专利名称：以连接后筛选为基础的定向基因重组技术的制作方法
技术领域：
本发明是生物技术领域的一种新型定向基因重组方法。目的基因首先以非定向方式与相 应重组载体连接，之后对错误连接形成的特定选择位点进行连接后处理，使错误连接的目的 基因难以进入宿主细胞或者进入宿主细胞后难以复制。本方法可用于实验室小规模的普通科 学研究，更适合于批量蛋白质的生产或筛选，尤其在生物信息学研究中具有很高的应用价值。
背景技术：
自上世纪70年代PCR技术和限制性内切酶发现以来，基因重组技术己经形成了一套完善 的体系，其中主要包括目的基因的分离，目的基因和重组载体的限制性切割，目的基因与重 组载体的定向连接，宿主细胞的转化，阳性克隆的筛选等。目的基因和载体的连接有正向和 反向两种方式，只有正向连接的基因才能够得到正确的表达，因此建立在双酶切基础上的定 向连接是传统重组技术的核心。
目的基因和载体的切割和连接是基因重组过程中操作最为繁琐，工作周期最长，并且失 败几率最高的步骤。目前国内外很多生物技术公司陆续都开发出了用于简化操作的试剂盒产 品，比如凝胶回收试剂盒，PCR片段回收试剂盒，酶切片段回收试剂盒，快速连接试剂盒等， 但仍然难以避免操作过程中基因片段的丢失。因此寻找更为简单的方法是必然的选择。
目前人们对定向重组技术的改造主要是通过以下两种方式实现的
1、 模拟自然条件下生物基因重组的原理。比如Clontech公司以同源重组为基础的 In-fusion系统，Invitrogen公司以位点特异性重组为基础的Gateway系统，F. A.斯图尔特等 的专利技术一一应用同源重组克隆和亚克隆的方法和组合物(专利申请号00812739. 5)等。 自然重组技术不需要用户对目的基因进行切割和连接，只要将载体、目的基因和重组体系混 合在一起处理适当的时间即可转化宿主细胞。但是，自然重组技术需要载体末端和目的基因 末端之间存在20 40bp同源序列，需要特殊的重组酶系，极大的提高了基因重组的操作成本。 而且同源重组是一个动态的双向过程，重组成功率一般不会太高，并不适合在普通实验室常 规使用。
2、 以体内连接方式实现定向重组。比如NEB公司在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)基础上
建立的的USER Friendly系统等，以及马立新等申请的两项专利技术---种零背景高通量
定向表达克隆的方法(专利申请号01133158.1)和一种高通量直接定向克隆构建重组腺病毒 的方法(专利申请号200410060972.6)等。体内连接一般需要目的基因和载体之间具有4 12bp的互补序列，上述方法就是通过不同的方式在载体和目的基因之间建立这样一个互补序 列。前者需要合成特殊的引物，而且需要特定的工具酶，工作成本较高；后者利用了一种常 规的工具酶，对引物序列的要求相对较低，是一种值得推广的方法。但是上述体内重组技术 要求载体必须具备一段游离单链序列，在反复冻溶过程中这些游离序列很容易出现碱基脱落， 影响连接效率，不适合长期应用，难以商品化生产。
3上述技术分别从不同的角度发展了重组技术，但是受到技术本身的缺陷所导致的成本过 高或者连接效率过低等因素的影响，并不能替代既往传统的重组技术进行常规应用。
以往在目的基因的克隆扩增阶段，对目的基因进入载体的方向没有特定的要求，可以通 过非定向重组的方式连入载体。比如以Taq酶为基础的扩增产物可以直接连接进入TA克隆载 体，目前很对生物公司也推出了相关的重组试剂盒。另外用其他耐热DNA聚合酶扩增得到的 平滑末端扩增产物，同样可以直接连接到平末端载体中，不需要互补序列。随着连接酶技术 的进步，TA克隆和平末端连接基因克服了连接困难的问题，NEB和Takara等生物公司推出的 连接试剂盒在5 10分钟即可完成操作，目前上述技术已经在大部分实验室应用。
本发明在传统非定向重组的基础上引入连接后筛选过程，通过限制性内切酶对反向连接 产物形成的特异性选择位点进行加工，使反向连接的重组产物丧失进入宿主细胞或者进入细 胞后难以克隆扩增的能力，从而达到定向连接的目的。
发明内容
技术方案一
1、 制备线性重组载体
1) 提取质粒、粘粒、噬菌体或者病毒载体，首选质粒载体。
2) 以一种或者两种限制性内切酶对载体进行切割制作连接位点，首选双酶切，限制性内 切酶酶切产物可以为黏性末端，也可以为平滑末端，首选平滑末端。
3) 对载体进行削平、补平形成半选择位点，首选补平
4) 对载体进行或者不进行脱磷酸化修饰，首选脱磷酸化处理
*TA克隆载体的获得可以通过特定的限制性内切酶切割获得或者通过平滑末端末端添加 碱基获得，之后同样进行脱磷酸化处理。
2、 制备目的基因
