专利名称：一种利用中国红豆杉细胞生产紫杉烷类的方法
技术领域：
本发明涉及紫杉烷的生产方法，具体地说涉及用植物细胞培养技术生产紫杉烷的方法。
云南紫杉烷(Taxuyunnanine C,Tc)与紫杉醇同属于三环二萜类化合物，文献(1994)Taxanes from Taxus chinensis.Phytochemistry.38:667-670.报道了该化合物，其结构式如下 紫杉烷Tc(简称Tc)被推测是紫杉醇生物合成途径中的中间代谢物，它们可以作为合成紫杉醇或其它有用物质的前体，其本身的药用价值也正在研究和开发之中(王红强博士论文，华东理工大学，1998)。利用红豆杉细胞培养高产紫杉烷作为化学半合成紫杉醇的前体具有潜在的商业生产价值。
自从紫杉醇的临床抗癌活性被发现以来，紫杉醇以及相关的紫杉烷类化合物受到人们越来越多的关注。到目前为止，已分离得到一百多种紫杉烷，并发现一些紫杉烷类具有和紫杉醇相似的活性。美国食品及药物管理局(FDA)于1992年底正式批准紫杉醇可用于治疗晚期卵巢癌患者。到目前为止，已有十多个国家批准紫杉醇可用于癌症的治疗。但是，全世界紫杉属植物资源很有限，而对其的需求量极大。据估计，全世界每年需要500kg的紫杉醇才能满足广大癌症患者的需求。若光从树皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。即使按全世界每年需要50kg紫杉醇计算，全世界红豆杉属植物也仅够砍伐10-15年。如此大量砍伐将对红豆杉属植物的长期存留和地区分布带来严重的威胁，造成生物多样性和生态环境的极大破坏和无法弥补的损失。所以，研究紫杉醇的其它来源已成为当务之急。同人工栽培红豆杉属植株或化学全合成紫杉醇等方法相比，专利Japan Patent WO 95/14103、US Patent 5407816等报道的细胞培养法生产紫杉烷类物质由于生产周期短、劳动力省、成本低以及受外部环境影响小等优点通常被认为是一种比较有效的方法。但是用植物细胞培养技术生产紫杉醇目前仍然存在生产效率低的问题，达不到工业化生产的要求。诱导剂由于其具有的能够刺激植物细胞次级代谢的能力而被用来进一步提高植物细胞的生产能力，文献(1996)Methyl jasmonate-induced overproduction of paclitaxel and baccatin Ⅲ inTaxus cell suspension cultures.Nat.Biotechnol.14:1129-1132.和(1999)The kineticsoftaxoid accumulationin cell suspension cultures of Taxus following elicitation withmethyl jasmonate.Biotechnol.Bioeng.62:97-105.报道了茉莉酮酸类物质能够促进紫杉烷类物质的产生。但是利用诱导法来提高云南紫杉烷(Tc)生产能力的研究还未见报道。
本发明的目的在于提供一种利用中国红豆杉细胞(Taxus chinensis)的悬浮培养，通过诱导剂的诱导和补糖添加组合起来的生产云南紫杉烷(Tc)的新方法，十分显著地提高了Tc的生产效率，克服了现有技术的缺陷。
实现本发明的技术方案包括如下步骤(1)中国红豆杉细胞的培养将从植株幼茎外植体诱导愈伤组织中分离获得的中国红豆杉(T.chinensis)细胞，移入液体培养基中采用常规的方法进行继代培养，该制备过程为一现有技术，在文献(1997)Enhanced production oftaxol in suspension cultures of Taxuschinensis by controlling inoculum size.19:353-355.文献中对该过程已有详细的描述；培养基采用该文献公开的Murashige-Skoog(MS)培养基，另添加0.1-1.0mg/L6-苄基腺嘌呤，0.05-0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，0.05-0.5mg/L萘乙酸，20-500mg/L抗坏血酸及10-50g/L蔗糖。每隔14天传代一次，培养使用旋转式摇床，转速为60-200rpm，培养温度20-30℃，暗培养，接种量为20-200g/L湿重。
(2)Tc的生产将步骤(1)所获得的中国红豆杉湿细胞置于含上述培养基的摇瓶中暗培养(接种量为20-200g/L湿重)，旋转式摇床转速为60-200rpm，温度20-30℃，培养周期为12-25天，从所获得的培养物中采用常规的方法收集Tc,Tc生产率最高可达30.2mg/(L·d)，最高产量可达538.9mg/L。
在摇瓶培养过程中可利用诱导剂进行诱导，在培养前期细胞快速生长阶段，添加诱导剂二氢甲基茉莉酮酸酯(HMJA)或甲基茉莉酮酸酯(MJA)至培养基中诱导剂的最终浓度为1-1000μM；在添加诱导剂的同时进行补糖，补加量为10-30g/L；所说的糖为蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖等。
