专利名称：一种抗紫杉醇单克隆抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法。
背景技术：
恶性肿瘤严重地威胁着人类的健康，而且癌症是目前人类疾病中仅次于心脑血管 疾患的第二大死因。紫杉醇是从红豆杉属植物中提取出来的具有多种抗肿瘤疗效的二萜生物碱类药 物；由于红豆杉(又名紫杉)是珍稀树种，生长速度缓慢，并且其生物学特性对生态环境要 求较高，天然更新能力差，所以种群数量极为有限，属濒危保护植物，资源十分有限，因此国 内外学者都在积极地研究开发紫杉醇的新药源。微生物发酵生产是降低成本、大量获取紫杉醇的最理想方法。1993年美国蒙塔那 州立大学化学家Andrea Stierle和植物病理学家Gary Strobel在蒙塔那西北部国家冰川 公园的短叶红豆杉中分离到一株内生真菌Taxomyces andreanae，在Stierle等的工作一 经发表，美国细胞克隆公司就出价100万美元支持蒙塔那州立大学的这项研究。但是目前 可用于紫杉醇微生物发酵的菌株的紫杉醇产量仍然较低，且发酵液中杂质含量多，难以分 离提取，致使无法满足市场的需求。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有紫杉醇微生物发酵的菌株的紫杉醇产量仍然较低， 且发酵液中杂质含量多，难以分离提取的问题，而提供了一种抗紫杉醇单克隆抗体的制备 方法。抗紫杉醇单克隆抗体的制备方法按以下步骤实现一、紫杉醇人工抗原的合成与 鉴定；二、利用合成的紫杉醇免疫原免疫Balb/c小鼠，取其效价高且特异性强的小鼠脾细 胞与SP2/0细胞进行细胞融合，培养并筛选出具有分泌特异性抗体的细胞株；三、将筛选的 细胞株注入小鼠腹腔，收获腹水，获得高浓度的单克隆抗体，即完成抗紫杉醇单克隆抗体的 制备；其中步骤二中免疫Balb/c小鼠取体重为10 12g的12周龄雌性Balb/c小鼠 6只进行免疫；首次免疫采用Taxol-BSA与等量福氏完全佐剂混合，注射器互推法乳化完全 后，进行背部皮下多点注射，剂量为每只80μ g ;3周后进行第二次免疫，以后每隔二周加强 免疫一次，换用Taxol-BSA与福氏不完全佐剂等量混合，进行背部皮下多点注射；第三次免 疫后，小鼠断尾取血，用间接ELISA法检测血清效价，直至血清效价达到1 4000 10000 ； 融合前三天，不加佐剂，小鼠尾静脉注射进行强化免疫；步骤三将筛选的细胞株注入小鼠腹腔，收获腹水，获得高浓度的单克隆抗体的具 体步骤如下取体重为10 12g的12周龄的Balb/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂每只 0. 4mL;7d后每只小鼠腹腔注射5X105个杂交瘤细胞；7 10d，待小鼠腹部明显隆起时，取 腹水，2000r/min离心IOmin去除最上层的脂肪组织，吸取上清分装，冻存于-20°C ；采用辛酸-饱和硫酸铵法提纯单克隆抗体。本发明抗紫杉醇单克隆抗体的制备方法简单，效果好，建立了一种灵敏、特异、操 作简单、适于大批量样品分离筛选的检测方法；本发明抗紫杉醇单克隆抗体的产量高达 1 12800，发酵液中杂质含量少，分离提取简单；本发明以抗Taxol单克隆抗体为基础，确 立Taxol免疫学检测方法，为从内生真菌发酵液中迅速、高效地分离、提取和纯化紫杉醇， 为早日实现工业化生产奠定了基础。