专利名称：一种表达重组nisin-rbLF-N融合基因的大肠杆菌工程菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种高效表达重组nisin-rbLF-N融合 基因的大肠杆菌工程菌、其构建方法及诱导培养方法。
背景技术：
乳酸链球菌素(Nisin)是一种高效、无毒的天然防腐剂，也是唯一一种可作为防 腐剂应用于食品的细菌素。Nisin又称乳酸链球菌肽，是由乳酸链球菌产生的一种多肽物 质，它能有效抑杀嗜热脂肪芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、肉毒梭 菌、乳酸菌等各种革兰氏阳性菌的营养细胞和芽孢。加入食品中，可大大地降低食品的灭菌 温度、缩短食品灭菌时间，使食品保持原有营养成份、风味、色泽，同时还可节约大量能源。 可广泛应用于肉制品、乳制品、植物蛋白食品、罐装食品、果汁饮料及经热处理密闭包装食 品的防腐保鲜，同时也可应用于化妆品和医疗保健品等领域。乳铁蛋白肽(LFcin)是乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶作用N端释放的一段多 肽，广泛存在于动物的乳汁、体液、泪液、唾液、血浆、中性粒细胞及多种组织中。具有抗菌、 抗病毒、抗氧化、消炎、抗癌、调节机体免疫、促进骨细胞生长等多种生物功能，在众多的功 能中，抗菌功能是最引人注目的，而对真核细胞几乎没有毒性。且牛乳铁蛋白氨基末端多肽 (rbLF-N)的抗菌活性较其它的乳铁蛋白肽活性高具有很好的应用前景。Nisin应用前景广阔，但也存在局限性，如不能够抑制G-菌、酵母菌以及霉菌，在 中性及碱性环境中溶解度低、不稳定而且抗菌效果大大降低等，因此扩大nisin抗菌谱的 研究不仅具有理论价值，而且具有十分重要的应用价值。本发明针对乳链菌肽(nisin)抑菌谱窄的缺点，选择抗菌谱较广且具有较强抗性 的牛乳铁蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)为材料，构建融合基因nisin-rbLF-N，并在毕赤酵母 GS115宿主中进行表达，获得具有较广抗菌谱的融合蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种能在大肠杆菌中高效表达的重组nisin-rbLF-N融合基 因。本发明的另一目的是提供一种含有所述重组nisin-rbLF-N融合基因的表达载 体。本发明的再一目的是提供能够高效表达重组nisin-rbLF-N融合基因的大肠杆菌 工程菌及其构建方法。本发明的进一步目的是提供所述大肠杆菌工程菌的诱导培养方法。为了实现本发明目的，本发明提供一种融合基因，其含有编码乳酸链球菌素的 nisin基因和编码牛乳铁蛋白氨基末端多肽的rbLF-N基因。前述的融合基因为Nisin-rbLF-N，其具有Seq ID No. 1所示的核苷酸序列或该序 列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有编码同等功能蛋白质的核苷酸序列。
本发明还提供含有上述融合基因的表达载体，优选地，其出发载体为PGEX-4T1。本发明还提供含有上述表达载体的工程菌。优选地，所述工程菌为大肠杆菌BL21。本发明另外提供构建上述大肠杆菌BL21工程菌的方法。根据密码子的简并性，设计并合成适于在BL21中表达的nisin基因，并在5’端和 3’端设计EcoRI和BamHI酶切位点，将优化后的nisin基因克隆于pMD19_T载体。根据目 的序列分别设计引物。在上游引物设计酶切位点BamHI (下划线标记)和保护碱基。上游引物Fl :5，-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3’ ；下游引物Rl :5，-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3，。根据牛乳铁蛋白cDNA序列，设计引物。在上游引物设计与nisin互补配对的序列 (下划线标记)，下游引物设计酶切位点EcoR I (下划线标记)、终止密码子和保护碱基。上游引物F2 :5，-GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3’ ；下游引物R2 5，-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3，。以合成的pMD19-T/niSin质粒为模板，用引物Fl、Rl进行PCR扩增nisin基因 为179bp，纯化回收PCR产物；以牛肉中提取的总DNA为模板，用引物F2、R2进行PCR扩增 rbLF-N基因为181bp，纯化回收PCR产物；以纯化回收后的nisin基因和rbLF_N基因为模 板，用引物Fl、R2进行PCR扩增nisin-rbLF-N融合基因约为340bp。