用溶瘤病毒和免疫刺激剂治疗以增强体内免疫系统对肿瘤的识别的制作方法

专利名称：用溶瘤病毒和免疫刺激剂治疗以增强体内免疫系统对肿瘤的识别的制作方法
技术领域：
本发明涉及在哺乳动物中使用溶瘤病毒(oncolytic viruses )和免疫
刺激剂治疗增殖紊乱的方法。
背景技术：
仅在美国每年就有超过一百万的人被诊断患有癌症。尽管在医学研 究上有许多进展，但是癌症在美国仍然是第二位主要的死亡原因。在工 业化国家中，大约在五个人中就有一个人死于癌症。在探索新策略的过 程中，溶瘤病毒疗法最近作为一种特异性杀死肿瘤细胞的可行方法脱颖 而出。与传统的基因疗法不同，该方法使用由于病毒的复制和伴随其后 的细胞溶解能扩散到整个肺瘤组织的可复制病毒，由此提供一种可供选 择的癌症治疗方法。对病毒进行基因工程改造以选才奪性地复制并杀死癌 细胞。
溶瘤病毒可利用多种作用机制杀死癌细胞，所述机制包括细胞溶 解、细胞凋亡、抗血管生成和细胞坏死。病毒感染肿瘤细胞然后开始复 制。病毒继续复制直到最后"溶解，，(裂解)宿主细胞的膜，肺瘤细胞 不再能含有病毒。肿瘤细胞被摧毁并且新产生的病毒扩散到邻近的癌细 胞继续该循环。值得注意的是所有溶瘤病毒仅在癌细胞中复制，其通过 正常组织时不导致损害，这很重要。因此， 一旦根除所有肿瘤细胞，溶 瘤病毒不再具有复制的能力并且免疫系统将其从体内清除。
在过去的几年中，对病毒细胞毒性分子机理的新认识为设计更有效 的溶瘤病毒提供了科学理论。根据分子生物学中最近的进展设计出几种 遗传修饰的病毒，如在肿瘤细胞中特异性复制并杀死肿瘤细胞的腺病毒 和单纯疱渗病毒。另一方面，具有内在溶瘤能力的病毒治疗性应用也在 评估之中。尽管通常已在临床前研究中证明了溶瘤病毒疗法的效力，但 是在临床试验中该治疗效力仍不是最佳的。因此，可进一步提高条件复 制病毒的溶瘤潜能的策略仍在探索之中。发明概述
尽管认识到向患者施用溶瘤病毒可在患者中引起抗病毒免疫反应， 但是研究的焦点已经集中在如何规避发生这种天然反应上。本发明的另 一个方面涉及利用该天然反应提高对肿瘤的杀伤力。用溶瘤病毒疗法治 疗后，通过向患者施用免疫刺激剂，可提高对肿瘤细胞的杀伤力。不仅 肿瘤细胞易感染溶瘤病毒，而且在其表面表达病毒抗原的、经感染的肿 瘤细胞也可被经过刺激的免疫系统识别并做为"外源物质"受到攻击。 此外，已被溶瘤病毒溶解的肿瘤细胞暴露于免疫系统，因此增加免疫系 统识别肿瘤抗原的机会，在存在免疫刺激剂时尤其如此。
本发明的 一 个方面提供在患肿瘤的哺乳动物中治疗肿瘤的方法，该 方法包括向哺乳动物施用溶瘤病毒和免疫刺激剂。优选地，在施用溶瘤 病毒后施用免疫刺激剂，更优选地在溶瘤病毒已感染肿瘤细胞后。最优 选地，在所感染的肺瘤细胞表达至少一种溶瘤病毒抗原后施用免疫刺激 剂。优选地，免疫刺激剂是合成的寡脱氧核苷酸，如胞嘧啶-磷酸盐-
鸟苷(CpG)。在一个优选的实施方案中，溶瘤病毒是呼肠孤病毒，更 优选地是天然存在的呼肠孤病毒。
在另一个方面，本发明提供在患肿瘤的哺乳动物中提高溶瘤病毒的 抗肿瘤活性的方法，该方法包括除了向哺乳动物施用溶瘤病毒外，还施 用免疫刺激剂。优选地，在施用溶瘤病毒后施用免疫刺激剂。更优选地， 在所感染的胂瘤细胞表达至少一种溶瘤病毒抗原后施用免疫刺激剂。在 一种实施方案中，免疫刺激剂是合成的寡脱氧核苷酸(ODN)，优选地 是未曱基化的胞嘧啶-磷酸-鸟苷(CpG)。
本发明的另一个方面提供在患所述肿瘤的哺乳动物中提高溶瘤病 毒的抗肺瘤活性的方法，所述方法包括(a)将树突细胞与溶瘤病毒接 触，(b)诱导树突细胞呈递溶瘤病毒的抗原，和(c)激发对树突细胞 所呈递的抗原的免疫反应，由此在哺乳动物中引起对溶瘤病毒的免疫反 应。在一个优选的实施方案中，在体内进行步骤(a)。在另一个优选 的实施方案中，先体外后体内地进行步骤(a)并且在与病毒接触后向 哺乳动物施用树突细胞。
本发明的另 一个方面提供提高溶瘤病毒疗法效力的方法，包括向哺 乳动物施用溶瘤病毒并且向所述哺乳动物施用免疫刺激剂。优选地，在 施用溶瘤病毒后，更优选地在溶瘤病毒已感染肿瘤细胞后施用免疫刺激剂。最优选地，在所感染的肿瘤细胞表达至少一种溶瘤病毒抗原后施用
免疫刺激剂。优选地，免疫刺激剂是合成的寡脱氧核苷酸(ODN)，如 胞嘧咬-磷酸-乌苷(CpG)。在优选的实施方案中，溶瘤病毒是呼肠 孤病毒，更优选地是天然存在的呼肠孤病毒。