1) 合成具有半选择位点的引物其扩增产物在与上述定向载体反向连接后能够形成完整 的限制性内切酶酶切位点，而在正向连接时不形成相应的酶切位点。。
2) 目的基因的扩增按照常规方法扩增目的基因，TA克隆选择T叫DNA聚合酶体系，平滑 末端克隆选择非TaqDNA聚合酶体系。
3) 目的基肉鉴定通过常规琼脂糖电泳鉴定。
4) 目的基因精制如果鉴定发现目的基因存在非特异性扩增，需要对目的基因进行纯化。
3、 定向连接 第一种方式
1) 将目的基因和重组载体按照数量3: 1左右的比例混合
2) 加入适当的连接酶体系完成连接反应。3)高温灭活连接酶后，加入核酸内切酶体系进行切割筛选，
第二种方式
连接和切割反应在同一个体系中进行，首先以连接最适温度完成连接反应，然后在酶切最 适温度完成切割筛选。反应也可在同一温度下进行，不过优选前者。
第三种方式
连接产物转入具有修饰酶表达活性的宿主细胞，在宿主细胞内利用天然或者诱导产生的限 制性核酸内切酶完成切割筛选。
技术方案二
1、 在常规重组载体中，引入两个不存在交叉识别的平滑末端限制性内切酶的酶切位点，或者 引入两个不存在交叉识别的残留3' T黏性末端的限制性核酸内切酶的酶切位点，形成定向重 组载体。
2、 在目的基因上游和下游分别引入与载体下游和上游匹配的半选择位点。
3、 目的基因与重组载体混合，加入连接酶，以及相应的两种限制性核酸内切酶进行定向连接。 首先在酶切最适温度下对载体进行切割，之后在连接最适温度下进行非定向连接，最后在酶 切最适温度下进行切割筛选。反应也可以在同一温度条件进行，优选前者。
本发明是在原有重组技术基础上进行的操作方法改进，使用者无须改变原有的操作习惯， 容易适应。操作步骤简单，线性片段和定向重组酶系可商品化生产，用户通过基因扩增后一 般可直接进行定向连接。操作周期短，包含PCR过程在内， 一般在一个工作R内可完成全部 操作。该技术所使用的工具酶为常用工具酶，市场售价较低，而且体系所需要的引物要比常 规引物短1/4到1/3，实验综合成本可降低50% 60% 。
具体实施例方式
下面以几丁质酶基因作为目的基因，定向克隆进入pUC19或pUC18载体为例对技术进行 具体说明.实验过程中选用的工具酶和核酸提取试剂盒试剂盒分别为大连宝生物公司或者北 京天根公司产品，具体操作步骤参见相关公司的产品说明.用户也可以选择其他公司产品代 替.
pUC19的多克隆位点如下5' _<T6Qg GTCGACTCTAGAG "紅一3'
pUC18的多克隆位点如下5， — 6^7TC TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGC A^C7T—3'
一种几j '质酶的基因序列为ATGCGCAAATTTAATAAA......AGCGCCGGCGTTCAATAA
具体实施方案一 TA连接定向克隆技术1定向重组载体的制备
反应体系中加入l微克pUC19质粒DNA，适量限制性内切酶Pstl (识别序CTGCAG，切割 后3'端残留4个碱基)和BamH I(识别序列为GGATCC，切割后5'端参与4个游离碱基)， 按照工具酶推荐方式进行双酶切。
1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶回收试剂盒回收线性载体片段
利用核酸外切酶I按照工具酶推荐方案削平单链片段
利用TdT酶按照工具酶推荐方式在3'端引入T碱基
利用CIAP磷酸酶按照工具酶推荐方式进行脱磷酸化处理 2定向目的基丙的克隆
引物设计上游ATGCGCAAATTTAATAAA
下游G C A GTTATTGAACGCCGG *加粗字体部分为半选择位点
基因扩增选用Takara Ex Taq DNA聚合酶,按照试剂盒推荐方式扩增
琼脂糖凝胶电泳，利用琼脂糖凝胶核酸回收试剂盒回收目的基因 3定向连接
取3微升线性载体片段,加入3微升PCR产物混合均匀，加入由T4 DNA连接酶和Pstl组 成的定向连接酶系，室温保存20分钟,37摄氏度保温30分钟。低温保存。
具体实施方案二 TA连接定向克隆 1定向重组载体的制备方式同方案一 2定向目的基因克隆方式同方案一 3非定向连接
取3微升线性载体片段，加入3微升PCR产物混合均匀，加入由T4 DNA连接酶按照推荐方 式连接获得非定向重组质粒. 4转化筛选细胞
转化以pET28a为载体的Pstl表达菌株，在常规抗生素LB筛选平板中加入终浓度约为 0.5% (w/v %)乳糖，诱导限制性内切酶表达，直接对正向连接产物进行克隆化筛选。
具体实施方案二平滑末端定向连接 . 1定向重组载体的制备
反应体系中加入1微克pUC18质粒DNA,用BamH I和Hind III (识别序列为AAGCTT,酶 切后5'端残留4个碱基)按照工具酶操作说明进行双酶切W琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶核酸回收试剂盒回收线性载体片段