PCR产物纯化回收后 与 pGEM-T easy 载体连接，得到 pGEM-T easy/nisin-rbLF-N 质粒。以表达GST融合蛋白的pGEX-4Tl作为表达载体，将经过DNA序列分析正确的质粒 pGEM-T easy/nisin-rbLF-N和表达载体pGEX-4Tl分别用限制性内切酶BamH I和EcoR I 进行双酶切，酶切反应采用20 μ L体系。以上各溶液经瞬间离心混勻后，于37°C水浴酶切6h，取6 μ L酶切产物用1 %琼脂 糖凝胶电泳检测酶切条带，切胶回收该目的片段，回收片段置于-20°C下保存。将上述酶切 的目的基因片段连接到PGEX-4T1表达载体中，连接反应采用10 μ L体系。本发明选用的pEGX-4Tl质粒是表达GST融合蛋白的大肠杆菌高效表达载体，选择 该载体的主要原因是(1)它含有非常强的tac启动子，IPTG可诱导目的基因的高效表达； (2)表达产物利于分离纯化融合蛋白可通过谷胱甘肽S-转移酶(GST)亲和层析纯化，温 和的抽提条件对融合蛋白的抗原性和功能活性影响极小，再用凝血酶或Xa因子将GST切 除，可方便地获得目的蛋白。将上述pGEX-4Tl/niSin-rbLF-N原核表达载体转入大肠杆菌BL21 (DE3)，然后进 行重组克隆的筛选。为了获得Nisin-rbLF-N重组蛋白的高效表达，所述重组大肠杆菌BL21(DE3)工程 菌在如下条件下诱导培养1)挑取重组大肠杆菌BL21的白色菌落接种于含Amplr的LB液体培养基中37°C过 夜培养；2)按接种量将步骤1)过夜培养的菌液接种于LB液体培养基中，于37°C 扩大培养至菌液OD6tltl值达0. 6 0. 8 ；3)向步骤2)培养得到的菌液中加入IPTG，使其终浓度为lmmol/L，继续培养4h， 离心收集菌体。为了分离纯化nisin-rbLF-N重组蛋白，本发明还提供了由上述工程菌所表达的nisin-rbLF-N重组蛋白的纯化方法，包括如下步骤1)用超声波冰浴破碎重组大肠杆菌BL21的菌体，提取并溶解含有nisin-rbLF-N 重组蛋白的包涵体；2)将步骤1)得到的包涵体进行梯度透析，得到复性的nisin-rbLF-N重组蛋白。具体地说，本发明nisin-rbLF-N重组蛋白的纯化方法包括如下步骤1)向重组大肠杆菌BL21的菌体中加入磷酸盐缓冲液PBS及溶菌酶，超声破碎，提 取并溶解含有nisin-rbLF-N重组蛋白的包涵体；将得到的悬浊液用超声波冰浴破碎2次， 然后用水洗涤2次，得到包涵体蛋白；所述磷酸盐缓冲液PBS 含有 150mmol/L Tris-HCl, 32mmol/LNa2HP04,4mmol/L NaH2PO4, pH 值为 7.3 ；2)将步骤1)得到的包涵体蛋白用8mol/L尿素溶解，采用浓度梯度透析复性，复性 透析溶液 I 至 VI 分别是 6、4、2、1、0. 5、0mol/L尿素与 20mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl 配制的PH值8. 0的溶液，各浓度的复性透析溶液透析8h，复性后的溶液于5000 X g，离心 20min收集上清。由于尿素能够使包涵体蛋白变性、溶解，而在短时间内大幅降低尿素浓度会使包 涵体蛋白出现大量沉淀，因此使用尿素缓冲液梯度透析，可以使nisin-rbLF-N重组蛋白慢 慢回复天然结构及活性。本发明针对Msin抑菌谱窄的缺点，选择对抗菌谱较广且具有较强抗性的rbLF-N 为材料，构建nisin-rbLF-N融合基因，并在原核表达系统中表达，获得具有G+菌抗性的融 合蛋白。其优点在于(1)本发明针对乳链菌肽(nisin)抑菌谱窄的缺点，选择对抗菌谱较广且具有较 强抗性的牛乳铁蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)为材料，通过特异引物的设计用PCR技术成功 获得融合蛋白基因nisin-rbLF-N，并能够由大肠杆菌高效表达，且融合蛋白的表达量占到 菌体蛋白总量的25. 3%，产率为1. 63g/L。(2)使用pEGX-4Tl作为表达载体，经过EcoR I和BamH I双酶切验证和测序分析， 结果表明与目的基因片段(340bp)的序列相吻合，其编码的氨基酸阅读框不变。(3)本发明将融合基因克隆到原核表达载体PGEX-4T1中，转化E. coli BL21 (DE3) 进行诱导表达，重组菌经诱导后可表达出可观的融合蛋白，融合蛋白大小为38kD左右。融 合蛋白以包涵体形式存在，包涵体经洗涤，尿素溶解，复性后具有干酪乳杆菌(G+菌)抗菌 生物活性。
图1为本发明以合成的pMD19-T/niSin质粒为模板，用引物Fl、Rl进行PCR扩增 的nisin基因片段和以牛肉中提取的总DNA为模板，用引物F2、R2进行PCR扩增的rbLF_N 基因片段；其中1为扩增目的片段nisin ；2为阴性对照；3为扩增目的片段rbLF_N ；4为阴 性对照；5 为 DL2000Marker。图2为本发明以纯化回收后的nisin基因片段和rbLF-N基因片段为模板，用引物 Fl、R2进行PCR扩增nisin-rbLF-N融合基因片段；其中1为nisin-rbLF-N的PCR产物；2 为 DL2000Markero
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图3为本发明重组质粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N的酶切鉴定电泳图，其中，1为 DL2000Marker ；2为目的基因nisin-rbLF-N的PCR产物对照；3为重组质粒双酶切产物；4 为重组表达质粒 pGEX-4Tl/nisin-rbLF-N。图4为本发明用特异引物Fl和R2从pGEM_T easy/nisin-rbLF-N质粒中扩增到 长度约为 340bp 的融合基因；其中，1 为 DL2000Marker ；2 为 pGEM_T easy/nisin-rbLF-N 质 粒的PCR产物。图5为本发明重组表达质粒pGEX-4Tl/niSin-rbLF-N双酶切鉴定电泳图，其 中，1为DL2000Marker ；2为重组表达质粒；3为重组表达质粒双酶切产物；4为目的基因 nisin-rbLF-N 的 PCR 产物对照。图6为本发明重组大肠杆菌BL21表达的GST-Ni sin-rbLF-N融合蛋白的SDS-PAGE 分析，其中，M为蛋白Marker ；1为包涵体复性后的上清；2为带有空载体pGEX_4Tl的大肠 杆菌BL21经12000 Xg离心后的上清；3为IPTG诱导含有pGEX-4Tl/nisin-rbLF_N的重组 大肠杆菌BL21，经12000 X g离心后的上清；4为IPTG诱导含有pGEX-4Tl/nisin-rbLF_N的 重组大肠杆菌BL21，经12000 X g离心后的沉淀。图7为本发明nisin-rbLF-N融合蛋白对G+菌的抑菌活性示意图，其中，1和2为 阳性对照乳酸链球菌素IOyL ;3为阴性对照8mol/L尿素经透析后的溶液100yL;4为复 性后上清融合蛋白复性后上清100 μ L。图8为本发明nisin-rbLF-N融合蛋白对G-菌的抑菌活性示意图，其中，1为对照 乳酸链球菌素10μ L ;2为复性后上清融合蛋白复性后上清100 μ L。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例Inisin基因及牛乳铁蛋白基因引物的设计、合成根据nisin基因序列及蛋白序列，使目的基因获得稳定表达，用适于在BL21中表 达的密码子代替那些不适合于在其中表达的密码子优化nisin基因，并在5’端和3’端设 计EcoR I和BamH I酶切位点。优化后的nisin基因序列合成并克隆于pMD19_T载体。根 据目的序列分别设计引物。在上游引物设计酶切位点BamH I (下划线标记)和保护碱基。上游引物Fl :5，-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3’ ；下游引物Rl :5，-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3，。根据牛乳铁蛋白cDNA序列，设计引物。在上游引物设计与nisin互补配对的序列 (下划线标记)，下游引物设计酶切位点EcoR I (下划线标记)、终止密码子和保护碱基。上游引物F2:5， -GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3’ ；下游引物R2:5，-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’。实施例2重组质粒pGEM-T easy/nisin-rbLF-N的构建与鉴定以合成的pMD19-T/niSin质粒为模板，用引物Fl、Rl进行PCR扩增nisin基因为 179bp，纯化回收PCR产物(图1)；以牛肉中提取的总DNA为模板，用引物F2、R2进行PCR扩 增rbLF-N基因为181bp，纯化回收PCR产物(图1)；以纯化回收后的nisin基因和rbLF_N基因为模板，用引物F1、R2进行PCR扩增ηi sin-rbLF-N融合基因约为340bp，纯化回收PCR 产物(图2)后与pGEM-T easy载体连接，并转化E. coli DH5 α，用PCR及EcoRI和BamHI 双酶切鉴定阳性克隆。(图4)实施例3niSin-rbLF-N基因表达载体的构建以表达GST融合蛋白的pGEX-4Tl作为表达载体，将经过DNA序列分析正确的质粒 pGEM-T easy/nisin-rbLF-N和表达载体pGEX-4Tl分别用限制性内切酶BamH I和EcoR I 进行双酶切，酶切反应采用20 μ L体系。(图3)以上各溶液经瞬间离心混勻后，于37°C水浴酶切6h，取6 μ L酶切产物用1 %琼脂 糖凝胶电泳检测酶切条带，并切胶回收该目的片段，回收片段置于-20°C下保存。将上述酶 切的目的基因片段连接到PGEX-4T1表达载体中，连接反应采用IOyL体系。反应条件为 95°C，4min ；94°C，30s，退火温度 58°C，60s，延伸 72°C，30s，35 个循环；72°C保温 IOmin。(图 5)实施例4大肠杆菌BL21 (DE3)的转化及重组菌的筛选、诱导表达(1)取出-80°C冻存的大肠杆菌BL21感受态细胞50 μ L于冰上解冻。(2)将5 μ L连接产物加入感受态细胞中，轻轻混勻后，于冰上放置30min。(3)将转化体系于42°C，热激90s后，立即放回冰上静置5min。(4)由冰上取出并加入900 μ L不含Amp的LB培养液，轻混勻后，于150rpm，37 °C 摇床预培养1. 5h。(5)于室温，5000 X g 离心 8min，弃去上清液，加入 IPTG (24mg/mL)和 X_gal (20mg/ mL)各10 μ L，将溶液轻轻混勻后，取100 μ L均勻涂布于含有Amp的LB平板上。(6) 370C，倒置培养12 18h后，在含有Amp的LB平板(Amp的浓度为60mg/mL) 上挑白色菌落提取质粒，并进行双酶切鉴定。(7)挑取大肠杆菌BL21的白色菌落(转化子)接种于5mL LB液体培养基中，37°C 过夜培养，用重组表达质粒pGEX-4Tl/niSin-rbLF-N为模板，FU R2为引物进行PCR反应。 PCR 反应条件95°C 4min ；94°C 30s，退火温度 58°C 60s，延伸 72°C 30s, 35 个循环；72°C保 温lOmin。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，扩增的片段长度为336bp。重组大肠杆菌的诱导表达挑取含有重组质粒的大肠杆菌BL21白色菌落接种于 Ampr的LB液体培养基中37°C过夜培养，按5v/v%的接种量吸取菌液，接种于LB液体培养 中于37°C扩大培养直至菌液0D_值达到0. 6 0. 8 ；加入IPTG使其终浓度为lmmol/L，继 续培养4h;将菌液离心(5000Xg，10min)收集菌体。实施例5提取包涵体将离心收集的菌体重悬于pH为7. 3的0. 01mol/L的磷酸盐缓冲液PBS (150mmol/ L Tris-HCl，32mmol/L Na2HPO4,4mmol/L NaH2PO4)中，使其含量为 100g/L，加入溶菌酶至 0. lmg/mL, 37°C消化lOmin。悬浊液超声波冰浴破碎，220 400W每次破碎时间为7s，各次 间隔10s，15次；4°C 12000g离心IOmin沉淀包涵体，除去上清。用包涵体洗涤液重悬沉淀， 再进行超声离心。然后用水洗涤，并且于12000 Xg离心收集沉淀，重复两次，收集沉淀(包 涵体)，冻干，-80°C保存。实施例6复性重组蛋白将收集的包涵体用8mol/L尿素溶解，采用浓度梯度透析复性。复性透析溶液I至
8VI 分别是 6、4、2、1、0. 5、0mol/L 尿素与 20mmol/LTris-HCl，500mmol/L NaCl 配制的 pH 值 8. 0的溶液，各浓度的复性透析溶液透析8h，复性后的溶液于5000Xg，离心20min收集上清。实施例7鉴定重组蛋白收集后的蛋白经SDS-PAGE 电泳，Tricine-SDS-PAGE 分析发现，GST-nisin-rbLF-N 重组融合蛋白主要以包涵体的形式存在。(图6)实施例8重组蛋白抗菌活性的初步检测取复性后上清液，采用琼脂扩散法检测抗菌活性，测试菌株为干酪乳杆菌 (G+菌)和大肠杆菌(G-菌)，抗菌活性如图7和图8所示。抗菌活性检测结果表明， GST-nisin-rbLF-N融合蛋白具有革兰氏阳性菌抗性。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
含有nisin rbLF N融合基因的表达载体，所述nisin rbLF N融合基因含有编码乳酸链球菌素的nisin基因和编码牛乳铁蛋白氨基末端多肽的rbLF N基因。
2.如权利要求1所述的表达载体，所述nisin-rbLF-N融合基因具有SeqID No. 1所示 的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有编码同等功能蛋 白质的核苷酸序列。
3.如权利要求1或2所述的表达载体，其特征在于，其出发载体为PGEX-4T1。
4.含有权利要求1-3任一项所述表达载体的工程菌。
5.如权利要求4所述的工程菌，其特征在于，其为大肠杆菌BL21。
6.构建权利要求5所述工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤1)根据密码子的简并性，设计并合成适于在BL21中表达的nisin基因，将优化后的 nisin基因克隆于pMD19-T载体，以合成的pMD19-T/niSin质粒为模板，用引物F1、R1进行 PCR扩增nisin基因，纯化回收PCR产物；以从牛肉中提取的总DNA为模板，用引物F2、R2 进行PCR扩增rbLF-N基因，纯化回收PCR产物；以纯化回收后的nisin基因和rbLF_N基因 为模板，用引物Fl、R2进行PCR扩增nisin-rbLF-N融合基因，纯化回收PCR产物；其中，Fl :5，-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3，；Rl :5’ -TTTGCTCACATGAATGCTGC-3’ ；F2 5' -GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3'；R2 :5’ -CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’ ；2)将步骤1)中合成的nisin-rbLF-N融合基因插入到载体pGEX-4Tl中；3)将步骤2)的含有nisin-rbLF-N融合基因的pGEX_4Tl载体转入大肠杆菌BL21中， 然后进行重组克隆的筛选，获得重组大肠杆菌BL21工程菌。
7.权利要求5所述工程菌的诱导培养方法，包括如下步骤1)挑取重组大肠杆菌BL21的白色菌落接种于含Amplr的LB液体培养基中37°C过夜培养；2)按接种量将步骤1)过夜培养的菌液接种于LB液体培养基中，于37°C扩大 培养至菌液OD6tltl值达0. 6 0. 8 ；3)向步骤2)培养得到的菌液中加入IPTG，使其终浓度为lmmol/L，继续培养4h，离心 收集菌体。
8.权利要求5所述工程菌表达的nisin-rbLF-N重组蛋白的纯化方法，包括如下步骤1)用超声波冰浴破碎重组大肠杆菌BL21的菌体，提取并溶解含有nisin-rbLF-N重组 蛋白的包涵体；2)将步骤1)得到的包涵体进行梯度透析，得到复性的nisin-rbLF-N重组蛋白。
9.如权利要求8所述的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤1)向重组大肠杆菌BL21的菌体中加入磷酸盐缓冲液PBS及溶菌酶，超声破碎，提取并 溶解含有nisin-rbLF-N重组蛋白的包涵体；将得到的悬浊液用超声波冰浴破碎2次，然后 用水洗涤2次，得到包涵体蛋白；所述磷酸盐缓冲液 PBS 含有 150mmol/L Tris-HC 1, 32mmo 1 /LNa2HPO4, 4mmo 1 /L NaH2PO4, ρΗ值为7. 3 ；2)将步骤1)得到的包涵体蛋白用8mol/L尿素溶解，采用浓度梯度透析复性，复性透析溶液 I 至 VI 分别是6、4、2、1、0. 5、0mol/L尿素与 20mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl 配制 的pH值8. 0的溶液，各浓度的复性透析溶液透析8h，复性后的溶液于5000 X g，离心20min收集上清。
全文摘要
本发明提供了一种Nisin-rbLF-N融合基因、含有该基因序列的表达载体，以及能够高效表达Nisin-rbLF-N融合基因的重组大肠杆菌工程菌；另外，本发明还提供了所述重组大肠杆菌工程菌的诱导培养方法。本发明通过PCR方法，将融合基因Nisin-rbLF-N克隆到原核表达载体pGEX-4T1中，转化大肠杆菌BL21后进行诱导表达，能够表达出可观的融合蛋白。融合蛋白以包涵体形式存在，包涵体经溶解、复性后具有干酪乳杆菌(G+菌)抗菌生物活性。
文档编号C07K1/14GK101974548SQ201010258789
公开日2011年2月16日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者王海峰, 田文莹, 田洪涛, 罗云波, 袁晓宇, 许文涛, 黄昆仑 申请人:中国农业大学