本发明的又 一 个方面提供增加肿瘤细胞的免疫识别的方法，包括 (a)用溶瘤病毒感染胂瘤细胞和(b)激发对溶瘤病毒的抗原的免疫反 应，其中对溶瘤病毒的免疫反应是对被感染的胂瘤细胞所表达的溶瘤病 毒抗原的反应。优选地通过下列方法引起免疫反应，包括(i)将树突细 胞与溶瘤病毒接触，(ii)诱导树突细胞呈递溶瘤病毒抗原和(iii)激 发对溶瘤病毒的免疫反应。在一个优选的实施方案中，接触发生在体内。 在另一个优选的实施方案中，接触为先体外后体内、并且在接触后向哺 乳动物施用树突细胞。
A.定义
"施用，，意思是本领域技术人员已知的施用药物组合物的标准方法 中的任何一种。实例包括，但不限于肠内、经皮、静脉内、肌内或者腹 腔内施用。向受试者"施用病毒"指以使其接触靶肿瘤细胞的方式向受 试者施用病毒的行为。施用病毒的途径，以及制剂、载体将取决于靶细 胞的位置以及类型。
细胞对病毒感染的"抗性，'表明用该病毒感染细胞不导致显著的病 毒产生或产量。"易感"细胞是表现为诱导为细胞病变效应、病毒蛋白 合成，和/或病毒产生。
"瘤细胞"、"肺瘤细胞，，或"增殖紊乱的细胞"，指异常高速增殖 的细胞。包括肺瘤细胞的新生长是赘生物，也称作"肿瘤"。肿瘤是一 种异常的组织生长，通常形成不同的团块，其通过细胞增殖比正常组织 生长更迅速。肿瘤可能显示部分或完全缺乏组织结构以及与正常组织之 间的功能协调。如这里所使用的，肿瘤旨在包括造血肿瘤以及实体瘤。 肿瘤可能是良性的(良性肿瘤)或恶性的(恶性肿瘤或癌)。可将恶性 肿瘤粗略地分成三种主要类型。将由上皮结构产生的恶性肺瘤称作癌， 将从结締组织如肌肉、软骨、脂肪或骨中产生的恶性肿瘤称作肉瘤，将 影响包括免疫系统组分的造血结构(属于形成血细胞的结构)的恶性肿 瘤称作白血病和淋巴瘤。其它肿瘤包括，但不限于神经纤维瘤病。肿瘤细胞优选地位于哺乳动物内，特别是选自狗、猫、啮齿类、绵羊、山羊、 牛、马、猪、人和非人灵长类的哺乳动物。最优选地，哺乳动物是人。
"溶瘤病毒"是一种优先在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞的病 毒。溶瘤病毒可以是天然存在的病毒或者基因工程改造的病毒。溶瘤病 毒也包括详细描述的呼肠孤病毒之类的免疫保护的和重排列病毒。
"受溶瘤病毒感染"指溶瘤病毒进入细胞并在细胞内复制。类似地， "肿瘤受溶瘤病毒感染"指溶瘤病毒进入肿瘤细胞并在肿瘤细胞内复 制。
"有效量"是足以导致预期效果的免疫刺激剂或呼肠孤病毒的量。 对于用于治疗或改善肿瘤的溶瘤病毒来说，有效量是足以减轻或消除肿 瘤症状，或者足以减緩胂瘤发展的溶瘤病毒的量。
"治疗或减轻肺瘤"意思是减轻或者消除肿瘤的症状，或者减緩肺
瘤的发展。减轻优选地是至少约10%,更优选地至少约20%、 30%、 40 % 、 50 % 、 60 % 、 70 % 、 80 %或90 % 。
可交替地使用术语"核酸，，和"寡核苷酸"以表示包括多个核苦酸 的分子。如这里所使用的，该术语指寡核糖核苷酸以及寡脱氧核糖核苷 酸。该术语也将包括多核苷(即，多核苷酸减去磷酸)以及含有任何其 它有机碱( organic base)的多聚体。核酸包4舌载体,例如，质斗立，以及 寡核苷酸。可从现有的核酸来源中获得核酸分子，但是优选地是合成的 (例如，通过寡核苦酸合成产生)。
"免疫刺激剂"指实质上提高或加强对外源抗原的免疫反应(抗体 和/或细胞介导的)的任何物质。
如这里所使用的"免疫刺激核酸"是含有诱导免疫反应的免疫刺激 基序或主链的任何核酸。免疫反应可表征为，但不限于，Thl型免疫反 应或者Th2型免疫反应。通过活化的免疫细胞所激发的细胞因子和抗体 产生谱定义这种免疫反应。
B..治疗肿瘤的方法
技术领域：
本发明提供在患所述肿瘤的哺乳动物中治疗肿瘤的方法，所述方法 包括向哺乳动物施用溶瘤病毒和免疫刺激剂。以使其能最终接触靶肺瘤 细胞的方式施用溶瘤病毒。溶瘤病毒施用的途径，以及剂型、载体将取 决于耙细胞的位置以及类型。可使用多种施用途径。例如，对于容易到达的实体瘤，可通过直接向肿瘤注射途径施用溶瘤病毒。对于造血肿瘤， 例如，可通过静脉内或血管内途径施用溶瘤病毒。对于在体内不容易到 达的肿瘤，如转移瘤，以可经通过哺乳动物身体的全身途径运输并由此 到达肺瘤的方式(例如，静脉内或肌内)施用溶瘤病毒。可选择地，可 直接地向单个实体瘤施用溶瘤病毒，其后通过身体的全身途径运送到转 移瘤。也可通过皮下、腹膜内、鞘内注射(例如，对于脑肺瘤)、局部 (例如，对于黑色素瘤)、口服(例如，对于口腔或食道胂瘤)、直肠 内(例如，对于结肠直肠肺瘤)、阴道内(例如，对于子宫颈或阴道肿 瘤)、鼻内或通过吸入喷雾(例如，对于肺部胂瘤)途径施用溶瘤病毒。 可以单剂量或多剂量(例如， 一个以上剂量)施用溶瘤病毒。可在 不同位点或者通过不同途径同时或者连续(例如，几天或几周期间)施 用多剂量。优选地在施用免疫抑制剂前施用溶瘤病毒。在本发明的一个 实施方案中， 一次或多次施用病毒/免疫抑制剂的疗程。
