一种多药联合诱导构建多药耐药人肝癌Bel-7402细胞株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种多药联合诱导构建多药耐药人肝癌 Bel-7402细胞株的方法。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是世界范围内常见的致死性疾病，每年各个国家都有大量人员因恶性肿 瘤导致死亡。而原发性肝癌是其中一种常见的恶性肿瘤，患者的死亡率与发病率相近，每年 新增的肝细胞癌病例据报道大约有750000例，在世界范围内，原发性肝癌是第二大致死性 癌症，同时也是近年来发生率一直呈上升趋势的少数癌症种类之一。由于肝癌手术有其局 限性，化学疗法多与手术、放疗等联合使用，增强对癌肿的杀伤作用，尤其是对于一些晚期 肝癌患者、已经发生扩散的肝癌患者，应用化疗来延长患者生存期。单独使用化疗、尤其是 使用单一药物化疗时，并不能取得理想的治疗效果，且治疗肿瘤的化疗药物多带有副作用， 因此，需要多种化疗药物联合应用，并且将化疗方案与手术、放疗等治疗方案联合应用，才 能取得相对较好的治疗效果。
[0003] 尽管化疗在肿瘤的治疗方案中占有重要地位，当单一化疗药物作用于肿瘤细胞 后，该种肿瘤细胞会对几种不同结构、不同种类、不同作用机制的化疗药物产生耐药性，BP 为肿瘤细胞的多药耐药性（MDR)。肿瘤细胞对于化疗药物的多药耐药性的出现，使得化疗的 效果变差。为了降低肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药性，许多实验尝试逆转肿瘤细胞的多 药耐药性。目前关于逆转肿瘤细胞多药耐药性的实验使用的细胞株，大多是由一种药物诱 导刺激而得到的。许多关于如何诱导得到多药耐药肿瘤细胞株的实验，大多也是由一种化 疗药物诱导而成。单一化疗药物诱导肿瘤多药耐药细胞株有不同的方法，一种方法可以先 使用低浓度的化疗药物刺激肿瘤细胞株，当肿瘤细胞对化疗药物浓度耐受以后，再逐步提 高化疗药物浓度，最终获得能对多种化疗药物具有耐药性的肿瘤细胞株。另一种方法是直 接使用高浓度化疗药物对肿瘤细胞进行冲击，将含药培养液与肿瘤细胞的共培养时间由短 变长，直至得到肿瘤多药耐药细胞株。此外，还能够将两种诱导方法联合使用，也能够得到 肿瘤多药耐药细胞株。
[0004] 但是在实际临床化疗的方案中，很少使用单独一种化疗药物进行化疗，常联合使 用几种化疗药物进行治疗。如何在体外获得到更接近临床的肿瘤多药耐药细胞株，在体外 使用多种化疗药物联合诱导能否得到多药耐药细胞株模型，如果多药联合诱导方案得到多 药耐药细胞株，其生物学特性与亲本细胞株相比有何异同，是否类似单药诱导方案得到的 体外多药耐药细胞株模型，具体结果我们还不清楚。因此，为了给肿瘤多药耐药机制的实验 研宄和逆转多药耐药性的实验研宄提供多药耐药株模型，寻求一种接近临床化疗方法诱导 方案的多药耐药肿瘤细胞株显得尤为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种多药联合诱导构建多药耐药人肝癌Bel-7402细胞株 的方法，旨在解决现有技术不能提供多药耐药人肝癌Bel-7402细胞株、特别是接近临床化 疗方法的多药耐药人肝癌Bel-7402细胞株的问题。
[0006] 本发明是这样实现的，一种多药联合诱导构建多药耐药人肝癌Bel-7402细胞株 的方法，包括以下步骤：
[0007] 提供人肝癌Bel-7402细胞株，并对其进行复苏和传代处理；
[0008] 采用奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、顺铂多药联合诱导所述人肝癌Bel-7402细胞株，得 到多药耐药人肝癌Bel-7402细胞株。
[0009] 本发明提供的多药联合诱导构建多药耐药人肝癌Bel-7402细胞株的方法，通过 同时选用奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、顺铂联合用药，获得的人肝癌Bel-7402细胞明显产生了 多药耐药性。此外，本发明得到的多药耐药人肝癌Bel-7402细胞株更接近临床采用多药化 疗方法对人肝癌Bel-7402细胞进行治疗的方案，更加符合临床耐药模型的肝癌细胞系，对 临床化疗多药耐药多药耐药人肝癌Bel-7402细胞株的研宄有重要意义。
[0010] 本发明进一步在联合用药时对奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、顺铂进行浓度和诱导时间 的控制，可以更好地提高多药诱导过程中人肝癌Bel-7402细胞的存活率，从而进一步提高 了构建多药耐药人肝癌Bel-7402细胞株的成功率，同时，提高了多药耐药人肝癌Bel-7402 细胞株的构建效率。
【附图说明】
[0011] 图1是本发明实施例提供的Bel-7402、Bel-7402/DDP、Bel-7402/X三种细胞株对 5-氟尿嘧啶的敏感曲线图；