利用Klenow酶按照工具酶操作说明补平单链片段
利用CIAP磷酸酶按照操作说明对载体进行去磷酸化处理
2定向目的基因的克隆
弓I物设计上游T ATGCGCAAATTTAATA 下游C TTTATTGAACGCCGG *加粗字体部分为半选择位点 基因扩增选用Takara pyrobest DNA聚合酶按照试剂盒推荐方式扩增. 琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶核酸回收试剂盒回收目的基因 3定向连接
取3微升线性载体片段，加入3微升PCR产物混合均匀，加入由T4 DNA连接酶，BamH I 和Hind 111组成的定向连接酶系,室温保存20分钟,37摄氏度保温30分钟。低温保存。
具体实施方案4简化克隆技术 1定向重组载体的制备
在pUC18质粒BamH I和Hind III酶切位点之间引入下列基因片段(斜体加粗部分分别 为平滑末端DNA连接酶EcoR V和HaeIII的酶切位点)，扩增后保存备用。
引入片段g扁7T—TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGC 一gftX1
引入后状态GGATCC g超7T—TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGC—縱(7 AAGCTT
2目的基因克隆
弓I物设计上游C C ATGCGCAAATTTAATA
下游A T C TTTATTGAACGCCGG
*加粗字体部分为半选择位点
基因扩增选用Takara pyrobest DNA聚合酶按照试剂盒推荐方式扩增.
琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶核酸回收试剂盒回收目的基因
3定向连接
取3微升环状载体，加入3微升PCR产物混合均匀，加入由T4 DNA连接酶，EcoR V, HaeIII 三种工具酶共同组成的定向连接酶系,37摄氏度保温1小时，室温保存20分钟,37度保温30 分钟。低温保存。
权利要求
1本发明涉及生物技术领域一种新的定性基因重组技术，由定向重组载体，定向目的基因和定向连接复合物构成。
2.根据权利要求1所述的定向基因重组技术，其特征是两种定向重组载体均来源于质粒， 粘粒，噬菌体或者病毒载体。其中一种定向重组载体具有能够与目的基因相连接的粘性末端 或者平滑末端，其中一侧或者两侧末端含有半酶切位点，与目的基因反向连接后能够形成一 个或者两个完整的酶切位点。另外一种定向重组载体含有一个或者两个酶切位点，在经过相 应限制性内切酶切割后能够与反向连接的目的基因组成完整的限制性核酸内切酶酶切位点。
3.根据权利要求1所述的定向基因重组技术，其特征是定向目的基因为PCR产物或者限制 性核酸内切酶切割后的产物。定向目的基因两侧含有一个或者两个半酶切位点，能够与定向 重组载体进行正向或者反向连接。反向连接时两个连接点形成一个或者两个完整的限制性核 酸内切酶内切酶酶切位点，在正向连接时两个连接点不能形成相应的限制性核酸内切酶酶切 位点。
4.根据权利要求1所述的定向基因重组技术，其特征是定向连接复合物由DNA连接酶和限 制性核酸内切酶联合构成。其中限制性内切酶能够特异性识别权利要求(2) (3)中所述的反 向连接时形成的完整酶切位点并进行切割破坏，而对正向连接产物不能识别其连接点，对其 不能构成破坏。定向连接复合物可以是两类工具酶同时参与反应形成的混合物，也可以是先 使用连接酶，后使用限制性核酸内切酶形成的功能上的复合物；其中限制性核酸内切酶也可 以该工具酶本身，也可以是该工具酶的表达菌株。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域一种新的基因重组技术。在传统的非定向基因重组技术基础上，定向重组载体和反向连接的定向目的基因之间形成的新的酶切位点，而正向连接的目的基因和定向重组载体之间不能形成相应的酶切位点。利用相应的限制性核酸内切酶对错误连接形成的酶切位点进行处理，使反向连接的目的基因难以进入宿主细胞或者进入细胞后难以克隆扩增，从而达到定向克隆的目的。该技术是在传统技术基础上进行的改造，具有技术简单，周期短，费用低，操作简单等优点，适合实验室表达研究和大规模的基因表达操作。
文档编号C12N15/11GK101544973SQ20081010290
公开日2009年9月30日 申请日期2008年3月28日 优先权日2008年3月28日
发明者张永钢 申请人:张永钢