溶瘤病毒优选地配制成单剂量型，每个剂量含有约102 pfus-约1013 pfus呼肠孤病毒。术语"单剂量型"指适合作为用于人受试者和其它哺
乳动物的单一剂量在物理上分离的单位，每个单位含有经计算产生期望 治疗效果的预先确定量的溶瘤病毒，其与适当的药物赋形剂联合。
本发明可应用于任何动物受试者，优选地哺乳动物。哺乳动物优选 地选自犬、猫、啮齿类、家畜(如绵羊、山羊、牛、马和猪)、人和非 人灵长类。优选地，哺乳动物是人。
本发明可结合其它肿瘤疗法如化疗、放疗、手术、激素疗法和/或免 疫疗法。
本领域技术人员可使用根据本申请所公开的任何溶瘤病毒和本领 域的公知技术实施本发明。溶瘤病毒可以是粘病毒科(
长尾病毒科(，ZwWr油e ) 、 / 。咖v/,油e 、 "c/W,/'(i"e 、 被盖病毒科 (c'or"covzn'6/"e )、 芽生病毒牙+ ( p/(X mavW(iae )、 月旨毛病毒禾+ (///90f/zr/义vz'nttoe ) 、 ./ks'e〃own'c/fle、 症病毒，牛(jPoxvzrzc/oe )、 虹寿》病毒
矛牛(z'r/dov/nt/"e )、 条DNA病毒牙斗(/ /zyc。c/"av^7't/"g )、斥干^)夫病毒牙牛 (6acw/oWrz't/"e )、疱渗病毒科(/^rp&vv/Wc/ae )、腺病毒科(ac/ewov^油e )、
乳多g病毒科(/ "/wravz〃't/(2e )、 多 DNA病毒科(/ o(y<i"<2vz>^/"e )、
丝状病毒科(/wov/n.dae )、 微小病毒科(脂cTOWr/t/ae )、 双生病毒科 (gewiw/v/n.t/"e )、圆环病毒考牛(c^covz>/<i(2e )、纟田小病毒牙牛(/ arwWnt/ae )、嗜肝DNA病毒科(/ze戶(i"謂W(iae )、 反转录病毒科(r"rovzWt/(3e )、 c少"ovz力d"e、。乎肠孑瓜病毒牙+( reov,W(iae )、又又RNA病毒禾+( /^m<rWn<i<2e )、 副杀占病毒矛牛(/ "rawjo:ovz'n'(i(3e )、 弹:犬病毒矛牛(r/z<36t/oWn'Jae )、 线卄犬 病毒科(/z7ovz'r/6/ae )、 正黏病毒科(oW/z謂jaov/W(iag )、 布尼亚病毒 科(6w"7聰nt/(2e )、沙粒病毒科("re憩Wn'6toe )、轻小病毒科(/eWWr油e )、 小RNA病毒科(/7/com"Wnt/ae )、欧防风黄点病毒科(,訓/r油e )、 紅豆花叶病毒科(ccwov7力't/"e )、 马铃薯Y病毒科(/70(yv/〃't/(2e )、 杯 一大病毒牙牛(ca/^:'/vz'n'(i"e )、 星4夫病毒牙牛(o^rov/n'c/ae ) 、 i若达病毒牙牛 ("。(i謂'n.(iag )、 四病毒科 (/^raW"'tfae )、 番痴丛矮病毒科 (fomZ)wsW厂/(iae )、冠一犬病毒牙牛(con w"Wn'(iae ) 、 g/"WW〃<^2e、才皮月莫病 毒科(/^g"vzWdae )、或者杆状RNA病毒科(6an^v,'nt/"e )中的成员。 呼肠孤病毒是特别优选的溶瘤病毒。呼肠孤病毒是具有双链、节段 RNA基因组的病毒。病毒体直径60 - 80 nm并且拥有两个同心衣壳，其 中的每一个都是二十面的。基因组由具有10-12个分离节段的双链 RNA构成，总的基因组大小为16-27kbp。单个RNA节段大小不同。 人呼肠孤病毒由三种血清型组成l型(Lang抹或TlL) 、 2型(Jones 抹，T2J)和3型(Dearing林或Abney抹，T3D)。三种血清型根据中 和以及血凝抑制试验很容易鉴别(见,例如，Fields, B.N.等，1996 )。
