具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及溶瘤腺病毒领域，具体地指一种具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复 性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用。
【背景技术】
[0002] 溶瘤腺病毒能特异性识别肿瘤细胞并具有肿瘤细胞内自我复制能力。其能通过大 量复制直接溶瘤，诱导肿瘤细胞发生凋亡、自噬、坏死，以及触发机体抗肿瘤免疫等多种机 制发挥抗肿瘤效应，近年来得到了越来越广泛地关注。2005年，我国SFDA批准了世界上第 一个溶瘤腺病毒HlOl用于鼻咽癌患者的治疗，成为全球首个获批上市的重组溶瘤腺病毒 产品。目前溶瘤腺病毒或携带抗癌基因的溶瘤腺病毒产品更多的正在进行临床前和临床试 验，其中包括 0NYX-015、SG500、ZD55-TRAIL 和 ZD55-IL-24 等。
[0003] 目前，重组溶瘤腺病毒主要有这样几种方式：
[0004] 1、剔除腺病毒在正常细胞中复制所必须而在肿瘤细胞中不需要的部分。如去除 ElA或ElB的腺病毒只能在Rb或p53信号通路异常的肿瘤细胞内才能增殖，目前已构建对 应的载体delta24和ZD55,并携带抗癌基因取得较好研宄效果。
[0005] 2、利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制必须的基因。如利用hTERT启动子替换 ElA使得外源基因的表达具有肿瘤细胞特异性。
[0006] 3、修饰腺病毒衣壳蛋白，使其表达特异识别肿瘤表面受体的配体蛋白，增强肿瘤 细胞对其特异性识别能力，并增强感染效率。
[0007] 尽管目前溶瘤腺病毒在体外杀伤肿瘤细胞及体内动物肿瘤抑制实验中均取得了 较好的抗肿瘤效应，但多数尚在临床试验中，并未进入临床。宄其原因，主要在于以下两 占 .
[0008] 1.溶瘤腺病毒存在较高的免疫原性，容易被人体免疫系统识别而清除达不到抗癌 效果。研宄表明，去除病毒基因组E3区可以有效降低腺病毒的免疫原性，保护腺病毒感染 的肿瘤细胞在病毒大量复制前不提前被T细胞识别清除，从而提高了病毒的感染效率。
[0009] 2.肿瘤细胞耐药耐病毒性，由于肿瘤细胞生长迅速，原始组织功能丧失，细胞内易 发生变异，导致单一肿瘤杀伤作用无法彻底杀灭肿瘤细胞，从而导致癌症复发。研宄表明， 经病毒杀伤后，部分残存的肿瘤细胞可通过上调PLSR1/STING/IR3等信号通路抑制病毒复 制及杀伤作用。解决办法之一是，利用病毒本身即是一种有效地基因载体，携带外源抑癌基 因或癌基因干扰序列，修复肿瘤细胞基因变异，抑制肿瘤细胞生长及诱发死亡，有效协同病 毒自身杀伤作用，在耐病毒性突变出现前，彻底杀灭癌细胞。
【发明内容】
[0010] 本发明所要解决的技术问题就是提供一种具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复 性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明提供的一种具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性 的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16,所述重组溶瘤腺病毒Ad5-P16全基因组是由P16⑶S基因替换 原溶瘤腺病毒Ad5全基因组上的固有基因 E3gp-19K得到。
[0012] 进一步地，所述P16⑶S基因序列如SEQ ID No. 1所示。
[0013] 本发明还提供了一种含有高效表达抗癌基因 P16的重组溶瘤腺病毒Ad5_P16的构 建方法，包括以下步骤：
[0014] 1)以pCMV pl6INK4A为模板，设计含有酶切位点和保护碱基的引物上下游引物PF 和PR，
[0015] PF :ctgatatgcatggagccggcggcggggag，
[0016] PR ：gccgcggccgctcaatcggggatgtctgagg ；
[0017] 2)经 PCR 得到 P16CDS 序列
[0018] PCR条件为：预变性95°C 5分钟，变性95°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循环34次，最后延伸72°C 10分钟；
[0019] 3)将PCR产物连接入TA载体，挑选单克隆，并鉴定出阳性克隆子；
