专利名称：：一种从红豆杉枝叶中提取纯化两种紫杉烷类化合物的方法
技术领域：
：本发明涉及一种从红豆杉枝叶中提取纯化10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的方法。
背景技术：
：紫杉醇(paclitaxel，图l)是具有五甲基十五碳烯骨架的二砲类化合物，是最早从太平洋红豆杉(Taxusbrevifolia)树皮中提取出来的一种天然抗癌药物(Wanietal.,1971)，能与微管蛋白结合，并促进其聚合、抑制癌细胞有丝分裂，阻止癌细胞的增殖(Kellingetal.,2003;佘琨等，2001)1992年被美国FDA正式批准为抗癌新药，紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌、肺癌有较好的作用。近年来研究表明，紫杉醇对治疗其它疾病也有一定潜力，如恶性黑色素瘤(罗士德等，1994)、类风湿性关节炎(01iveretal.,1994)和早老性痴呆(Burkeetal.,1994)等。随着国际市场上对紫杉醇需求量的日益增长，野生红豆杉资源遭到了毁灭性的破坏，人工种植红豆杉己成为解决紫杉醇原料短缺的重要途径(刘颖和肖艳，2005;黄玉仙，2005;吉前华，2004)，但如果采用传统方法，从红豆杉树皮中提取紫杉醇，资源耗费太大且人工种植周期长，仍不能解决紫杉醇的原料问题。目前供临床使用的紫杉醇主要从红豆杉树皮中提取。紫杉醇在红豆杉植物中含量很低，即使当前公认含量最高的短叶红豆杉树皮中也仅有O.Ol%0.03%。为了解决紫杉醇供需之间的尖锐矛盾,多年来，科学工作者在寻找及扩大紫杉醇药源途径方面做了不懈的努力。人们从以下几个方面进行了研究红豆杉细胞大规模培养、全合成和半合成，产紫杉醇真菌的筛选和发酵培养,紫杉醇生物合成途径中关键酶基因的克隆和工程菌的改造等。目前，人工种植的红豆杉数量逐渐增加，给紫杉醇的获得提供了新的来源，但是红豆杉生长缓慢，环境适应性较弱，不能依靠人工种植的红豆杉树皮提取所需的紫杉醇，因此，应该利用其可再生部位——枝叶，对其的枝叶进行充分的开发利用。在许多紫杉属植物中，含有很多与紫杉醇结构相似的紫杉烷类化合物，含量比紫杉醇丰富得多，这些紫杉烷类化合物可以通过生物或者化学转化的手段转变成紫杉醇，例如10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇。10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇(图1)存在于多种紫杉属植物中，例如T.6rew》/fa,77.6accato,r.me&a,J!c/z/wera/s,""t/Zow/^ato等，在紫杉属植物中的含量约为0.0052%~0.1185%。在C-7位连接有木糖基的紫杉烷类化合物最初由Senilh分离得到，主要有7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇，7-木糖基-10-去乙酰基三尖杉宁碱，7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇C等，这些化合物在传统的提取紫杉醇的生产工艺中常被当作废物丢弃掉，既浪费了植物资源，又污染了环境。和紫杉醇与多西紫杉醇比较，IO-去乙酰基巴卡亭III几乎不具有任何抗癌活性，然而由于其结构与紫杉醇、多西紫杉醇相似，10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇可以用于紫杉醇与多西紫杉醇的半合成，因此，10-去乙酰基巴卡亭m和7-木糖基-io-去乙酰基紫杉醇的制备型分离是在世界范围内的一个研究热点。
发明内容本发明的目的在于提供一种以红豆杉枝叶为原料，通过负压空化水提对其中的10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇进行提取，通过树脂富集和硅胶柱层析对io-去乙酰基巴卡亭m和7-木糖基-io-去乙酰基紫杉醇进行纯化的工艺方法。本方法不仅可以获得10-去乙酰基巴卡亭in和7-木糖基-io-去乙酰基紫杉醇产品，还可提高植物固形物中紫杉醇等有效成分的后期提取纯化，增加原料的利用度。一种从红豆杉枝叶中提取纯化10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的方法，其主要特征在于红豆杉枝叶经过干燥粉碎后，于50°C下进行负压空化水提30min，过滤后滤液经过AB-8树脂动态吸附，用30%乙醇进行淋洗除去杂质，再用80%乙醇洗脱得到目标产物，从而达到对10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的初步富集，后经过中压硅胶柱层析进一步纯化，得到纯度为60%以上的10-去乙酰基巴卡亭III和67%以上的7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇。按照权利要求1所述的红豆杉枝叶，其特征在于红豆杉枝叶主要来源包括东北红豆杉和南方红豆杉。按照权利要求1所述的负压空化水提，其特征在于IO-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇是水溶性较大的物质，通过负压空化水提，可以将植物材料中的10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇充分提出，而将其它紫杉醇等大部分脂溶性的物质留在植物固形物中，可作为后期提取紫杉醇的原料。