在本发明的另一个实施方案中，溶瘤病毒是减毒的或修饰的腺病 毒。减毒的或修饰的腺病毒可在具有活化的Ras途径的细胞中复制，但 是不能在不具有活化的Ras途径的细胞中复制。腺病毒是约3.6kb的双 链DNA病毒。在人类中，腺病毒可在眼中、呼吸道、胃肠道和泌尿道 内复制并导致疾病。47种已知的人血清型中有大约三分之一是造成绝大 多数人类腺病毒疾病的原因。腺病毒编码几种对抗抗病毒宿主防御机制 的基因产物。腺病毒的病毒相关RNA ( VAI RNA或VA RN^ )是腺病 毒感染后期在细胞质中高浓度累积的小的、结构RNAs。这些VAIRNA 与PKR的双链RNA (dsRNA)结合基序结合并且通过自体磷酸化阻断 PKR的dsRNA依赖的活化。因此，PKR不能起作用并且病毒可在细胞 内复制。病毒体的超量产生最后导致细胞死亡。此处使用的术语"减毒 的腺病毒，，或"修饰的腺病毒"意思是阻止PKR活化的基因产物缺乏、 被抑制或被突变，结果PKR活化不被阻断。优选地，VAIRNA的基因 不被转录。这种减毒的或修饰的腺病毒不能在不具有激活的Ras途径的正常细胞中复制，但是其能感染并在具有激活的Ras途径的细胞中复制。 新城疫病毒(NDV)优先在恶性胂瘤细胞中复制，并且最常使用的 病毒株是73-T(Reichard等，1992; Zorn等，1994; Bar-Eli等,1996)。 PV701是一种新城疫病毒的减毒的，非重组的溶瘤株，其在干扰素介导 的抗病毒反应中根据肺瘤特异性缺陷，相对于正常细胞，选择性溶解胂 瘤细胞。
副痘病毒口疮病毒是一种在包括人在内的不同哺乳动物中诱导急 性皮肤损害的痘病毒。副痘病毒口疮病毒编码在阻断PKR活性中所涉 及的基因OV20.0L。副痘病毒口疮病毒不能在不具有激活的Ras途径的 细胞中复制。在本发明中更优选的溶瘤病毒是"减毒的副痘病毒口瘠病 毒"或者"修饰的副痘病毒口疮病毒"，其中阻止PKR活化的基因产 物缺乏、被抑制或被突变，结果PKR活化不被阻断。优选地，基因 OV20.0L不被转录。这种减毒的或修饰的副痘病毒口疮病毒将不能在不 具有激活的Ras途径的正常细胞中复制，但是能感染并在具有激活的 Ras途径的细胞中复制。
核糖核苷酸还原酶表达缺陷的单纯疱渗病毒1 (HSV-I)突变体 hrR3显示出在结肠癌细胞中复制但不能在正常肝细胞中复制(Yoon等， 2000)。单纯疱渗病毒1型(HSV-I)载体特别有用，因为可对它们进 行基因工程改造以便高度选择性地在肿瘤细胞中复制和传播，并且也可 表达多种外源转基因。这些载体可在多种胂瘤类型中显示致细胞病变效 应，而不破坏正常组织，在胂瘤内提供扩大的基因递送，并且诱导特异 性抗胂瘤免疫。已在患有脑肿瘤和其它癌症的患者中检验了多个重组 HSV-I载体，其显示在包括脑的人类器官中安全地施用可复制HSV-I载 体的可行性。
许多其它溶瘤病毒是本领域技术人员已知的。例如，疱疹性口腔炎 病毒(VSV)选择性杀死肿瘤细胞。证明脑炎病毒在小鼠肉瘤中具有溶 瘤效应，但是可能需要减毒以便降低其在正常细胞中的感染力。痘苗病 毒，由于其特别是能在肿瘤细胞中复制，代表了在本发明中有用的另外 的复制溶瘤病毒。另外，可增强或者消除特定的病毒功能以提高抗肿瘤 效率并且改善胂瘤细胞粑向。例如，因病毒的胸苷激酶和痘苗病毒生长 因子基因的缺失而产生具有提高的肿瘤靶向活性的痘苗病毒突变体。在 优选的实施方案中，溶瘤病毒是修饰的痘苗病毒，如在美国专利公开No. 2002/0028195中所述，其中突变E3L或者K3L。尽管复制和溶解在 正常细胞中受限，但是麻渗病毒(MV)的疫苗抹容易溶解转化的细胞。因 此，MV非常适于发展作为溶瘤剂。已在感染带状疱渗、肝炎病毒、流 感、水痘和麻渗病毒的肿瘤患者中描述了肿瘤消退(综述见Nemunaitis, 1999)。可在请求保护的发明中使用任何溶瘤病毒。
已知各种溶瘤病毒在肿瘤细胞中选择性复制的能力基于不同的机 理。呼肠孤病毒，例如，为了复制并破坏细胞，需要存在激活的Ras信 号传导途径。在某些其它溶瘤病毒中，通过将必需病毒基因置于肿瘤特 异性启动子的控制下达到胂瘤选择性。在某些病毒中，E1A区负责结合 细胞胂瘤抑制基因Rb并且抑制Rb功能，因此允许细胞增殖机制，以及 病毒复制以不受控制的方式进行。5 24在Rb结合区中具有缺失，并且 不结合Rb (Fueyo等，2000)。因此，在正常细胞中通过Rb抑制突变 体病毒的复制。然而，如果Rb失活并且细胞变成肿瘤细胞，那么524 不再被抑制。因此，突变体病毒有效复制并且溶解Rb缺陷的肺瘤细胞。 在肿瘤细胞中选择性复制的其它机制是本领域已知的。本发明对于与正 常细胞相比，溶瘤病毒选择性在胂瘤细胞中复制的机制没有限制。
优选地，病毒不是用于递送用于基因治疗目的基因的载体。例如， 已将病毒进行了改造以便递送腺病毒E1A基因、p53肺瘤抑制基因、编 码前体药物的基因(Chmum等，1999; 2001 )或在辐射诱导的启动子 下的基因。这些病毒，事实上，通常不优先在肺瘤细胞中复制并且因此 不被认为是溶瘤病毒。
溶瘤病毒可以是天然存在的或者是经修饰的。当可从天然来源中分 离并且在实验室中未被有意修饰时，溶瘤病毒是"天然存在的"。例如， 溶瘤病毒可来自"野生来源"，即，来自已感染溶瘤病毒的人。