[0020] 4)然后在E3gp-19K上游启动子U6前方设计上游引物Pl和E3gp-19K编码区终止 密码子后方设计下游引物P6,分别为：
[0021] Pl:cggaagcttacgtaccggtccaatccgtc，
[0022] P6 ：ggcgaattcaggtcgtaaacgtccacacgt ；
[0023] 并以Ad5腺病毒全基因组为模板，进行PCR ;
[0024] PCR条件为：预变性95°C 5分钟，变性95°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循环34次，最后延伸72°C 10分钟；
[0025] 得到含有E3gp-19K序列的PCR产物；将PCR产物和pUC18载体进行双酶切， 连接后并转化大肠杆菌，挑选单克隆后进行酶切与测序鉴定，得到阳性克隆，即构建为 pUC18-E3gp-19K ；
[0026] 5)在E3gp_19K编码区初始密码子前方设计下游以snal酶切位点及其保护碱基为 5 '末端的正向引物 P2 :ctgatatgcatatggacacaaggatgacga，
[0027] 及其反相互补引物 P3 :tcgtcatccttgtgtccatatgcatatcag ;
[0028] 在E3gp-19K编码区终止密码子后方设计下游以notl酶切位点及其保护碱基为5' 末端的正向 P5 引物：gccgcggccgcggggcggaattcgttat，
[0029] 及其反向互补引物 P4 :ataacgaattccgccccgcggccgcggc ;
[0030] 6)以 pUC18-E3gp-19K 为模板，P1、P2 为上下游引物，PCR 得到以 Hindlll/snal 为 首尾的含有E3gp-19K启动子增强子区域序列的DNA产物；
[0031] PCR条件为：预变性95°C 5分钟，变性95°C 30秒，退火55°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循环34次，最后延伸72°C 10分钟；
[0032] 7)以pUC18-E3gp-19K为模板，P3、P4为上下游引物，PCR得到以snal/notl为首 尾的含有E3gp-19K编码区序列的DNA产物；
[0033] PCR条件为：预变性95°C 5分钟，变性95°C 30秒，退火60°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循环34次，最后延伸72°C 10分钟；
[0034] 8)以pUC18-E3gp-19K为模板，P5、P6为上下游引物，PCR得到以notl/EcoRI为首 尾的含有E3gp-19K编码后方3 '无义区的DNA产物；
[0035] PCR条件为：预变性95°C 5分钟，变性95°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 30 秒，循环34次，最后延伸72°C 10分钟；
[0036] 9)将上述3种DNA产物分别以各自首尾酶切位点的内切酶进行双酶切，并将 pUC18-E3gp-19K以HindIII及EcoRI进行双酶切并回收pUC18载体，经回收共得到4段两 端均为粘性末端的DNA片段；
[0037] 10)以连接酶将这4段DNA以Hindlll/snal/notl/EcRI的顺序连接成环，转入大 肠杆菌并挑选单克隆，经过酶切鉴定及测序鉴定得到阳性克隆，即为导入有snal/notl酶 切位点的pUC18-E3gp-19K新序列；
[0038] 11)将P16CDS序列的PCR产物及导入snal/notl酶切位点的pUC18-E3gp-19K新 序列用snal以及notl双酶切；
[0039] 12)连接酶连接，并转入大肠杆菌，经单克隆筛选、酶切与测序鉴定，阳性克隆即为 含有E3gp-19K启动增强子及P16CDS序列的pUC18-P16 ;
[0040] 13)将Ad5溶瘤腺病毒及上面得到的pUC18-P16用Pmel酶切，并于BJ5183细胞 内进行同源重组，挑选单克隆，经酶切与测序鉴定得到鉴定为阳性的克隆，即为高效表达人 P16基因的重组人溶瘤腺病毒Ad5-P16。
[0041] 本发明还提供了一种具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒 Ad5-P16在肿瘤细胞内能特异性增殖并杀伤肿瘤细胞及其抗肿瘤的中应用。
[0042] 本发明的原理
[0043] 1)溶瘤腺病毒除了自身可以通过特