(3)Tc的测定方法称取100mg干细胞，磨成细粉，加入2mL甲醇浸泡3天，离心后取上清液挥干，加入二氯甲烷和蒸馏水各2mL，充分震荡混合后静置数分钟，离心取下层二氯甲烷相，挥干，加入1mL HPLC级甲醇溶解，用于Tc高效液相色谱分析。采用配有Waters 486紫外检测仪的Waters 510(英国)型高效液相色谱仪，检测波长为227nm。采用美国Whatman公司生产的五氟苯硅烷柱(PFP)。流动相为己腈∶水=42∶58，流速为1mL/min。每次进样量为20μL，进样前样品用10000rpm离心取除固体杂质。
由上述公开的技术方案可见，本发明同时利用诱导和补料来促进细胞的生产能力，获得的Tc产量大大超过目前文献报道的最高值，Tc生产率最高可达30.2mg/(L·d)，最高产量可达538.9mg/L，是一种很有工业应用前景的Tc的生产方法。
以下将通过实施例对本发明的有关内容作进一步的说明。
实施例1采用从植株幼茎外植体诱导愈伤组织得到的中国红豆杉细胞。250mL摇瓶培养，采用MS培养基，另添加0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，0.2mg/L萘乙酸，100mg/L抗坏血酸及30g/L蔗糖。
将真空过滤得到的5g湿细胞接种到含有50mL上述培养基的摇瓶中，旋转式摇床转速110rpm,25℃培养。第9天添加MJA至最终浓度为100μM，继续培养至21天结束发酵，收获细胞并在40℃干燥。细胞密度在第12天达到最高(干重19.2g/L)，产率为1.0g/(L·d)。另外，干细胞还要进行Tc的分析测定，计算得到结果见下表(*代表最大值)。
实施例2培养条件同实例1，在第7天添加MJA至100μM，继续培养至21天结束发酵。细胞密度在第12天达到最高(干重19.2g/L)，产率为1.0g/(L·d)。Tc的生产能力见下表。
实施例3培养条件同实例1，在第7天添加MJA至500μM，继续培养至21天结束发酵。细胞密度在第12天达到最高(干重11.1g/L)，产率为0.4g/(L·d)。Tc的生产能力见下表。
实施例4培养条件同实例1。第一组作为对照；第二组在第7天添加MJA至100μM；第三组在第7天同时添加MJA至100μM，并且同时添加蔗糖20g/L，继续培养至21天结束发酵，细胞密度在第18天达到最高(干重23.6g/L)，产率为0.89g/(L·d)。各组的Tc生产能力见下表。
第一组(对照)
第二组(诱导)
第三组(同时诱导和补糖)
权利要求
1．一种利用中国红豆杉细胞生产紫杉烷类的方法，包括从植株幼茎外植体诱导的愈伤组织中分离获得中国红豆杉细胞，其特征在于还包括如下步骤(1)将中国红豆杉细胞移入液体培养基中采用常规的方法进行继代培养；(2)然后将所获得的中国红豆杉湿细胞置于含培养基的摇瓶中暗培养，培养周期为12-25天，从所获得的培养物中采用常规的方法收集云南紫杉烷；在摇瓶培养前期细胞快速生长阶段，添加诱导剂二氢甲基茉莉酮酸酯或甲基茉莉酮酸酯至培养基中诱导剂的最终浓度为1-1000μM。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，在添加诱导剂的同时进行补糖，补加量为10-30g/L；所说的糖为蔗糖、葡萄糖、果糖或乳糖中的一种。
3．如权利要求1所述的方法，其特征在于，中国红豆杉细胞的培养和湿细胞的摇瓶暗培养均采用Murashige-Skoog培养基，并添加0.1-1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.05-0.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，0.05-0.5mg/L萘乙酸，20-500mg/L抗坏血酸和10-50g/L蔗糖。
4．如权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的糖为蔗糖。
5．如权利要求1所述的方法，其特征在于，中国红豆杉湿细胞摇瓶中暗培养时，接种量为20-200g/L湿重，温度为20-30℃。
全文摘要
本发明提供了一种利用中国红豆杉细胞生产紫杉烷类的方法。本发明利用中国红豆杉细胞(Taxus chinensis)的悬浮培养,通过诱导剂的诱导与补糖添加的组合,十分显著地提高了云南紫杉烷(Tc)的生产效率,获得的Tc产量大大超过目前文献报道的最高值,Tc生产率最高可达30.2mg/(L·d),最高产量可达538.9mg/L,是一种很有工业应用前景的Tc的生产方法。
文档编号C12P7/12GK1288953SQ0012530
公开日2001年3月28日 申请日期2000年9月21日 优先权日2000年9月21日
发明者钟建江, 董浩迪 申请人:华东理工大学