溶瘤病毒可以是重组溶瘤病毒，其由两个或多个遗传上不同的溶瘤 病毒的基因组节段的重组/重排所致。溶瘤病毒基因组节段的重组/重排 实际上可能在宿主生物体感染至少两个遗传上不同的溶瘤病毒后天然 发生。也可在细胞培养物中产生重组病毒体，例如，通过使许可性宿主 细胞与遗传上不同的溶瘤病毒的共感染(Nibert等1995 )。本发明进一 步包含使用由两个或多个遗传上不同的溶瘤病毒的基因组节段的重排 所产生的重组溶瘤病毒，其中至少一个亲本病毒是遗传改造的、包括一 个或多个化学合成的基因组节段、已经用化学或物理诱变剂处理过、或者其本身是重组事件的结果.，本发明还包含使用在存在化学诱变剂，包 括但不限于硫酸二甲酯和溴化乙锭时，或者存在物理诱变剂，包括但不 限于紫外光和其它形式的辐射时，经历重组的重组溶瘤病毒。
本发明进一步涉及使用在一个或多个基因组节段中包含缺失或重 复的重组溶瘤病毒，由于与宿主细胞基因组的重组包括附加遗传信息的 重组溶瘤病毒，或者包括合成的基因的重组溶瘤病毒。
可修饰溶瘤病毒并且使其仍然能裂解性感染哺乳动物肿瘤细胞。可 在将所述溶瘤病毒施用于增殖细胞前，通过化学或生物化学法预处理溶 瘤病毒(例如，通过胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶等蛋白酶处理)。用蛋白
酶的预处理可除去病毒的外被(outer coat)或衣壳并且可提高病毒的感 染力。溶瘤病毒可用脂质体或微胶粒包被。例如，在形成烷基硫酸去污 剂的浓度的微胶粒存在时，可用胰凝乳蛋白酶处理病毒体以产生新的感 染性亚病毒体颗粒。
可通过将突变的外壳蛋白整合到，例如病毒外被内以修饰溶瘤病 毒。可通过取代、插入或缺失对蛋白质进行突变。取代包括插入不同的 氨基酸替代天然氨基酸。插入包括在一个或多个位置将另外的氨基酸残 基插入到蛋白质内。缺失包括蛋白质中一个或多个氨基酸残基的缺失。 可通过本领域的已知方法产生这种突变。例如，编码外壳蛋白质之一的 基因的寡核苦酸位点定向诱变可导致产生期望的突变体外壳蛋白。在体 外感染COS 1细胞等哺乳动物细胞的溶瘤病毒中突变蛋白质的表达可 导致突变蛋白整合到溶瘤病毒的病毒体颗粒内(Turner和Duncan,1992; Duncan等，1991; Mah等，1990)。
优选的 一 类免疫刺激剂包括佐剂。许多佐剂含有经设计用于防止抗 原快速分解代谢的物质，如氪氧化铝或矿物油，以及免疫反应的刺激物， 如月旨质A、百日咳杆菌(BoW"t/e〃a/7eWww:s')或结核杆菌(A^vco6(3"en'wm f^wcw/av"')来源的蛋白质。某些佐剂可通过商业途径买到，例如，弗 氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories, Detroit, Mich. ) ; Merck 佐剂65 ( Merck and Company, Inc., Rahway, N.J. ) ; AS - 2 ( SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.);铝盐如明巩或磷酸铝；钙、4失或锌的盐； 酰基化酪氨酸的不溶悬液；酰基化糖；阳离子或阴离子衍生化的多糖； 聚磷腈；可生物降解的微球；单磷酰酯A、 QS21、氨基烷基氨基葡糖苷 4-磷酸，和quilA。细胞因子，如GM-CSF、白介素-2、 -7、 -12，和其它相似生长因子也可用作佐剂。
以便于特定组合物的方式向宿主施用免疫刺激剂，通常作为溶于緩 沖盐中的单一单位剂量。优选地通常在l到几周后，可通过肠道或胃肠 外途径，例如，皮下、皮肤、肌内、皮内、静脉内、动脉内、腹膜内、 鼻内、口服、心内、胰腺内、关节内等途径另外递送强化剂量。可通过 在耙位点施用达到免疫刺激剂的初始或强化剂量的局部化，使用本领域 中已知的持续释放植入物、以不扩散的颗粒的形式递送等。免疫刺激剂 递送的剂量和方案将随所选的特定试剂而改变。通常施用一个或多个剂 量。
在本发明的一个实施方案中，免疫刺激剂是多克隆活化剂，其可包
