专利名称：Hsv1-tk基因重组溶瘤腺病毒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组溶瘤腺病毒，特别涉及HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒，还涉 及该重组溶瘤腺病毒的制备方法和应用。
背景技术：
肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，肿瘤治疗新方法的研究一直是医学和生命科学 研究的重点。肿瘤的生物治疗已被世界医学界公认为是继手术、放射治疗和化学治疗之后 的第四大治疗方法，其中免疫治疗与基因治疗更是生物治疗中最有效、最前沿的科研项目。
肿瘤基因治疗的原理是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使其表达此基因 而获得特定的功能，继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用，从而达到治疗之目的。基因 治疗主要涉及目的基因、载体及受体细胞三方面。载体影响目的基因导入和表达的效率，是 决定肿瘤基因治疗成败的关键因素。载体可分为病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体又 可分为复制型病毒载体和复制缺陷型病毒载体。为了确保在体治疗的安全性，传统的病毒 载体采用复制缺陷型病毒载体，但其在技术上很难达到100%的转染效率。近年来，随着现 代生物学和医学技术的发展，复制型病毒载体在肿瘤基因治疗中备受瞩目。
溶瘤病毒是一种通过遗传学改变而具有复制能力的病毒，不仅能够利用肿瘤细胞 中抑癌基因的失活或缺陷，选择性地在肿瘤细胞内复制，最终导致肿瘤细胞的溶解和死亡， 而且能够通过死亡的肿瘤细胞释放出病毒颗粒，产生级联效应，放大溶细胞效果，直至肿瘤 细胞被全部清除。此外，肿瘤细胞的破裂会释放出肿瘤抗原，从而诱导机体抗肿瘤免疫反 应，这也可能增强病毒的溶细胞效果。利用这种病毒进行的肿瘤治疗称为溶瘤病毒治疗。既 往研究证实，溶瘤病毒能够在强力杀死癌细胞的同时确保不伤害正常细胞。
在肿瘤基因治疗中，自杀基因疗法近年来也显示出较好的应用前景。该法采用药 物敏感基因(即自杀基因)转染肿瘤细胞，以提高肿瘤细胞对无毒的前体药物的敏感性，从 而达到杀伤肿瘤细胞的目的。至今已发现多个自杀基因，其中研究最多的是胸腺嘧啶核苷 激酶(TK)基因。目前用于基因治疗的TK基因为病毒TK基因，包括单纯疱疹病毒I型胸苷 激酶(HSV1-TK)基因和水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(VZW-TK)基因等，尤以前者应用最多。 HSV1-TK基因转录部分约1300个核苷酸，蛋白质编码区为1128个核苷酸，编码376个密码 子，基因中无内含子，其转录起始部(Mrna5p端)有107个核苷酸的非翻译区。用于HSV-TK 基因疗法的前体药物包括丙氧鸟苷(GCV)和无环鸟苷(ACV)等，其中GCV对HSV-TK转基因 瘤细胞的抑制作用比ACV强10倍，为目前HSV-TK基因疗法中最常用的前体药物。GCV和ACV 本身对细胞无毒害作用，TK可以将其磷酸化为二磷酸核苷，后者在细胞内激酶作用下形成 三磷酸核苷，三磷酸核苷具有强烈的细胞毒性，能抑制DNA聚合酶活性或作为DNA链延伸的 终止子阻止DNA合成，最终导致细胞死亡。这种独特的自杀效应能选择性地杀死肿瘤细胞 而保护正常细胞，从而避免了传统肿瘤治疗方法对人体带来的伤害。此外，研究还表明，转 导了自杀基因的肿瘤细胞在给予前体药物后被杀死，其相邻或更远的未被转染的肿瘤细胞 也可被杀死，这种作用被称为旁观者效应。旁观者效应明显扩大了自杀基因的细胞杀伤范围，显示了其对于肿瘤治疗的独特优势，并大大克服了自杀基因转染率的限制。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒，有效 结合自杀基因和溶瘤病毒的特性，转染效率高，稳定性好，肿瘤治疗谱广；目的之二在于提 供所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒的制备方法；目的之三在于提供所述HSV1-TK基因重 组溶瘤腺病毒的应用。 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案 1、 HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒，该重组溶瘤腺病毒基因组中由上游至下游依次 包含启动子、腺病毒E1区基因和HSV1-TK全长编码基因。
进一步，所述腺病毒El区基因为E1A全长编码基因；
进一步，所述启动子为CMV启动子。 2、所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒的制备方法，包括以下步骤 a、克隆两端分别带有Not I酶切位点和Xholl酶切位点的HSV1-TK全长编码基
因； b、克隆两端分别带有Xba I酶切位点和Sal I酶切位点的E1A全长编码基因；
c、将两端分别带有Xba I酶切位点和Sal I酶切位点的E1A全长编码基因用Xba I和Sal I双酶切后，插入经相同限制性内切酶处理的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中， 得重组质粒pAdTrack-CMV-ElA ;再将两端分别带有Notl酶切位点和Xhol I酶切位点的 HSVl-TK全长编码基因用Not I和XholI双酶切后，插入经相同限制性内切酶处理的重组质 粒pAdTrack-CMV-ElA中，得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-ElA-TK ;
d、将重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-ElA-TK与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转 染人胚胎肾293细胞进行细胞内同源重组，待出现明显细胞病变效应时收集细胞，反复冻 融使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得HSV1-TK基因重组溶瘤腺病 毒。 进一步，步骤a的具体方法为以HSV1基因组DNA为模板，以5' -tagcggcc-gcat ggcttcgtacccctgccatc-3' 和5' _gcctcgaggttagcctcccccatctc_3' 为上下游弓l物，PCR 扩增HSV1-TK全长编码基因，PCR循环条件参数为94t:预变性5分钟，然后94。C变性60 秒，56t:退火90秒，72t:延伸75秒，共35个循环，最后72。C延伸20分钟；
进一步，步骤b的具体方法为以含有E1A全长编码基因的pXCl质粒为模板，以 5， -gctctagaaccatgagacatattatc-3，和5， -gcgtcgacttatggcctggggcg-3，为上下游弓l物， PCR扩增E1A全长编码基因，PCR循环条件参数为94t:预变性5分钟，然后94。C变性1分 钟，56。C退火1分钟，72t:延伸4分钟，共30个循环。 3、所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。 本发明的有益效果在于本发明的HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒，有效结合自杀
基因和溶瘤病毒的特性，使溶瘤病毒局限在肿瘤细胞中高效复制，同时HSV1-TK基因的表
达产物将无毒的前体药物转变为细胞毒性物质，导致肿瘤细胞"自杀"，而正常组织细胞由
于溶瘤病毒不能复制表达HSV1-TK基因，不能将无毒的前体药物转变为细胞毒性物质，从
而避免损伤；该重组溶瘤腺病毒还具有转染效率高，稳定性好，肿瘤治疗谱广，制备方法简
4单等优点，可用于制备抗肿瘤药物，在肿瘤基因治疗领域有着良好的开发应用前景。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中 图1为HSV1-TK全长编码基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为E1A全长编码基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为MTT法测定细胞存活率；
图4为两组小鼠肿瘤生长曲线图；
图5为两组小鼠生存率图。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
—、 HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒的制备
1、构建HSV1-TK基因重组表达载体 将单纯疱疹病毒I (HSV1)用LB液体培养基在温度为37°C 、振摇速度为250r/min 的条件下培养过夜，用基因组DNA分离纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公司)提取基 因组DNA，按照试剂盒说明书操作。 根据Genbank登录号为AF303108. 1的HSV1-TK基因序列设计并合成如下引物F 1:5' -tagcggccgcatggcttcgtacccctgccatc-3'(下划线部分为Not I酶切位点，SEQ ID No.l);Rl:5' -gcctcgaggttagcctcccccatctc-3'(下划线部分为Xhol I酶切位点，SEQ ID No.2)。 以HSV1基因组DNA为模板，以Fl和Rl为上下游引物，PCR扩增HSV1-TK全长编 码基因，PCR体系为50iU，循环条件参数为94t:预变性5分钟，然后94t:变性60秒，56t: 退火90秒，72t:延伸75秒，共35个循环，最后72"C延伸20分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶 电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pGEM-T质粒在T4DNA连接酶的作用下连接， 连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提 取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pGEM-T-TK。 琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约1100bp处呈单一特异性条带(图1)，与 目的片段大小相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列(SEQ IDNo.3)与GenBank 登录号为AF303108. 1的HSV1-TK全长编码基因序列一致。
2、构建E1A基因重组表达载体 根据Genbank登录号为NC 001460. 1的E1A基因序列设计并合成如下引物F2 : 5， _gci￡i^g^accatgagacatattatc_3，(下划线部分为Xba I酶切位点，SEQ IDNo. 4) ;R2 : 5' -gcgtcgacttatggcctggggcg-3，(下划线部分为Sal I酶切位点，SEQID No. 5)。
以含有E1A全长编码基因的pXCl质粒为模板，以F2和R2为上下游引物，PCR扩 增E1A全长编码基因，PCR体系为50 ii l，循环条件参数为94t:预变性5分钟，然后94。C变性1分钟，56t:退火1分钟，72t:延伸4分钟，共30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴 定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，用限制性内切酶Xbal和Sal I双酶切，双酶切产物经 凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经XbaI和Sal I双酶切的pDC315质粒连接，连接 产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质 粒，Xba I和Sal I双酶切鉴定和测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pAdSU。
琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约800bp处呈单一特异性条带(图2)，与目 的片段大小相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列(SEQ IDNo.6)与GenBank登 录号为NC 001460. 1的EIA全长编码基因序列一致。
3、构建HSV1-TK基因重组腺病毒穿梭质粒 将pAdSU质粒用Xba I和Sal I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯 化后，与同样经Xba I和Sal I双酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV连接，连接产物转 化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，Xba I和Sal I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pAdTrack-CMV-ElA ;再将pGEM-T-TK质粒用 Not I和Xhol I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经Not I和 Xhol I双酶切的pAdTrack-CMV-ElA质粒连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞， 用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，Not I和Xhol I双酶切鉴定，将阳 性克隆质粒命名为pAdTrack-CMV-ElA-TK。
4、制备HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒 将人胚胎肾293细胞以40% 60%的细胞密度接种至T-25培养瓶中，待 细胞生长至30% 50%融合时弃去培养液，采用脂质体法将重组腺病毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV-ElA-TK与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转染293细胞，进行胞内同源重组，通过 显微镜观察细胞病理改变，待出现明显细胞病变效应时离心收集细胞，用PBS重悬，反复冻 融4次使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得HSV1-TK基因重组溶瘤 腺病毒原液；将病毒原液重新感染293细胞以扩增病毒，收集含病毒的上清液，用氯化铯梯 度超速离心法纯化，4t:透析过夜，测定病毒滴度，-7(TC保存备用。
二、 HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用检测
1、体外抗肿瘤作用 MTT法测定细胞存活率分别将人肝癌细胞H印G2和美洲绿猴肾细胞C0S-7接种 于96孔板，培养24小时后，将HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒按感染复数(M0I)为100感染 细胞，同时设置相应对照组(用PBS替代HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒)，感染4天后，每孔 加入浓度为50mg/ml的MTT (用PBS配制)20 y 1， 37"培养4小时，弃去含MTT的培养液，加 入酸化异丙醇100 y 1，充分溶解后，在酶标仪上测定波长595nm处的吸光度A值，按下述公 式计算细胞存活率细胞存活率=A样。。。/A柳g X 100%。 结果见图3，经HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒处理的肿瘤细胞H印G2的存活率明显 下降，平均存活率为24% ;而经HSVl-TK基因重组溶瘤腺病毒处理的正常细胞C0S-7的存 活率未见明显变化，平均存活率为78%。
2、体内抗肿瘤作用 将1 X 105个H印G2细胞接种于裸鼠皮下建立荷瘤裸鼠，将荷瘤裸鼠随机分为两 组对照组和实验组，对照组尾静脉注射PBS，实验组尾静脉注射HSV1-TK基因重组溶瘤腺
6病毒，观察60天内两组小鼠的生存率和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。 结果两组小鼠肿瘤生长曲线见图4，第30天时，对照组小鼠肿瘤体积达到
5000mm 而实验组小鼠肿瘤生长缓慢，肿瘤体积仅为2000mm3 ;两组小鼠生存率见图5，对照
组小鼠于30天内全部死亡，而实验组小鼠60天的生存率为50% ;说明本发明的HSV1-TK基
因重组溶瘤腺病毒能够有效抑制肿瘤细胞的生长，同时能够延长荷瘤裸鼠的平均生存期并
提高平均生存率。 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参
照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可
以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明
的精神和范围。 序列表 〈110〉中国人民解放军第三军医大学 〈120>HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒及其制备方法和应用 〈160>6 〈210>1 〈211>32 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉引物F1 〈400〉 1 tagcggccgc atggcttcgt acccctgcca tc 32 〈210>2 〈211>26 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉引物R1 〈400>2 gcctcgaggt tagcctcccc catctc 26
〈210>3
〈211>1131
〈212>DNA 〈213>单纯疱疹病毒I (Herpessimplexvirus-1)
〈400>3 atggcttcgt acccctgcca tcaacacgcg tctgcgttcg accaggctgc gcgttctcgc 60
ggccategca accgacgtec ggcgttgcgc cctcgccggc agcaagaagc cacggaagtc 120
cgcctggagc agaaaatgcc cacgctectg cgggtttete tegacggtcc tcacgggatg 180
gggaaaacca ccaccacgca actgctggtg gccctgggt tcgcgcgacga tetcgtctec 240
7gtacccgagccgatgacttectggcaggtg ctgggggctt ccgagacaat cgcgaacatc300tecacc3C3caacaccgcctcg3cc3gggt g卿tetcgg ccggggEicgc ggcggtggte360atgac朋gcgcccagateacaatgggcatg ccttetgccg tgaccgacgc cgttctggct420cctcatetcggggggg郷ctgggagctca catgccccgc ccccggccct caccctcatc■ttcgaccgccatcccatcgccgccctcctg tgctecccgg ccgcgcgate ccttetgggc540agcatgaccccccaggccgtgctggcgttc gtggccctca tcccgccgac cttgcccggc6003C3朋C3tCgtgttgggggcccttccggag gacagacaca tcgaccgcct ggccaaacgc660cagcgccccggcgagcggcttgacctggct atgctggccg cgattcgccg cgtttecggg720ctgcttgccaatecggtgcggtetctgC3g ggCggCgggt CgtggCgggEl gg￡lttgggg￡l780cagctttcggggacggccgtgccgccccag ggtgccgagc cccagagcaa cgcgggccca840cgaccccatetcggggacacgttetttecc ctgtttcggg cccccgagtt gctggccccc■朋cggcgacctgteteacgtgtttgcctgg gccttggacg tcttggccaa acgcctccgt960cccatgcacgtctttatcctggattecgac caatcgcccg ccggctgccg ggacgccctg1020ctgcaacttecctccgggatggtccagacc cacgtcacca cccccggctc cateccgacg1080atctgcgacctggcgcgcacgtttgcccgg gg3gtggggg郷Ct雄tg 31131〈210>4〈211>26〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物F2〈400>4gctctegaacC3tg3g3C3tattetc26〈210>5〈211>23〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物Rl〈400>5gcgtcgacttatggcctggggcg23〈210>6 [o川]〈211>801 〈212>DNA〈213>腺病毒(adenovirus)〈400>6atgag朋ctg 3朋tgactcccttggtcctg tcgtetcagg aagctgacga catettggag60catttggtgg acaactttttteacgaggte cccagtgatg atgatcttte tgttccgtct120ctttecgaactgtetgatcttgatgtggag tctgccggtg aagateatea tgaacaggcg180
8
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HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒，其特征在于该重组溶瘤腺病毒基因组中由上游至下游依次包含启动子、腺病毒E1区基因和HSV1-TK全长编码基因。
2. 根据权利要求1所述的HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述腺病毒El 区基因为EIA全长编码基因。
3. 根据权利要求1所述的HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒，其特征在于所述启动子为 CMV启动子。
4. 权利要求1所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒的制备方法，其特征在于包括以下 步骤a、 克隆两端分别带有Not I酶切位点和Xhol I酶切位点的HSV1-TK全长编码基因；b、 克隆两端分别带有Xba I酶切位点和Sal I酶切位点的EIA全长编码基因；c、 将两端分别带有Xba I酶切位点和Sal I酶切位点的EIA全长编码基因用Xba I 和Sal I双酶切后，插入经相同限制性内切酶处理的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中， 得重组质粒pAdTrack-CMV-ElA ;再将两端分别带有Notl酶切位点和Xhol I酶切位点的 HSVl-TK全长编码基因用Not I和Xhol I双酶切后，插入经相同限制性内切酶处理的重组 质粒pAdTrack-CMV-ElA中，得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-ElA-TK ;d、 将重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-ElA-TK与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转染人 胚胎肾293细胞进行细胞内同源重组，待出现明显细胞病变效应时收集细胞，反复冻融使 细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒。
5. 根据权利要求4所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒的制备方法，其特征在于步骤 a的具体方法为以HSV1基因组DNA为模板，以5' -tagcggcc-gcatggcttcgtacccctgccatc -3'和5' -gcctcgaggttagcctcccccatctc-3'为上下游引物，PCR扩增HSV1-TK全长编码 基因，PCR循环条件参数为94t:预变性5分钟，然后94t:变性60秒，56。C退火90秒，72°C 延伸75秒，共35个循环，最后72t:延伸20分钟。
6. 根据权利要求4所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒的制备方法，其特征 在于步骤b的具体方法为以含有E1A全长编码基因的pXCl质粒为模板，以 5， -gctctagaaccatgagacatattatc-3，和5， -gcgtcgacttatggcctggggcg-3，为上下游弓l物， PCR扩增E1A全长编码基因，PCR循环条件参数为94t:预变性5分钟，然后94。C变性1分 钟，56。C退火1分钟，72t:延伸4分钟，共30个循环。
7. 权利要求1所述HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种HSV1-TK基因重组溶瘤腺病毒及其制备方法和应用，该重组溶瘤腺病毒基因组中由上游至下游依次包含启动子、腺病毒E1区基因和HSV1-TK全长编码基因；该重组溶瘤腺病毒有效结合自杀基因和溶瘤病毒的特性，使溶瘤病毒局限在肿瘤细胞中高效复制，同时HSV1-TK基因的表达产物将无毒的前体药物转变为细胞毒性物质，导致肿瘤细胞“自杀”；该重组溶瘤腺病毒还具有转染效率高，稳定性好，肿瘤治疗谱广，制备方法简单等优点，可用于制备抗肿瘤药物，在肿瘤基因治疗领域有着良好的开发应用前景。
文档编号A61P35/00GK101768576SQ20101004200
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月4日 优先权日2010年1月4日
发明者吴玉章, 杨曌 申请人:中国人民解放军第三军医大学