相酶解，然后用苯酚提取和用乙醇沉淀。合成连接物是把两个互补的合成的脱氧寡核苷酸序列A和B相对合而得到的(A)5′AATTCAATTATGAGTGCA3′(B)3′GTTAATACTC5′这个双链的连接物可以在其5′末端与EcoRI位点和在其3′末端与HgiAI位点对合。互补脱氧核糖核酸的插入体是用PIL2-2B脱氧核糖核酸与BamRI限制性内切酶(貝西斯达〔Bethesda〕研究室)相酶解而得到的，从而由这个菌落中产生出一个1千碱基对的IL-2插入体。BamHI片段用凝胶纯化，进而与HgiAI(新英格兰生物制品公司)和AhaⅢ(新英格兰生物制品公司)相酶解，接着用酚提取，用乙醇沉淀。HgiAI是在编码成熟的IL-2序列的起始处的丙氨酸和脯氨酸之间切开的。表达的菌落方案是用pRC23载体中邻近PL启动子的EcoRI位点。合成的连接物分子可以在互补脱氧核糖核酸IL-2序列的开始处的HgiAI位点与载体的这种EcoRI位点之间加入。该连接物是被指定为产生开始翻译的甲硫氨酸密码子的。丝氨酸和丙氨酸的密码子，即成熟的IL-2的第一个氨基酸，是在连接物与互补脱氧核糖核酸在HgiAⅠ位点酶接好时而产生的。互补脱氧核糖核酸加到pRC23上是通过AhaⅢ位点与载体脱氧核糖核酸的EcoRV位点的平整末端酶接而完成的。这三个片段放在一个10微升体积的，含有载体、合成连接物、互补脱氧核糖核酸插入体脱氧核糖核酸各0.05微微摩尔，pH值为7.6的乙二胺四乙酸、10毫摩尔的氯化镁，0.5毫摩尔的三磷酸腺苷及15毫摩尔的β-巯基乙醇的液体中，完成它们的酶接。酶接好的混合物以65℃加热5分钟，冷却到4℃，然后加入200单位的T4脱氧核糖核酸连接酶(新英格兰生物制品公司)，然后在4℃条件下孵育16小时。当加热到65℃5分钟时，T4脱氧核糖核酸连接酶失去活性。然后，连接好的脱氧核糖核酸序列用EcoRV内切酶酶解，去掉那些不可酶解的脱氧核糖核酸载体。然后，用这个混合物转化大肠杆菌的RRI品系(pRK248 cIts)，再把这些细胞放在30℃条件下使其生长15小时。
按照前边所述的方法把菌落转移到硝化纤维滤器中，烘烤，再用32p标记的合成连接物A的放射活性探针杂化它。一个阳性的，定名为pRc23/IL-2，＃4-1的菌落被选来做分析。这个菌落被发现当在42℃时诱导λPL启动子用于表达时，具有合成大于200，000单位/毫升的IL-2的能力。其IL-2活性是用生物测定方法测定的，所用的OTLL细胞是一种对于IL-2的指示细胞系(如吉利斯〔Gillis〕等人在免疫学杂志120 2027〔1978〕所描述的)。
5.用于产生成熟的IL-2的大肠杆菌表达载体的制造(其氨基终端的第一个氨基酸是丙氨酸)为了在大肠杆菌中表达成熟的IL-2，进行以下几个步骤(如图5所示)。HgiAI限制性核酸内切酶的一个切点选在丝氨酸-丙氨酸连接处，即选在为了去掉IL-2的信号肽的那个断裂处(罗布等人〔Robb et al〕PNAS 80 5990-5994〔1983〕)。接着HgiAI酶解之后，用T4脱氧核糖核酸聚合酶处理，使它的终端成为平整末端。所产生的分子的平整末端就与一个108个碱基对的BglⅡ-HaeⅢ片段相连接，该片段是从λ噬菌体脱氧核糖核酸中分离出来的，并用BglⅡ和XbaⅠ内切酶酶解了，被插入到载体pRC23/IL-2，＃4-1的BglⅡ位点与XbaⅠ位点之间的。这一克隆中间体形成的步骤，包括保证T4DNA聚合酶的处理要依照所期望的那样发生，这可以从把HaeⅢ末端与HgiAI平整化了的末端相结合而产生出新的StuI位点来得到肯定。用StuI再次酶解，很方便地使起始端为CCT脯氨酸密码子的平整末端在此位点再生。这个中间体的质粒结构被指定为pRC201/IL-2。设计了2个合成脱氧寡核苷酸，它们是与一个ATG-翻译起始密码子相混合，恢复丙氨酸密码子及制造一个EcoRI末端。这些寡聚体连接到表达载体pRC23的EcoRI末端上，用PstI酶解，并且把所得到的1025个碱基对的片段用凝胶纯化。1025个碱基对的片段(自PstI至平整末端)插入到pRC201/IL-2的新出现的StuI位点与PstI位点之间。