[0012] 图2是本发明实施例提供的Bel-7402、Bel-7402/DDP、Bel-7402/X三种细胞株对 顺铂的敏感曲线图；
[0013] 图3是本发明实施例提供的Bel-7402、Bel-7402/DDP、Bel-7402/X三种细胞株对 奥沙利铂的敏感曲线图；
[0014] 图4是本发明实施例提供的Bel-7402、Bel-7402/DDP、Bel-7402/X三种细胞株对 丝裂霉素的敏感曲线图；
[0015] 图5是本发明实施例提供的Bel-7402、Bel-7402/DDP、Bel-7402/X三种细胞株对 阿霉素的敏感曲线图；
[0016] 图6是本发明实施例提供的阴性对照组、单药诱导所述人肝癌Bel-7402细胞的对 照组以及多药联合诱导人肝癌Bel-7402细胞组消化、传代后的细胞形态图；
[0017] 图7是本发明实施例提供的阴性对照组、单药诱导所述人肝癌Bel-7402细胞的对 照组以及多药联合诱导人肝癌Bel-7402细胞组在诱导过程中的细胞形态图；
[0018] 图8是本发明实施例提供的Bel-7402、Bel-7402/DDP、Bel-7402/X三种细胞株的 生长曲线图；
[0019] 图9是本发明实施例提供的Bel-7402、Bel-7402/DDP、Bel-7402/X三种细胞株迀 徙作用比较图。
【具体实施方式】
[0020] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合 附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用 以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0021] 在肝癌的治疗方式中，化疗占据重要地位，但是多药耐药的产生使化疗效果大大 减弱，许多实验尝试逆转肿瘤细胞的多药耐药性，减少多药耐药现象的产生，这就需要我们 首先得到多药耐药细胞株。目前，体外诱导多药耐药株的方法，大多是用一种药物来诱导， 而临床上常常同时使用几种药物治疗。所以联合多种药物诱导多药耐药细胞株，成功得到 多药耐药Bel-7402/X细胞株显得尤为重要。
[0022] 有鉴于此，本发明实施例提供了一种多药联合诱导构建多药耐药人肝癌Bel-7402 细胞株的方法，包括以下步骤：
[0023] SOL提供人肝癌Bel-7402细胞株，并对其进行复苏和传代处理；
[0024] S02.采用奥沙利铂、5-氟尿嘧啶、顺铂多药联合诱导所述人肝癌Bel-7402细胞 株，得到多药耐药人肝癌Bel-7402细胞株。
[0025] 具体的，上述步骤SOl中，通常用于研宄的所述人肝癌Bel-7402细胞株保存在冻 存管中，为了获得用于本发明实施例的、具有活性的所述人肝癌Bel-7402细胞株，需要对 所述人肝癌Bel-7402细胞株进行复苏处理和传代处理。
[0026] 作为优选实施例，为了快速获得活度好的人肝癌Bel-7402细胞株，所述人肝癌 Bel-7402细胞株的复苏采用DMEM高糖培养基进行培养，并置于37°C、5% CO2饱和湿度培养 箱中培养。作为具体优选实施例，所述DMEM高糖培养基中含有10%胎牛血清、lOOU/mL青 霉素、100 μ g/mL链霉素。
[0027] 其中，本发明实施例所述DMEM高糖培养基可自行配置或购买。若采用保存于冰箱 中的所述DMEM高糖培养基时，作为具体实施例，将所述DMEM高糖培养基置于37°C水于锅中 温热融化处理，处理时间根据实际情况来定，具体约半小时。
[0028] 本发明实施例所述人肝癌Bel-7402细胞株的来源不受限制，可选用研宄途径获 取的人肝癌Bel-7402细胞株或在市场上购买。为了方便所述人肝癌Bel-7402细胞株的转 移至培养基中进行培养，可将所述人肝癌Bel-7402细胞株冻存管置于水浴锅中温热融化 处理。
[0029] 作为具体实施例，将所述人肝癌Bel-7402细胞株进行复苏处理的方法可为：将温 热融化后的冻存液吸取到所述培养皿中，再加入DMEM高糖完全培养基，轻轻吹打后混匀， 显微镜下观察后置于37°C、5% C02饱和湿度培养箱进行培养过夜。取出细胞已经贴壁的培 养皿，弃掉培养液，以便去除冻存液中含有的二甲亚砜，使用PBS缓冲液轻轻冲洗后，再次 加入适量的DMEM高糖完全培养基，继续放入培养箱中培养。
[0030] 作为另一个优选实施例，将复苏后的所述人肝癌Bel-7402细胞株进行传代处理 方法为：待细胞密度达到培养皿面积90%，采用含EDTA的0. 25 %胰蛋白酶液进行消化 后，置于所述DMEM高糖完全培养基中混悬，将混悬液进行离心处理后，使用所述DMEM高糖 完全培养基进行培养。进一步的，为了获得细胞活度充分恢复的细胞株，可将所述人肝癌 Bel-7402细胞进行2次传代处理。
[0031] 作为具体优选实施例，对所述人肝癌Bel-7402细胞株进行传代处理方法为：当复 苏的所述人肝癌Bel-7402细胞株细胞密度达到培养皿面积90%以上是进行传代。具体的， 吸去培养液后，使用PBS缓冲液轻轻冲洗两遍，向培养皿中均匀加入ImL含EDTA的0. 2