通过负压空化提取，使得提取溶剂与植物细胞有了更充分的接触，促使植物细胞中的物质迅速彻底地转移至提取溶剂中，所用时间短，效率高。按照权利要求1所述的树脂富集，其特征在于所用的树脂为AB-8。该树脂对于10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇具有特异性吸附。所用树脂为35g，上样溶液为15BV，流速为1mL/min，温度为35°C,采用梯度洗脱的方法3BV的30%乙醇洗脱除去杂质，然后6BV80。/。乙醇洗脱，收集馏分，浓缩至干，经过树脂富集后，10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的含量可分别提高8.54倍以上和62.43倍以上。按照权利要求l所述的中压硅胶柱层析，其特征在于所用硅胶为300-400目40g，柱高为14.5cm，，中压柱层析，洗脱剂为不同比例的乙酸乙酯与石油醚的混合溶剂梯度洗脱，流速为4.3mL/min，洗脱过程中用TLC进行检测，利用10°/。的硫酸乙醇溶液显色。先用600mL乙酸乙酯/石油醚(1/1，v/v)洗脱，淋洗除杂，用1.6L乙酸乙酯/石油醚(1/1.2，v/v)洗脱，收集含有IO-去乙酰基巴卡亭IH的馏分，后用300mL乙酸乙酯/石油醚(16/1，v/v)淋洗除杂，最后用200mL乙酸乙酯/石油醚(20/1，v/v)洗脱，收集含有7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的馏分。最终得到纯度为60%以上的10-去乙酰基巴卡亭III和67%以上的7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇。本发明的优点1.本发明以红豆杉可再生枝叶为原料，不破坏植物资源，提取后的固形物可作为提纯紫杉醇等有效成分的原料，实现了对植物资源的髙效利用。2.本发明采用负压空化水提的方法对植物原料中的10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇进行提取，时间短，效率高。3.本发明所采用的AB-8树脂富集方法，对粗提取物中的10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇具有特异性吸附，可以高效地提高洗脱馏分中两种物质的含量。4.该方法简单易行，可实现大规模的产业化生产。.具体实施方案实施例1称取200g南方红豆杉枝叶，干燥粉碎后，加入2000mL水负压空化提取，30min后过滤，滤液加入到装有35gAB-8树脂的玻璃柱中，进行动态吸附，上样溶液为15BV,上样溶液中10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的浓度分别为0.0657mg/mL禾P0.1681mg/mL，流速为1mL/min，温度为35°C，采用梯度洗脱的方法3BV的30%乙醇洗脱除去杂质，然后6BV80%乙醇洗脱，收集馏分，浓縮至干，经过树脂富集后，10-去乙酰基巴卡亭111和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的含量分别从0.2%和0.053%提高到了1.69%和3.34%,分别提高了8.54倍和62.43倍。树脂富集后样品进行300~400目中压硅胶柱层析纯化，所用硅胶为40g，柱高为14.5cm，洗脱剂为不同比例的乙酸乙酯与石油醚的混合溶剂梯度洗脱，流速为4.3mL/min，洗脱过程中用TLC进行检领IJ，利用10%的硫酸乙醇溶液显色。先用600mL乙酸乙酯/石油醚(1/1，v/v)洗脱，淋洗除杂，用1.6L乙酸乙酯/石油醚(1/1.2，v/v)洗脱，收集含有10-去乙酰基巴卡亭III的馏分，浓縮至干，得固形物0.3g其中10-去乙酰基巴卡亭III含量为60%，后用300mL乙酸乙酯/石油醚(16/1，v/v)淋洗除杂，最后用200mL乙酸乙酯/石油醚(20/1，v/v)洗脱，收集含有7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的馏分，浓縮至干，得固形物0.56g，其中7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的含量为70%。实施例2称取200g东北红豆杉枝叶，干燥粉碎后，加2000mL水负压空化提取，30min后过滤，滤液加入到装有35gAB-8树脂的玻璃柱中，进行动态吸附，上样溶液为15BV,上样溶液中10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的含量分别为0.0519mg/mL和0.1673mg/mL,流速为1mL/min,温度为35。C,采用梯度洗脱的方法3BV的30。/。乙醇洗脱除去杂质，然后6BV80。/。乙醇洗脱，收集馏分，浓縮至干，经过树脂富集后，10-去乙酰基巴卡亭111和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的含量分别从0.16%和0.049%提高到了1.57%禾n3.46%，分别提高了9.81倍和70.61倍。树脂富集后样品进行300-400目中压硅胶柱层析纯化，所用硅胶为40g，柱高为14.5cm，洗脱剂为不同比例的乙酸乙酯与石油醚的混合溶剂梯度洗脱，流速为4.3mL/min,洗脱过程中用TLC进行检测，利用10%的硫酸乙醇溶液显色。600mL乙酸乙酯/石油醚(1/1，v/v)洗脱，淋洗除杂，用1.6L乙酸乙酯/石油醚(1/1.2，v/v)洗脱，收集含有10-去乙酰基巴卡亭III的馏分，浓縮至干，得固形物0.37g其中10-去乙酰基巴卡亭III含量为64%，后用300mL乙酸乙酯/石油醚(16/1，v/v)淋洗除杂，最后用200mL乙酸乙酯/石油醚(20/1，v/v)洗脱，收集含有7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的馏分，浓縮至干，得固形物0.48g，其中7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的含量为67%。标准品10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的标准品购自Sigma公司。结果定量检测分析采用下表条件<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>图1为10-去乙酰基巴卡亭III的结构式图2为7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的结构式。权利要求1.一种从红豆杉枝叶中提取纯化10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的方法，其主要特征在于红豆杉枝叶经过干燥粉碎后，于50℃下进行负压空化水提30min，过滤后滤液经过AB-8树脂动态吸附，用30％乙醇进行淋洗除去杂质，再用80％乙醇洗脱得到目标产物，从而达到对10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的初步富集，后经过中压硅胶柱层析进一步纯化，得到纯度为60％以上的10-去乙酰基巴卡亭III和67％以上的7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇。2.按照权利要求1所述的红豆杉枝叶，其特征在于红豆杉枝叶主要来源包括东北红豆杉和南方红豆杉。3.按照权利要求1所述的负压空化水提，其特征在于IO-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇是水溶性较大的物质，通过负压空化水提，可以将植物材料中的10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇充分提出，而将其它紫杉醇等大部分脂溶性的物质留在植物固形物中，可作为后期提取紫杉醇的原料。通过负压空化提取，使得提取溶剂与植物细胞有了更充分的接触，促使植物细胞中的物质迅速彻底地转移至提取溶剂中，所用时间短，效率高。4.按照权利要求1所述的树脂富集，其特征在于所用的树脂为AB-8。该树脂对于10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇具有特异性吸附。所用树脂为35g,上样溶液为15BV,流速为1mL/min，温度为35°C，采用梯度洗脱的方法3BV的30%乙醇洗脱除去杂质，然后6BV80。/。乙醇洗脱，收集馏分，浓縮至干，经过树脂富集后，10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的含量可分别提高8.54倍以上和62.43倍以上。5.按照权利要求1所述的中压硅胶柱层析，其特征在于所用硅胶为300~400目40g，柱高为14.5cm，中压柱层析，洗脱剂为不同比例的乙酸乙酯与石油醚的混合溶剂梯度洗脱，流速为4.3mL/min，洗脱过程中用TLC进行检测，利用10%的硫酸乙醇溶液显色。先用600mL乙酸乙酯/石油醚(1/1,v/v)洗脱，淋洗除杂，用1.6L乙酸乙酯/石油醚(1/1.2，v/v)洗脱，收集含有10-去乙酰基巴卡亭III的馏分，然后用300mL乙酸乙酯/石油醚(16/1，v/v)淋洗除杂，最后用200mL乙酸乙酯/石油醚(20/1，v/v)洗脱，收集含有7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的馏分。最终得到纯度为60%以上的10-去乙酰基巴卡亭III和67%以上的7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇。全文摘要本发明涉及一种通过负压空化水提的方法，利用特异性树脂及硅胶柱层析纯化高效生产10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇的方法。以红豆杉枝叶为原料，干燥粉碎后进行负压空化水提，过滤后滤液经过AB-8树脂动态吸附对10-去乙酰基巴卡亭III和7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇进行富集，后经过中压硅胶柱层析进一步纯化，得到纯度为60％以上的10-去乙酰基巴卡亭III和67％以上的7-木糖基-10-去乙酰基紫杉醇。本发明所用原料为可再生的红豆杉枝叶，既做到了不破坏生态资源，又能高效提取得到红豆杉有效成分及其生物半合成前体物质。该方法操作简单易行，适于工业应用，对产业化生产具有重要意义。文档编号C07D305/14GK101235022SQ20071014453公开日2008年8月6日申请日期2007年11月1日优先权日2007年11月1日发明者付玉杰,威刘,姜守刚,蕊孙,琳张,李双明,琢汪,莹王,祖元刚申请人:东北林业大学;付玉杰