含有所需要的结构的转化物，是用分离的质粒脱氧核糖核酸的内切分析来确认的。所确认的质粒结构被指定为pRC233/IL-2(见图6)。用一个含有涉及本发明的IL-2的基因的载体进行转化时，比较好的宿主有机体包括细菌，如大肠杆菌各品系，杆菌属，如枯草芽孢杆菌及类似的。酵母菌是一组更好的用于转化的微生物。一个特别好的，作为转化过程中受体的微生物是大肠杆菌K-12品系294，被记载于英国专利公布号2055382A中，储存于美国培养物样本收集中心，其储存号为31446，1978年10月28日。但是也有其他已知的大肠杆菌品系，如品系RRI，美国培养物样本收集中心储存号31343，或者其他的微生物，其中大部分储存于承认的微生物储存中心并且可从该处得到，这类中心如美国培养物样本收集中心等，这些微生物都可以用作宿主生物。在实现本发明时，把转化了的大肠杆菌过夜的培养物放在30℃的LB液体培养基内使它们生长。一升过夜的培养物最好稀释于10升的含有酪蛋白氨基酸的少量的M-9培养基的溶液中。在对数生长期，把培养物由30℃移动到42℃条件下以诱导产生IL-2。接着在42℃条件下培养2-3小时，用离心法收集细菌。整个发酵及其过程是遵照国立卫生研究所的重组DNA指南进行的。提纯的详细步骤在以下的实例中给予描述。
例1.
一克由IL-2(其N末端带有丝氨酸)诱导的大肠杆菌转化细胞悬浮于含有30毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH8.0，5毫摩尔的乙二胺四乙酸，1毫摩尔苯基甲基硫酰基氟化物的溶液中，并用超声处理使其溶解。溶解的混合物以14000g离心15分钟。把离心后的溶胞物中的膜成分取出并且与溶胞物中的其他成分相分离。膜成分用表1所示的四步冲洗或IL-2提取，每一步的洗液至少用每克细胞5毫升的量。大部分的IL-2活性物是在最后一步的冲洗中提取出的，详见表1。最后一步冲洗所得的液体中含有大部分的IL-2活性物质，并且用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测其纯度至少为50%，接着把这种液体通过反相高效液相层析(RP-C8)。这样就回收到40～60%的纯度几乎为100%的IL-2(在N末端带有丝氨酸)。测定IL-2的活性至少为1×108单位/毫克。
表1 从大肠杆菌细胞膜中提取IL-2总蛋白质 总IL-2活性 特异活性提取液 (毫克) (单位) (单位/毫克)1摩尔氯化钠洗液 0.4mg 0.03×1060.1×106(IMNacl)1%去利通洗液 2mg 0.75×1060.4×106(1%Triton)1.75摩尔盐酸胍洗液 1mg 1.5×1061.5×106(1.75M guanidine-Hcl)
7摩尔盐酸胍洗液 4.7mg 250×10653×106(7Mguanidine-Hcl) ((99%))/(252.3×106)例2本例是用以证明IL-2是倾向于与转化了的大肠杆菌宿主细胞的膜成分相结合的。
为了证明这一点，将1克N末端为丝氨酸的诱导大肠杆菌细胞转化的IL-2悬浮于含有10毫升浓度为20%的蔗糖，30毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液PH8.0的溶液中，用溶菌酶-乙二胺四乙酸进行溶胞以分离出蛋白质，这些蛋白质集中于外周胞质的间隙中。剩下的溶胞混合物再经超声处理。细胞膜部分(内膜及外膜)再用蔗糖梯度离心与其他细胞成分分离开，同时内膜与外膜也被分开。表2显示出大多数的IL-2活性物质都集中在细胞内膜中。