括内毒素，例如脂多糖(LPS );和超抗原(外毒素)(见Herman等(1991) Annu Rev Immunol 9:745-72 )。尽管超抗原优先活化T细胞，但是内毒 素主要与巨噬细胞上的CD14受体相互作用。因此触发两种细胞类型以 释放促炎细胞因子。超抗原(SAgs )被II类主要组织相容性复合体(MHC ) 呈递并且与大量表达特异性T细胞受体V P结构域的T细胞相互作用。 可选择地，可使用免疫刺激核酸。免疫刺激核酸可具有免疫刺激基 序如CpG基序，和聚鸟噤呤(poly-G)基序。在本发明的一些实施方案 中，可在联合治疗中使用任何核酸以引起免疫反应，无论所述核酸是否 具有可确认的基序。在一个实施方案中，免疫刺激核酸含有序列CpG, 优选地由分子式5' X^2CGX3X4 3'所表示的共有的促有丝分裂的CpG 基序，其中C和G是未甲基化的，X!、 X2、 X3和X4是核苷酸，在5' 和3'端或者接近5'和3'端处不存在GCG三核苷酸序列(见，于1999年 12月28日授予Krieg等的美国专利No. 6,00 8,200)。已知CpG免疫刺 激核酸刺激Thl型免疫反应。尽管在人类DNA中相对稀有，但是通常 发现CpG序列存在于感染生物体如细菌的DNA中。人类免疫系统似乎 已进化到能识别CpG序列作为感染的早期警戒信号，并且引起抗入侵病 原体的立即且有力的免疫反应，而不引起应用其它免疫刺激剂所见到的 有害反应。因此依赖这种天然的免疫防御机制，含有CpG的核酸可利用 唯一的和天然的途径用于免疫治疗。已经在美国专利No. 6,194,388，和 所公开的专利申请，如PCT US95/01570 、 PCT/US97/19791 、 PCT/US98/03678、 PCT/US98/10408、 PCT/US98/04703、 PCT/US99/07335 和PCT/US99/09863中详尽地描述了 CpG核酸对免疫调节的效应。在另一个实施方案中，免疫刺激核酸是聚鸟。票呤免疫刺激核酸。多
篇参考文献，包括Pisetsky和Reich, 1993 Mol Biol. Reports, ] 8:217-221; Krieger和Herz, 1994, Ann. Rev. Biochem., 63: 601- 637; Macaya等， 1993， PNAS， 90: 3745-3749; Wyatt等，1994, PNAS, 91: 1356-1360; Rando和Hogan， 1998,在Applied Antisense oligonucleotide Technology, Krieg和Stein编辑，p. 335-352;以及Kimum等，1994, J. Biochem. 116, 991 -994中描绘了聚鸟噤呤核酸的免疫刺激性质。
免疫刺激核酸可以是双链或单链。尽管单链分子具有增强的免疫活 性，但是通常，双链分子在体内更稳定。因此，在本发明的某些方面， 优选地核酸是单链，在其它方面优选地核酸是双链。整个免疫刺激核酸， 或者其部分可以是非甲基化的，但是至少5'CpG3'的C必需是非曱基化 的。
为了便于摄取到细胞内，免疫刺激核酸优选长度为2 - 100个碱基。 然而，如果存在足够的免疫刺激基序，任何多于6个核苷酸(甚至许多 kb长)大小的核酸都能诱导免疫反应。优选地，免疫刺激核酸在8和 IOO个核苦酸之间，并且在某些实施方案中，大小在8和50或者在8和 30个核普酸之间。
在本发明的方法中使用免疫刺激核酸的 一个特别的优势是免疫刺 激核酸可发挥免疫刺激活性，甚至在相对低的剂量时发挥免疫刺激活 性。尽管所使用的剂量将视将要达到的临床目的而变化，但是适当的剂 量范围是在单一剂量中提供约lFg-约10,000 Fg,通常至少约l，OOOFg 免疫核酸。可选择地，免疫刺激核酸的靶剂量导致施用免疫刺激核酸后， 在第一个24 -48小时内抽出的宿主血液的血量中有约1 - 10飞摩尔免 疫刺激核酸。根据当前的研究认为免疫刺激核酸在这些剂量水平上几乎 没有或者没有毒性。
适于本发明目的的免疫刺激核酸可以是磷酸二酯的形式，或为了更 稳定，以硫代磷酸酯或者磷酸二酯/硫代磷酸酯混合物的形式。尽管可使 用源于现有核酸来源，如基因组DNA或cDNA的寡核苷酸，优选的是 使用合成的寡核苷酸。因此，可研发固体支持物上的寡核苷酸，使用P -氰乙基亚磷酰胺法(Beaucage， S丄.和Caruthers, M.H. Tetrahedron Letters 22, 1859-1862 ( 1981 ))用于3'-〉5'装配，然后在不用调节pH 的0.3M乙酸钠(最终0.3M)存在下于乙醇中进行沉淀。接下来，用4体积80%乙醇进行沉淀，随后在溶于纯水前干燥沉淀。在含有寡核普酸 的硫代磷酸酯中，用硫原子取代构成磷酸基的一个氧原子。可如以前所
描述的方法进行合成，除了用TETD (二硫化四乙基秋兰姆)溶液替换 在磷酸二酯键合成所必需的氧化步骤中使用的碘/水/嘧啶四氢呋喃溶 液，其提供用于产生硫代磷酸基的硫离子。也可设想磷酸二酯键，碱基 或糖的其它修饰，以便修饰所使用的寡核苷酸的特性，特别是用于增加 它们的稳定性。
可选择地，可通过主链修饰达到核酸稳定性。本发明优选的稳定的 核酸具有修饰的主链。已经证明当体内施用时，核酸主链的修饰提供增 强的免疫刺激核酸的活性。免疫刺激核酸主链包括，但不限于，修饰磷 酸的主链，如硫代磷酸酯主链。这些免疫刺激序列的用途是本领域已知 的，例如见Bauer等(1999) Immunology 97(4): 699-705; Klinman等(1999) Vaccine 17(1): 19-25; Hasan等(1999) J Immunol Methods 229(1-2): 1-22; 以及其它。这种修饰的一种类型是硫酸主链修饰。例如，免疫刺激核酸， 包括寡核苷酸5，端的至少两个硫代磷酸酯键和3，端(优选地5，端) 的多个硫代磷酸酯键，可提供最大活性并且防止核酸受细胞内的外切酶 和内切酶的降解。其它修饰磷酸的核酸包括修饰磷酸二酯的核酸，磷酸 二酯和硫代磷酸核酸的组合、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷 酸酯，及其组合。在PCT公开的专利申请PCT/US95/01570和 PCT/US97/19791中更详细地讨论了免疫刺激核酸中这些組合中的每一 个和它们对免疫细胞的特定效应。
引起主要Thl型反应的优选的免疫刺激剂包括，例如，单磷酰酯A, 优选地是3-脱-0-酰基化单磷酰酯A以及铝盐的组合。含有CpG的寡核 苷酸(其中CpG 二核苷酸是非甲基化的)也包括主要的Thl反应。另 一个优选的免疫刺激剂包括皂苷，如QuilA,或其衍生物，包括QS21 和QS7 ( Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, Mass.); 七叶素； 毛地黄皂普；或者Gypsophila或昆诺藜(Chenopodium quinoa ) 皂脊。 其它优选的制剂包括一种以上的皂甙，例如至少两个选自QS21、 QS7、 Quil A、 P七叶素和毛地黄皂苷的成员的组合。
根据本发明的另一个实施方案，免疫刺激剂是溶瘤病毒的至少一种 抗原，所述溶瘤病毒通过抗原呈递细胞(APCs)向宿主递送，如树突细 胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和可进行基因改造成为有效的APCs的其它细胞。可对这种细胞进行遗传修饰以增加呈递抗原的能力，以改 善T细胞反应的活化和/或维持但这不是必需的T细胞反应。通常可从
多种生物液和器官中的任何一种中分离APC,其包括肿瘤和瘤旁组织， 并且可以是自体的、同种异体的、同种同基因的或异种细胞。
已经证明使用负载肺瘤相关抗原的树突细胞的癌症免疫疗法产生 肿瘤特异性免疫反应和抗肿瘤活性(Campton等2000; Fong和Engelmann 2000 )。在使用肺瘤抗原脉冲的(pulsed)树突细胞的体内临床试验中 获得了很有希望的结果(Tarte和Klein 1999)。这些研究清楚地证明使 用树突细胞产生抗癌症抗原的免疫反应的效力。
本发明的某些优选的实施方案使用树突细胞或其祖细胞作为抗原 呈递细胞。冲对突细胞是高效的APC (Banchereau和Steinman， Nature
免疫的生理学佐剂4艮有效(见Timmerman和Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529,1999 )。 一般地，树突细胞可根据下述情况进行鉴别，即它 们的典型形状(原位是星形的，体外具有可见的显著的胞质突(树突))、 它们能高效4聂取、加工和呈递抗原，并且它们能激活天然T细胞反应。
不存在于树突细胞上的特异性细胞表面受体或者配体，本发明包括这种 修饰的树突细胞。可使用负载分泌性小泡抗原(secreted vesicles antigen ) 的树突细胞(称作外来体)作为除了树突细胞以外的选择(见Zitvogel 等，Nature Med. 4:594- 600,1998)。
可从外周血、骨髓、肺瘤浸润的细胞、瘤周组织浸润的细胞、淋巴 结、脾、皮肤、脐带血或者任何其它适当的组织或液体中获得树突细胞
GM-CSF、 IL-4、 IL- 13和/或TNFcc之类的细胞因子的组合先体外后体 内地分化树突细胞。可选4奪地，可通过向培养基中添加GM-CSF、 IL-3、 TNFoc、 CD40配体、LPS、 fit3配体和/或诱导树突细胞分化、成熟和增 殖的其它化合物的组合，将从外周血、脐带血或骨髓中收获的CD34阳 性细胞分化成树突细胞。
III. 实施例 实施例1在两个后胁腹上的两个皮下位置向两组雌性SCID小鼠注射lx106 人乳腺癌MDA-MB468细胞。在注射后大约2 - 4周可很明显摸到肿瘤。 将20|til、 l.OxlO7 PFU/ml浓度的、未稀释的呼肠孤病毒血清型3( Dearing 林)注射到右侧肿瘤块内。连同呼肠孤病毒一起，也向组1的动物注射 lOjiig含有CpG的寡核苷酸ODN 1826 (TCC ATG ACG TTCCT GACGTT)。两周后，再次向这些动物注射等量ODN 1826。组2的动物 接受与CpG同样量和同样频率的盐水注射。结果显示在两组中，动物左 侧的肺瘤大于动物右侧的肿瘤，表明溶瘤病毒疗法在治疗肺瘤中有效。 此外，组1动物中左侧胂瘤小于组2动物左侧的胂瘤，表明和溶瘤病'毒 疗法一道施用免疫刺激剂的额外的抗肺瘤效应。
权利要求
1、在患肿瘤的哺乳动物中治疗或减轻所述肿瘤的方法，所述方法包括(a)向哺乳动物施用溶瘤病毒；和(b)施用免疫刺激剂。
2、 权利要求l的方法，其中在施用溶瘤病毒后施用免疫刺激剂。
3、 权利要求2的方法，其中在溶瘤病毒已感染肿瘤细胞后施用免 疫刺激剂。
4、 权利要求3的方法，其中在经感染的肿瘤细胞表达溶瘤病毒的 至少一种抗原或肺瘤特异性抗原后施用免疫刺激剂。
5、 权利要求2的方法，其中在施用溶瘤病毒后24小时施用免疫刺激剂。
6、 权利要求l的方法，其中溶瘤病毒是呼肠孤病毒。
7、 权利要求6的方法，其中呼肠孤病毒是天然存在的呼肠孤病毒。
8、 权利要求1的方法，其中免疫刺激剂是合成的寡脱氧核苷酸 (ODN)。
9、 权利要求8的方法，其中免疫刺激剂是未曱基化的胞嘧啶-磷 酸-鸟苷(CpG)。
10、 在患肿瘤的哺乳动物中提高溶瘤病毒抗肺瘤活性的方法，所述 的方法包括向哺乳动物施用免疫刺激剂和溶瘤病毒。
11、 权利要求10的方法，其中在溶瘤病毒已感染肺瘤细胞后施用 免疫刺激剂。
12、 权利要求10的方法，其中在经感染细胞表达溶瘤病毒的至少 一种抗原或肿瘤特异性抗原后施用免疫刺激剂。
13、 权利要求11的方法，其中在施用溶瘤病毒后24小时施用免疫 刺激剂。
14、 权利要求10的方法，其中溶瘤病毒是呼肠孤病毒。
15、 权利要求14的方法，其中呼肠孤病毒是天然存在的呼肠孤病毒。
16、 权利要求10的方法，其中免疫刺激剂是合成的寡脱氧核苷酸 (ODN)。
17、 权利要求16的方法，其中免疫刺激剂是未曱基化的胞嘧啶-磷酸-鸟普(CpG)。
18、 在患胂瘤的哺乳动物中提高溶瘤病毒的抗肿瘤活性的方法，所 述的方法包括(a) 将树突细胞与溶瘤病毒接触；(b) 诱导树突细胞呈递溶瘤病毒的抗原；和(c) 在哺乳动物中激发对溶瘤病毒的免疫反应。
19、 权利要求18的方法，其中所述接触以先体外后体内方式发生 并且在接触后向哺乳动物施用树突细胞。
20、 提高溶瘤病毒疗法效率的方法，包括(a) 向哺乳动物施用溶瘤病毒；和(b) 施用免疫刺激剂。
21、 权利要求20的方法，其中在施用溶瘤病毒后施用免疫刺激剂。
22、 权利要求21的方法，其中在溶瘤病毒已感染肿瘤细胞后施用 免疫刺激剂。
23、 权利要求21的方法，其中在溶瘤病毒疗法后24小时施用免疫 刺激剂。
24、 权利要求20的方法，其中溶瘤病毒疗法是呼肠孤病毒。
25、 权利要求24的方法，其中呼肠孤病毒是天然存在的呼肠孤病毒。
26、 权利要求20的方法，其中免疫刺激剂是是合成的寡脱氧核苷 酸(ODN)。
27、 权利要求26的方法，其中免疫刺激剂是未曱基化的胞嘧啶-磷酸-鸟苷。
28、 增强胂瘤细胞的免疫识别的方法，包括(a) 用溶瘤病毒感染肿瘤细胞；(b) 通过下列方法激发对溶瘤病毒抗原的免疫反应(i) 将树突细胞与溶瘤病毒接触；(ii) 诱导树突细胞呈递溶瘤病毒的抗原；和(iii) 激发针对溶瘤病毒的免疫反应；其中对溶瘤病毒的免疫反应是针对由所感染的肿瘤细胞所表达的 :容瘤病毒抗原的反应。
全文摘要
本发明提供在哺乳动物中治疗或减轻肿瘤并且通过使用溶瘤病毒和免疫刺激剂的组合提高溶瘤病毒效率的新方法，包括向宿主施用呼肠病毒并且通过添加免疫刺激剂如CpG寡脱氧核苷酸或者通过树突细胞向宿主递送的所述病毒的至少一种抗原提高免疫反应。
文档编号A61K35/76GK101304761SQ200680031389
公开日2008年11月12日 申请日期2006年8月22日 优先权日2005年8月31日
发明者B·G·汤普逊, M·C·科菲 申请人:昂科利蒂克斯生物科技公司