专利名称：基因重组人胸腺素β4的制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及ー种用毕赤酵母表达的基因重组人胸腺素β 4的制备方法。
背景技术：
胸腺素(Thymosins)是由胸腺产生的一种淋巴生长因子，由Goldstein和White于1966年首次从胎牛胸腺蛋白提取液中发现，是ー组小分子多肽，含有40多种组分。根据这些多肽在等电聚焦电泳分析图谱上的位置，可以划分为α、β、Y三型PI (α)<5,5〈ΡΙ ( β )〈7，PI ( y ) >7。目前已经有20多种β胸腺肽异构体被鉴定出来，而人体内主要存在三种胸腺素β4、胸腺素β 10和胸腺素β 15，其中胸腺素β 4含量最高。胸腺素β4是由43个氨基酸组成，结构高度保守的水溶性多肽，N末端具有こ酰化修饰，平均分子量为 4964Da，等电点为5. I。胸腺素β 4被认为是主要的球形肌动蛋白结合肽，能与球形肌动蛋白単体结合从而阻断其聚合，具有免疫调节的功能，是ー种在多种组织均有表达的蛋白多肽，在液体，血液中均存在。大量的研究表明胸腺素β4能够诱导内皮细胞分化，促进血管生成，井能促进创伤愈合和心肌梗塞时心肌细胞的存活和血管生成。胸腺素β 4在治疗皮肤、角膜创伤，治疗心肌梗塞，抗肿瘤治疗，抗炎等方面有着广阔的应用前景，目前胸腺素β 4在治疗创伤、心肌梗塞等方面已经进入临床试验。目前临床和研究中使用的胸腺素β4的来源主要有两种，一是从小牛胸腺提取，ニ是化学合成。从小牛胸腺中提取胸腺素β 4不仅成本高，且受材料来源和提取技术的限制，其纯度不高，含量较低；而杂质多也带来许多问题，尤其是目前牛的病毒越来越多，给动物提取也带来麻烦。随着基因工程的发展，利用基因工程手段来生产胸腺素β 4将成为一个新的方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述胸腺素β 4生产成本高、纯度底的缺点，提供ー种所得产品纯度高、生产成本低、简单有效的基因重组人胸腺素β4的制备方法。解决上述技术问题所采用的技术方案是以I型人胶原蛋白作为前导肽引导人胸腺素β 4表达的基因重组人胸腺素β 4融合蛋白，I型人！]父原蛋白的氣基酸序列为I GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVP⑶LGA PGPSGARGER181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP301 ⑶RGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP
361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKS⑶RGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET基因重组人胸腺素β 4融合蛋白的氨基酸序列为I GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVP⑶LGA PGPSGARGER 181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP301 ⑶RGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKS⑶RGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET601 EFDDDDKSDK PDMAEIEKFD KSKLKKTETQ EKNPLPSKET IEQEKQAGES基因重组人胸腺素β 4融合蛋白的氮端为I型人胶原蛋白的600个氨基酸组成的前导肽，碳端为人胸腺素β 4的43个氨基酸，两段氨基酸序列之间添加肠激酶切割位点、用于连接的谷氨酸和苯丙氨酸，分泌表达后，在体外经肠激酶切割获得基因重组人胸腺素β 4。基因重组人胸腺素β 4的氨基酸序列如下I SDKPDMAEIE KFDKSKLKKT ETQEKNPLPS KETIEQEKQA GES上述基因重组人胸腺素β 4的制备方法包括下述步骤I、基因的获得从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA，反转录获得cDNA，设计I型人胶原蛋白基因PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I.EcoR I，I型人胶原蛋白基因PCR扩增引物的序列为F:CGCTCGAGGGTGTTGCTGGTCCCAAGGGTR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白基因，I型人胶原蛋白基因的核苷酸序列为I CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT61 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC121 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT181 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT241 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG301 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA361 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT421 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA481 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC
541 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA601 GGGGCCMCG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT661 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT721 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT781 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC841 CCTGGTGACA AGGGTGMAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT901 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT
961 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAMGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT1021 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT1081 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT1141 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT1201 CCTGGTCCTG CTGGCAMGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA1261 CGTCCTGGTG MGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT1321 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG1381 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC1441 CCCTCTGGTG MCCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGMCG TGGTCCCCCT1501 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT1561 CCTGGTGCCG MGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT1621 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT1681 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT1741 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT1801 GAGACAGAAT TC设计并全基因合成人胸腺素β 4的核苷酸序列，氨基酸序列不变，同时添加限制性内切酶酶切位点EcoR I.Not I、肠激酶切割位点GATGACGATGACAAG，人胸腺素β 4的核苷酸序列如下I GAATTCGATG ACGATGACAA GTCTGACAAA CCCGATATGG CTGAGATTGA GAAGTTCGAT61 AAGTCTAAGT TGAAGAAGAC TGAGACTCAA GAGAAGAATC CATTGCCTTC CAAGGAGACC121 ATTGAGCAGG AGAAGCAGGC CGGTGAATCT TAAGCGGCCG C2、载体pPIC9K与I型人胶原蛋白、人胸腺素β 4的连接对pPIC9K、I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为PPIC9K-C0L1 ;对pPIC9K-C0Ll质粒与人胸腺素β 4分别进行EcoR I、Not I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-COLl-T0 4 ;该重组DNA序列如下I CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT61 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC121 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT181 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT241 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG301 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA
361 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT421 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA481 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC541 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA601 GGGGCCMCG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT661 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT721 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT781 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC841 CCTGGTGACA AGGGTGMAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT901 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT961 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT1021 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT1081 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT1141 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT1201 CCTGGTCCTG CTGGCAMGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA1261 CGTCCTGGTG MGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT1321 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG1381 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC1441 CCCTCTGGTG MCCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT1501 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT1561 CCTGGTGCCG MGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT1621 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT1681 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT1741 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT1801 GAGACAGAAT TCGATGACGA TGACAAGTCT GACAMCCCG ATATGGCTGA GATTGAGAAG1861 TTCGATMGT CTAAGTTGAA GAAGACTGAG ACTCMGAGA AGAATCCATT GCCTTCCAAG1921 GAGACCATTG AGCAGGAGAA GCAGGCCGGT GAATCTTAAG CGGCCGC3、毕赤酵母电转化将10μ g经Sal I内切酶线性化的pPIC9K-C0Ll_T β 4质粒，与80 μ L毕赤酵母GSl 15感受态细胞混匀，GSl 15感受态细胞购于西安依科生物技术有限公司，转至O. 2cm冰预冷的电转化杯中，电击4 10毫秒，加入ImL冰预冷的lmol/L的山梨醇水溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30°C倒置培养2 3天，在MD培养基平板上长出菌落。