表2 IL-2在大肠杆菌细胞中的分布总蛋白质 总IL-2活性 IL-2回收率部分 (毫克) (单位) 百分数〔%〕可溶部分 37mg 2×1060.3外周胞质部分 2mg 10×1061.5外膜 6mg 8×1061.2内膜 15mg 6.6×10897例3把1克诱导大肠杆菌细胞转化的成熟的IL-2悬浮于含有30毫摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液PH8.0，5毫摩尔乙二胺四乙酸，1毫摩尔苯基甲基硫酰氟化物的溶液中，并且用超声处理使其溶胞。对溶解的混合物以14000g离心15分钟。已离心的溶胞物的膜部分与其他溶胞成分相分离。膜成分用表3所示的四步冲洗或IL-2提取步骤提取。每一步所用洗液的量，至少为每克细胞5毫升。大部分的IL-2活性物质是在表3所示的最后一步中提取到的。最后一步得到的洗液中含有大部分的IL-2活性物质，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其纯度至少为50%，把这种液体再通过反相高效液相层析(RP-C3)。回收到大约60%的纯度基本为100%成熟IL-2。测定IL-2活性大约为4×108单位/毫克。
表3 从大肠杆菌细胞膜中提取成熟的IL-2总蛋白质 总IL-2活性 特异活性提取液 (毫克) (单位) 单位/毫克)1摩尔氯化钠 0.5 0.3×1060.6×106(IMNacl)1%去利通 3.3 5.5×1061.7×106(1%Triton)1.75摩尔盐酸胍 2.5 10.0×1064.0×1067摩尔盐酸胍 10.1 779×10677.1×10698%794.8×106例4下边这个例子给出了用高效液相层析之外再加上普施安(Procion)红色琼脂糖层析这一步以从转化了的大肠杆菌膏状物中提纯成熟IL-2的方法。
细胞膜提取冰冻的大肠杆菌细胞(含有作为人体IL-2的质粒)被融解，把1克此物质加到5毫升的缓冲液A(0.03摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，PH8.0，0.005摩尔乙二胺四乙酸)中。混合10分钟之后，放入一个Sorval ss-34转头中离心，从而把这些细胞分离出来(每分钟10.000转离心10分钟)。把上清液去掉，再把细胞重新悬浮于5毫升的缓冲液A中。这些悬浮的细胞用一个布兰森超声波细胞粉碎器350(6×30秒)破碎。破碎的细胞进行离心(每分钟10.000转离心10分钟)，含有可溶性蛋白质的上清液被扔掉。用5毫升的缓冲液A冲洗沉淀物一次，并且离心(每分钟10.000转离心10分钟)。含有膜碎片的沉淀物悬浮于缓冲液B(1摩尔氯化钠，0.03摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸，PH8.0，0.005摩尔乙二胺四乙酸)，放入一个惠顿-杜恩斯(Wheaton Dounce)组织匀浆器中。混合10分钟后，用一个Sorval ss-34转头(每分钟15000转，10分钟)离心，使膜碎片分离出来。残余物放入5毫升的缓冲液C(1%去利通X-100，0.03摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸，PH8.0)中，进行匀浆，混合及离心(每分钟15000转，10分钟)。离心后的残余物再悬浮于5毫升1.75摩尔的盐酸胍溶液中，进行匀浆，混合及离心(每分钟15000转，10分钟)。残余物用5毫升缓冲液A冲洗一次并且离心。用5毫升的7摩尔盐酸胍提取膜碎片(残余物)。离心之后，含有IL-2的提取物保存起来，并把残余物用5毫升的7摩尔盐酸胍再次提取。这次的提取物同样保存起来。
普施安红色琼脂糖层析在室温条件下设置一个柱，第一次走柱之前，用两倍柱体积的7摩尔盐酸胍溶液冲洗该柱。在温度为4℃时用平衡缓冲液使此柱达到平衡(平衡缓冲液为0.01摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸，PH7.9，0.035摩尔氯化钠)。对所期望的每100微克IL-2至少要用1毫升的普施安红色琼脂糖。流速为每小时2个柱床体积。含有IL-2的7摩尔盐酸胍提取液用平衡缓冲液稀释40倍，并且用离心法去掉沉淀物。然后把上清液装入柱内。用两倍柱床体积的平衡缓冲液冲洗该柱，在用1.5～2柱床体积的洗脱缓冲液洗脱后，洗脱的IL-2达到一个峰值(洗脱缓冲液为0.01摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸，PH7.9，1.035摩尔氯化钠)。当IL-2被提取之后，用6摩尔的盐酸胍溶液冲洗以去掉无关的物质。