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式抗紫杉醇单克隆抗体的制备方法按以下步骤实现 一、紫杉醇人工抗原的合成与鉴定；二、利用合成的紫杉醇免疫原免疫Balb/c小鼠，取其效 价高且特异性强的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，培养并筛选出具有分泌特异性 抗体的细胞株；三、将筛选的细胞株注入小鼠腹腔，收获腹水，获得高浓度的单克隆抗体，即 完成抗紫杉醇单克隆抗体的制备；其中步骤二中免疫Balb/c小鼠取体重为10 12g的12周龄雌性Balb/c小鼠 6只进行免疫；首次免疫采用Taxol-BSA与等量福氏完全佐剂混合，注射器互推法乳化完全 后，进行背部皮下多点注射，剂量为每只80μ g ;3周后进行第二次免疫，以后每隔二周加强 免疫一次，换用Taxol-BSA与福氏不完全佐剂等量混合，进行背部皮下多点注射；第三次免 疫后，小鼠断尾取血，用间接ELISA法检测血清效价，直至血清效价达到1 4000 10000 ； 融合前三天，不加佐剂，小鼠尾静脉注射进行强化免疫；步骤三将筛选的细胞株注入小鼠腹腔，收获腹水，获得高浓度的单克隆抗体的具 体步骤如下取体重为10 12g的12周龄的Balb/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂每只 0. 4mL;7d后每只小鼠腹腔注射5X105个杂交瘤细胞；7 10d，待小鼠腹部明显隆起时，取 腹水，2000r/min离心IOmin去除最上层的脂肪组织，吸取上清分装，冻存于-20°C ；采用辛 酸_饱和硫酸铵法提纯单克隆抗体。本实施方式步骤二中筛选出具有分泌特异性抗体的细胞株(单克隆抗体亚型)， 对其进行鉴定，采用间接ELISA鉴定。鉴定结果共筛选到3株能稳定分泌目的抗体的杂交 瘤细胞株，分别命名为Taxo 1-Al、Taxo 1-A2和Taxol_A3，3株单克隆抗体属于IgG2b亚型。本实施方式步骤三中取腹水，采用12号针头从腹股沟上缘插入腹腔中，腹水即从 针头流入到离心管内，一次可获3 5mL腹水。本实施方式制备所得抗紫杉醇单克隆抗体，对其特异性进行鉴定，为了说明所检 测的抗体是特异针对紫杉醇而不是针对载体蛋白BSA，进行特异性试验，包被抗原分别为 TaX0l-BSA、TaX0l标准品、BSA ；根据OD45tl值差异从而判定所产生的抗体的特异性；同时，也 采用蛋白质免疫印迹法Western-Blotting鉴定制备的单克隆抗体特异性，一抗(自制的紫 杉醇单克隆抗体)用封闭液稀释20倍；二抗(HRP标记羊抗鼠IgG)用封闭液稀释5000倍， 鉴定结果本实施方式制备所得抗紫杉醇单克隆抗体为特异针对紫杉醇。本实施方式筛选出具有分泌特异性抗体的细胞株，可以采用悬浮培养系统或细胞 固定化培养系统进行体外培养，能够获得大量的单克隆抗体。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中紫杉醇人工抗 原的合成，采用琥珀酸酐法将购买自Sigma公司的紫杉醇标准品偶联到牛血清白蛋白上制 成完全抗原Taxol-BSA，Taxol-BSA偶联物的鉴定采用薄层层析检测法和紫外波长扫描法。 其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式抗紫杉醇单克隆抗体的制备方法按以下步骤实现 一、紫杉醇人工抗原的合成与鉴定；二、利用合成的紫杉醇免疫原免疫Balb/c小鼠，取其效 价高且特异性强的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，培养并筛选出具有分泌特异性 抗体的细胞株；三、将筛选的细胞株注入小鼠腹腔，收获腹水，获得高浓度的单克隆抗体，即 完成抗紫杉醇单克隆抗体的制备； 其中步骤二中免疫Balb/c小鼠取体重为10 12g的12周龄雌性Balb/c小鼠 6只进行免疫；首次免疫采用Taxol-BSA与等量福氏完全佐剂混合，注射器互推法乳化完全 后，进行背部皮下多点注射，剂量为每只80μ g ;3周后进行第二次免疫，以后每隔二周加强 免疫一次，换用Taxol-BSA与福氏不完全佐剂等量混合，进行背部皮下多点注射；第三次免 疫后，小鼠断尾取血，用间接ELISA法检测血清效价，直至血清效价达到1 4000 10000 ； 融合前三天，不加佐剂，小鼠尾静脉注射进行强化免疫；步骤三将筛选的细胞株注入小鼠腹腔，收获腹水，获得高浓度的单克隆抗体的具 体步骤如下取体重为10 12g的12周龄的Balb/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂每只 0. 4mL;7d后每只小鼠腹腔注射5X105个杂交瘤细胞；7 10d，待小鼠腹部明显隆起时， 用12号针头从腹股沟上缘插入腹腔中，腹水即从针头流入到离心管内，一次可获3 5mL 腹水，2000r/min离心IOmin去除最上层的脂肪组织，吸取上清分装，冻存于_20°C ；采用辛 酸_饱和硫酸铵法提纯单克隆抗体。本实施方式所得抗紫杉醇单克隆抗体，产量高达1 12800。
权利要求
一种抗紫杉醇单克隆抗体的制备方法，其特征在于抗紫杉醇单克隆抗体的制备方法按以下步骤实现一、紫杉醇人工抗原的合成与鉴定；二、利用合成的紫杉醇免疫原免疫Balb/c小鼠，取其效价高且特异性强的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合，培养并筛选出具有分泌特异性抗体的细胞株；三、将筛选的细胞株注入小鼠腹腔，收获腹水，获得高浓度的单克隆抗体，即完成抗紫杉醇单克隆抗体的制备；其中步骤二中免疫Balb/c小鼠取体重为10～12g的12周龄雌性Balb/c小鼠6只进行免疫；首次免疫采用Taxol BSA与等量福氏完全佐剂混合，注射器互推法乳化完全后，进行背部皮下多点注射，剂量为每只80μg；3周后进行第二次免疫，以后每隔二周加强免疫一次，换用Taxol BSA与福氏不完全佐剂等量混合，进行背部皮下多点注射；第三次免疫后，小鼠断尾取血，用间接ELISA法检测血清效价，直至血清效价达到1∶4000～10000；融合前三天，不加佐剂，小鼠尾静脉注射进行强化免疫；步骤三将筛选的细胞株注入小鼠腹腔，收获腹水，获得高浓度的单克隆抗体的具体步骤如下取体重为10～12g的12周龄的Balb/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂每只0.4mL；7d后每只小鼠腹腔注射5×105个杂交瘤细胞；7～10d，待小鼠腹部明显隆起时，取腹水，2000r/min离心10min去除最上层的脂肪组织，吸取上清分装，冻存于 20℃；采用辛酸 饱和硫酸铵法提纯单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种抗紫杉醇单克隆抗体的制备方法，其特征在于步骤一中 紫杉醇人工抗原的合成，采用琥珀酸酐法将购买自Sigma公司的紫杉醇标准品偶联到牛血 清白蛋白上制成完全抗原Taxol-BSA，Taxol-BSA偶联物的鉴定采用薄层层析检测法和紫 外波长扫描法。
全文摘要
一种抗紫杉醇单克隆抗体的制备方法，它涉及一种单克隆抗体的制备方法。本发明解决了现有紫杉醇微生物发酵的菌株的紫杉醇产量仍然较低，且发酵液中杂质含量多，难以分离提取的问题。方法一、紫杉醇人工抗原的合成与鉴定；二、利用合成的紫杉醇免疫原免疫Balb/c小鼠，取其效价高且特异性强的小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，培养并筛选出细胞株；三、将细胞株注入小鼠腹腔，收获腹水，得高浓度的单克隆抗体即完成。本发明抗紫杉醇单克隆抗体的产量高达1∶12800，发酵液中杂质含量少，分离提取简单，为从内生真菌发酵液中迅速、高效地分离、提取和纯化紫杉醇，为早日实现工业化生产奠定了基础。
文档编号C07K16/16GK101962407SQ20101052540
公开日2011年2月2日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者周东坡, 孙宇石, 平文祥, 赵凯, 金涛 申请人:黑龙江大学