4、多拷贝插入重组子的筛选将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为O. 5g/L、lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30°C培养，筛选获得转化子，G418购于西安依科生物技术有限公司。5、基因重组人胸腺素β 4融合蛋白毕赤酵母发酵将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30°C振荡培养24小时，作为ー级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，300C、pH值为5. O培养16 20小吋，作为ニ级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30°C、诱导温度29°C、pH值为4. 5、溶氧控制在20% 30%，流加入质量浓度为75%的含12mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液的体积比为I O. 25，诱导发酵36 42小时。6、基因重组人胸腺素β 4的纯化发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用孔径为O. I μπι的中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，用分子量为10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得融合蛋白；用肠激酶切割法对融合蛋白进行切割，用分子量为10000D或30000D或40000D的超滤膜超滤，收集滤过液，再用分子量为1000D的超滤膜超滤除盐，得人胸腺素β4粗蛋白；对人胸腺素β4粗蛋白用装有DEAES印harose FF填料的层析柱进行层析分离，得基因重组人胸腺素β40在本发明的基因重组人胸腺素β 4的纯化步骤6中，发酵结束后，发酵液离心 分离，取上清液，用孔径为O. I μ m中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，用分子量为10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得融合蛋白；用肠激酶切割法对融合蛋白进行切害I]，用分子量为30000D的超滤膜超滤，收集滤过液，再用分子量为1000D的超滤膜超滤除盐，得人胸腺素β4粗蛋白；对人胸腺素β 4粗蛋白用装有DEAE Sepharose FF填料的层析柱进行层析分离，得基因重组人胸腺素β4。本发明的肠激酶切割方法为用考马斯亮蓝法測定蛋白浓度，稀释至5mg/ml，加入重组肠激酶,每单位重组肠激酶切割5mg的融合蛋白，pH为6. O 8. 0，16°C切割18小时。本发明的肠激酶切方法为用考马斯亮蓝法測定蛋白浓度，稀释至5mg/ml，加入重组肠激酶，每单位重组肠激酶切割5mg的融合蛋白，pH最佳为8. 0,16°C切割18小时。本发明利用人I型人胶原蛋白在毕赤酵母的高表达特性引导人胸腺素β 4在毕赤酵母中稳定高效表达。在融合蛋白的I型人胶原蛋白前导肽与人胸腺素β4之间引入肠激酶切位点，避免了人胸腺素β 4因为分子量较小，表达、纯化过程中所遇到的难题，増加了表达量，简化了纯化程序，提高了产品的提取纯化效率，可用于制备基因重组人胸腺素β4。
图I是实施例I中载体pPIC9K-C0Ll-TP 4的质粒图谱。图2是实施例I中I型人胶原蛋白基因的PCR产物电泳图。图3是实施例I中pPIC9K-C0Ll-T β 4质粒双酶切鉴定电泳图。图4是实施例I中人胸腺素β 4的Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图5是实施例I中人胸腺素β 4的Western Blot鉴定图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进ー步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例I以I型人胶原蛋白作为前导肽引导人胸腺素β 4表达的基因重组人胸腺素β 4融合蛋白，氮端为I型人胶原蛋白的600个氨基酸组成的前导肽，碳端为人胸腺素β 4的43个氨基酸，两段氨基酸序列之间添加肠激酶切割位点、用于连接的谷氨酸和苯丙氨酸，分泌表达后，在体外经肠激酶切割获得基因重组人胸腺素β 4，基因重组人胸腺素β 4的氨基酸序列如前所述。上述基因重组人胸腺素β 4的制备方法包括下述步骤I、基因的犾得从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA,采用GeneCopoeia First-Strand cDNAsynthesis Kit试剂盒按说明书的使用方法进行反转录，获得cDNA, GeneCopoeia First-Strand cDNA synthesis Kit试剂盒由西安依科生物技术有限公司销售。根据GeneBank已发表的I型人胶原蛋白基因序列，按照引物设计原则，设计I型人胶原蛋白基因PCR扩增引物，同时引入限制性酶切位点Xho I.EcoR I，I型人胶原蛋白基因(COLl)PCR扩增引物的序列为F:CGCTCGAGGGTGTTGCTGGTCCCAAGGGTR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG25yL反应体系中含有13.3yL灭菌的二次蒸馏水、2.5yL IOXPCR buffer,3. 5 μ L 2mmol/L dNTP Mix,2. 5 μ L MgCl2,1 μ L 10 μ mol/L Primer F,I μ L 10 μ mol/LPrimer R，0· 2 μ LO. 5U/ μ L Taq 酶，I μ L cDNA 模板。反应条件为95°C 5 分钟，94°C 30 秒，560C 30秒，72°C 60秒，30个循环，72°C 10分钟，4°C 10分钟，用PCR仪进行扩增。I型人胶原蛋白的PCR扩增结果见图2，由图可见，在ISOObp处出现特异性条带，与I型人胶原蛋白设计的预期结果一致。重新设计并全基因合成人胸腺素β 4 (Τβ 4)的核苷酸序列，氨基酸序列不变，同时添加限制性内切酶酶切位点EcoR I.Not I及肠激酶切割位点GATGACGATGACAAG，其核苷酸序列如下I GAATTCGATG ACGATGACAA GTCTGACAAA CCCGATATGG CTGAGATTGA GAAGTTCGAT61 AAGTCTAAGT TGAAGAAGAC TGAGACTCAA GAGAAGAATC CATTGCCTTC CAAGGAGACC121 ATTGAGCAGG AGAAGCAGGC CGGTGAATCT TAAGCGGCCG C2、载体pPIC9K与I型人胶原蛋白、人胸腺素β 4的连接(I)载体pPIC9K和I型人胶原蛋白的双酶切对载体pPIC9K、I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I双酶切，pPIC9K载体购于美国Invitrogen公司。双酶切体系如下
二次蒸馈TK150 μ L
IOXbuffer20 μ L
pPIC9K(200ng/yL)20 μ LXho Iο P L EcoR I5 μ L
总体系200 μ L
二次蒸馏水140 μ L
权利要求
1. ー种基因重组人胸腺素β 4的制备方法，其特征在于它包括下述步骤 (I)基因的获得 从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA，反转录获得cDNA，设计I型人胶原蛋白基因PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I.EcoR I，I型人胶原蛋白基因PCR扩增引物的序列为F:CGCTCGAGGGTGTTGCTGGTCCCAAGGGTR:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG 采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白基因，I型人胶原蛋白基因的核苷酸序列为I CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT.61 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC . 121 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT.181 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT.241 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG.301 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA.361 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT . 421 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA . 481 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC.541 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA . 601 GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT . 661 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT . 721 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT . 781 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC.841 CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT . 901 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT . 961 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT . 1021 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT . 1081 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT . 1141 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT . 1201 CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA . 1261 CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT . 1321 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG . 1381 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC.1441 CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT.1501 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT.1561 CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT . 1621 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT.1681 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT.1741 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT.1801 GAGACAGAAT TC设计并全基因合成人胸腺素β 4的核苷酸序列，氨基酸序列不变，同时添加限制性内切酶酶切位点EcoR I.Not I、肠激酶切割位点GATGACGATGACAAG，人胸腺素β 4的核苷酸序列如下.1 GAATTCGATG ACGATGACAA GTCTGACAAA CCCGATATGG CTGAGATTGA GAAGTTCGAT.61 AAGTCTAAGT TGAAGAAGAC TGAGACTCAA GAGAAGAATC CATTGCCTTC CAAGGAGACC.121 ATTGAGCAGG AGAAGCAGGC CGGTGAATCT TAAGCGGCCG C (2)载体pPIC9K与I型人胶原蛋白、人胸腺素β 4的连接 对pPIC9K、I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为PPIC9K-C0L1 ;对pPIC9K-C0Ll质粒与人胸腺素β 4分别进行EcoR I、Not I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-COLl-T0 4 ;该重组DNA序列如下.1 CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT.61 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC.121 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT.181 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT.241 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG.301 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA.361 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT.421 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA.481 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC.541 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA.601 GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT.661 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT.721 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT.781 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC.841 CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT.901 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT.961 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT.1021 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT.1081 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT.1141 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT.1201 CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA.1261 CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT.1321 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG.1381 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC.1441 CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT.1501 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT.1561 CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT.1621 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT.1681 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT.1741 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT.1801 GAGACAGAAT TCGATGACGA TGACAAGTCT GACAAACCCG ATATGGCTGA GATTGAGAAG. 1861 TTCGATAAGT CTAAGTTGAA GAAGACTGAG ACTCAAGAGA AGAATCCATT GCCTTCCAAG.1921 GAGACCATTG AGCAGGAGAA GCAGGCCGGT GAATCTTAAG CGGCCGC (3)毕赤酵母电转化 将10 μ g经Sal I内切酶线性化的pPIC9K-COLl-T β 4质粒，与80 μ L毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至O. 2cm冰预冷的电转化杯中，电击4 10毫秒，加入ImL冰预冷的.lmol/L的山梨醇水溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30°C倒置培养2 3天，在MD培养基平板上长出菌落； (4)多拷贝插入重组子的筛选 将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为O. 5g/L、lg/L、.2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30°C培养，筛选获得转化子； (5)基因重组人胸腺素β4融合蛋白毕赤酵母发酵 将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30°C振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，300C、pH值为5. O培养16 20小吋，作为ニ级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30°C、诱导温度29°C、pH值为4. 5、溶氧控制在20% 30%，流加入质量浓度为75%的含12mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12mL/L PTMl微量元素的甲醇水溶液的体积比为I : O. 25，诱导发酵36 42小时； (6)基因重组人胸腺素β4的纯化 发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用孔径为O. I μ m的中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，用分子量为10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得融合蛋白；用肠激酶切割法对融合蛋白进行切割，用分子量为10000D或30000D或40000D的超滤膜超滤，收集滤过液，再用分子量为1000D的超滤膜超滤除盐，得人胸腺素β4粗蛋白；对人胸腺素β4粗蛋白用装有DEAE Sepharose FF填料的层析柱进行层析分离，得基因重组人胸腺素β 4，人胸腺素β 4氨基酸序列如下ISDKPDMAEIE KFDKSKLKKT ETQEKNPLPS KETIEQEKQA GES
2.根据权利要求I所述的基因重组人胸腺素β4的制备方法，其特征在干在基因重组人胸腺素β4的纯化步骤(6)中，发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用孔径为.O.I μ m中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液,用分子量为10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得融合蛋白；用肠激酶切割法对融合蛋白进行切割，用分子量为30000D的超滤膜超滤，收集滤过液，再用分子量为1000D的超滤膜超滤除盐，得人胸腺素β4粗蛋白；对人胸腺素β 4粗蛋白用装有DEAE Sepharose FF填料的层析柱进行层析分离，得基因重组人胸腺素β 4。
3.根据权利要求I或2所述的基因重组人胸腺素β4的制备方法，其特征在于所述的肠激酶切割方法为用考马斯亮蓝法測定蛋白浓度，稀释至5mg/ml，加入重组肠激酶，每单位重组肠激酶切割5mg的融合蛋白，pH为6. O 8. 0，16°C切割18小吋。
4.根据权利要求3所述的基因重组人胸腺素β4的制备方法，其特征在于所述的肠激酶切方法为用考马斯亮蓝法測定蛋白浓度，稀释至5mg/ml，加入重组肠激酶，每单位重组 肠激酶切割5mg的融合蛋白，pH为8. 0,16°C切割18小吋。
全文摘要
一种基因重组人胸腺素β4的制备方法，包括基因的获得、载体pPIC9K与I型人胶原蛋白和毕赤酵母电转化人胸腺素β4的连接、多拷贝插入重组子的筛选、基因重组人胸腺素β4融合蛋白毕赤酵母发酵、基因重组人胸腺素β4的纯化步骤。本发明利用人I型人胶原蛋白在毕赤酵母的高表达特性引导人胸腺素β4在毕赤酵母中稳定高效表达。在融合蛋白的I型人胶原蛋白前导肽与人胸腺素β4之间引入肠激酶切位点，避免了人胸腺素β4因为分子量较小，表达、纯化过程中所遇到的难题，增加了表达量，简化了纯化程序，提高了产品的提取纯化效率，可用于制备基因重组人胸腺素β4。
文档编号C12N15/81GK102660550SQ20121014995
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月7日 优先权日2012年5月7日
发明者侯增淼, 李哲, 李晓颖, 赵金礼, 高恩 申请人:西安华澳丽康生物工程有限公司