在RP-P(C-18)〔反相高效液层析〕柱上的层析普施安红色洗脱液的PH值，用缓慢加入1.0摩尔的醋酸调整到7。在PH值调整的前后，每次取0.1毫升用于测定。中性洗脱液(60毫升)用每分钟1毫升的速率泵入一个0.31×25厘米的RP-18柱内，并用由5%高效液相层析缓冲液Ⅱ和95%高效液相层析缓冲液Ⅰ混合制成的平衡缓冲液使该柱平衡。流过柱子的液体被收集起来以测定蛋白质含量和IL-2生物活性。在室温条件下，依照表4所描述的梯度洗脱方案洗脱该柱。流出物在220毫微米处监测，洗脱收集到的每个组分为1.5毫升，然后分析其蛋白质含量及IL-2活性。IL-2活性的最大峰值是在高效液相层析缓冲液梯度大约为74%时出现的。把各组分保存在4～8℃，并依照特异的活性进行混合。
表4 在RP-18柱上对一个典型的普施安红色洗脱物进行层析的条件加入样品量60毫升柱的面积 0.41×25厘米 流速1毫升/每分钟HPLC缓冲液Ⅰ0.01摩尔磷酸，0.05摩尔氯化锂HPLC缓冲液Ⅱ0.01摩尔磷酸，0.05摩尔氯化锂80%乙腈%HPLC缓冲液Ⅱ 持续时间(分钟)平衡 5 20装样 - 60冲洗 5 15
第一步，梯度 5～35 15第二步，梯度 35～85 50第三步，恒定浓度 85 5第四步，恒定浓度 5 5层析的所有步骤都在室温下完成。
权利要求
1.一种制造基本上均质的成熟重组人体白细胞介素-2(IL-2)的方法，包括(a)培植一种含有编码成熟人体IL-2的DNA序列的转化了的有机体；(b)制造一种步骤(a)的转化了的有机体的培养物以表达和积累成熟的人体IL-2；(c)把步骤(b)中的转化了的有机体的培养物溶胞以形成细胞溶胞混合物；(d)把细胞膜成分从步骤(c)的细胞溶胞混合物中分离出来；(e)用提取液冲洗分离出来的细胞膜成分以获得含有IL-2的冲洗液；(f)对步骤(e)的冲洗液用层析法提纯以获得基本纯净或均质的重组人体IL-2。
2.根据权利要求
1所述的方法，其中转化了的微生物的培养物用超生法破碎。
3.根据权利要求
1或2所述的方法，其中的细胞膜成分是用离心法从细胞溶胞混合物冲分离出来。
4.根据权利要求
1至3中任何一项所述的方法，其中分离出来的细胞膜成分是用盐和清洁液中洗先于用提取液冲洗。
5.根据权利要求
4所述的方法，其中的盐和清洁液的冲洗是按顺序分为三步完成。
6.根据权利要求
5所述的方法，其中对细胞膜成分冲洗的第一步用的是氯化钠溶液，第二步用的是清洁液，第三步用的是摩尔浓度约为1.75～2.0的盐酸胍溶液。
7.根据权利要求
6所述的方法，其中盐酸胍溶液的浓度约为7摩尔。
8.根据权利要求
1所述的方法，其中层析提纯是用高性能液相层析。
9.根据权利要求
1所述的方法，其中层析提纯是用亲和层析。
10.根据权利要求
9所述的方法，其中亲和层析是用染料亲和层析。
11.根据权利要求
1所述的方法，其中层析提纯是应用高效能液相层析和亲和层析的多步骤的过程。
12.一种含有依照权利要求
1至11中任何一项所述方法提纯的均质重组人类IL-2作为活性组份，以及一种生理上相容载体的药物组合物。
13.一种药用组合物的制备方法，其特征在于将根据权项1-11中任何一项所述方法生产的均质重组人类IL-2与生理上相容载体相混合。
专利摘要
制备基本上均质的重组成熟人体IL-2的方法，包含着把细胞膜成分从转化了的微生物的溶胞物中分离出来，该微生物表达和积累了IL-2，及由细胞膜成分中提取IL-2并对提取物用层析法进行纯化。
文档编号C12N1/02GK85103306SQ85103306
公开日1987年5月27日 申请日期1985年4月30日
发明者希格扩·亚玛扎凯 申请人:弗·哈夫曼-拉罗彻有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan