本发明涉及一类多烯紫杉醇侧链2′-衍生的新型紫杉烷类抗肿瘤化合物及其合成方法与应用，属于医药卫生领域。
背景技术：
癌症已成为继心脑血管疾病之后人类的第二大致死疾病，同时随着环境的恶化以及人口老龄化，这一问题会更加突出。在我国，情况也不容乐观，2013年发布的中国肿瘤登记年报称，全国范围内癌症发病形势十分严峻，发病率与死亡率均呈持续上升趋势。预计到2020年，中国每年癌症患病总数将达660万，死亡总数将达300万左石。因此，全球范围内，抗肿瘤药物将具有很大的市场需求。据IMS数据统计，自2007年超越降血脂药物后，抗肿瘤药物一直是全球医药市场的领头羊。
事实证明，天然产物是最具潜力的抗肿瘤药物源泉。在过去的二十多年间，有63%的抗肿瘤药物直接或间接来源于天然产物。作为天然产物家族中的重要一员，紫杉醇及其半合成产物多烯紫杉醇无疑是最成功也最具代表性的抗肿瘤药物。
1966年，紫杉醇首次被Wall和Wani从太平洋红豆杉树皮中提取得到，并将其命名为Taxol。因其良好的抗肿瘤活性和独特的机理，紫杉醇在1992年被美国FDA批准用于治疗晚期卵巢癌，两年后又被批准用于治疗转移性乳腺癌。直到目前，紫杉醇和多烯紫杉醇已被证实是最为有效的抗肿瘤药物，在临床上被广泛用于卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌、与AIDS相关的卡波剂氏肉瘤、膀胱癌、前列腺癌、食道癌、脑瘤、喉癌、宫颈癌以及子宫内膜癌等多种类型癌症的治疗。随着研究的深入，其临床适应症必将会进一步扩大。
尽管紫杉醇和多烯紫杉醇是非常重要的抗肿瘤药物，但是，由于水溶性差及其在化疗过程中肿瘤细胞自身发展的多药耐药问题（MDR）而限制了他们在临床上的广泛运用。为了解决肿瘤细胞耐药的问题，扩大紫杉醇和多烯紫杉醇在临床上的应用。同时，为了获得具有选择性的高活性紫杉醇衍生物，就需要对其结构进行改造。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种原料易得、合成简便、具有抗肿瘤活性的多烯紫杉醇侧链2′-衍生的新型紫杉烷类抗肿瘤化合物及其合成方法。
本发明的实现过程如下：
结构通式（I）所示的化合物，
X为N或O；
R为H或乙酰基；
R′为H、硝基、腈基、甲氧基或卤素基。
结构通式（I）所示化合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以天然产物10-去乙酰基巴卡亭（10-DAB）为原料进行10-OH乙酰化，接着用三氯乙氧基甲酰氯（TrocCl）保护7-OH；
（2）用2,2-二甲氧基丙酮或对甲基苯甲醛保护苯基异丝氨酸的2′-OH和3′-NHBoc；
（3）在DCC和DMAP存在下，（1）和（2）的产物进行偶联反应；
（4）在酸性介质中脱去侧链保护基；
（5）在缩水剂存在下，使用取代苯基异噁唑羧酸或取代苯基噁二唑羧酸与侧链2′-OH进行酯化反应；
（6）脱去巴卡亭环上的羟基保护基。
具体地说，含7-OH和10-OH紫杉烷类化合物的合成方法，首先用保护基保护10-DAB中的7-OH和10-OH。
多烯紫杉醇侧链2′-衍生的新型紫杉烷12的合成路线如下式所示。
本发明中所使用的芳基异噁唑羧酸和芳基噁二唑羧酸的结构如下式所示。
部分典型的含多烯紫杉醇骨架的新型紫杉烷类抗肿瘤化合物的结构如下式所示。
根据构效关系，C13侧链C2′-OH对保持多烯紫杉醇的抗肿瘤活性具有重要意义，取代或脱去OH活性会显著降低甚至消失，但酰化后不会失去活性，因为在细胞内可以经过内源酯酶水解释放出活性的多烯紫杉醇。因此，在保证多烯紫杉醇活性部位不变的前提下，发明人将一些含有芳基异噁唑或芳基噁二唑骨架的小分子通过酯化偶联键合在C2′-OH得到C2′-芳基异噁唑和C2′-芳基噁二唑多烯紫杉醇衍生物，在细胞内经水解释放出活性成分。发明人预期通过这样的协同作用，可以提高抗肿瘤活性，或者提高多药耐药肿瘤细胞株的敏感性。基于此，发明人设计合成了一系列芳基异噁唑-多烯紫杉醇和芳基噁二唑多烯紫杉醇衍生物，并在体外通过MTT方法评估其对不同肿瘤细胞和对耐药细胞的细胞毒性。
苯基异丝氨酸甲酯5选择性保护后得6，化合物6中的亚胺基和羟基在偶联之前需要保护，可以选择以下几种保护基：对甲氧基苯甲醛、2,2-二甲氧基丙烷、1,3-二氯丙酮和1,1-二氯丙酮等。
2,2-二甲氧基丙烷结构虽然简单，但发明人发现在后面脱保护过程中选用的脱保护条件也可以使Boc部分脱掉；1,3-二氯丙酮和1,1-二氯丙酮则属于毒性较大的试剂；而对甲氧基苯甲醛原料易得，价格低廉，同时脱保护时条件温和。因此，发明人选用对甲氧基苯甲醛作为保护基，可以高产率地得到保护产物7，水解后定量地得到苯基噁唑啉羧酸8，后者在DCC和DMAP的存在下，于18-52℃与2（Scheme 1）进行脱水缩合，几乎定量地得到化合物9。在TsOH的存在下，脱去9中侧链的对甲氧基苯甲醛保护基，生成化合物10。接下来，10再与芳基异噁唑羧酸在DCC和DMAP存在下缩合得到化合物11。最后，11用锌粉还原除去保护基Troc，得到2′-衍生的新型紫杉烷抗肿瘤化合物12。
含7-OH和10-乙酰化紫杉烷的合成如下式所示，在催化剂存在下，用酰化试剂可以选择性地使10-DAB的10-OH酰化得到产物13，产率几乎是定量的。因为催化剂可与C9和C10的两个氧原子螯合，使C10-OH活化，故优先被酰化。
接着用TrocCl保护13 的7-OH，通过偶联反应和脱保护基等步骤，其过程与合成2′-衍生的新型紫杉烷类抗肿瘤化合物12（Scheme 2）基本相同，只是得到的最终产物是2′-衍生的新型紫杉烷类抗肿瘤化合物18而不是12。
本发明的设计思路是在保持多烯紫杉醇整体骨架包括C13侧链的(2′R,3′S)立体构型不变的情况下，通过酯化作用在C2′-OH位引入这两种生物活性的小分子片段得到一系列新的紫杉烷衍生物，并在体外通过MTT方法评估其对不同肿瘤细胞（正常的和耐药株）的抗增殖活性，筛选出具有较高活性的紫杉烷衍生物做为候选药物。
具体实施方式
实施例1 7,10-diTroc-巴卡亭2的合成
于63-95℃条件下，将三氯乙氧基羰酰氯（TrocCl）20.5 mmol缓慢滴加到用吡啶溶解的10-DAB（10 mmol）1中，磁力搅拌，TLC（石油醚-AcOEt）监测反应完全后将反应液冷却至室温并减压除去吡啶，剩余物用AcOEt/H2O溶解稀释后用HCl调溶液pH为中性。溶液静置分层，分出有机相，水相用AcOEt萃取，合并有机相并依次用H2O、饱和食盐水洗涤、无水MgSO4干燥，经减压除去溶剂得粗品，经柱层析得到7,10-diTroc-巴卡亭2，产率：87.4%，m.p. 233.1-234.2℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.13 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.63 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 6.40 (s, 1H), 5.73 – 5.55 (m, 2H), 5.05 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 5.00 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.82 (dd, J = 9.6, 2H), 4.63 (dd, J = 9.6, 2H), 4.34 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.17 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.03 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 3.54 – 3.46 (m, 1H), 2.72 – 2.59 (m, 1H), 2.31 (s, 5H), 2.14 (s, 3H), 2.09 – 2.01 (m, 1H), 1.84 (s, 3H), 1.71 (s, 1H), 1.15 (s, 3H), 1.10 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.77, 166.96, 153.24, 153.18,146.52, 133.77, 130.09, 129.22, 128.68, 94.57, 94.40, 83.82, 80.46, 78.68, 77.15, 77.08, 76.60, 76.36, 74.28, 67.83, 60.57, 56.19, 42.75, 38.46, 33.25, 26.68, 22.56, 21.12, 20.18, 15.31, 14.27, 10.64. HRMS(FAB): calcd for C35H38Cl6O14 (M+NH4+): 912.0707, found: 912.0709.
实施例2 10-Ac-巴卡亭13的合成
将醋酸酐0.2 mol加入用无水THF 80 mL溶解的10-DAB 10 mmol和ZnCl2 20 mmol溶液中，室温条件下反应，TLC监测反应完全后向其中加入AcOEt/H2O并用糊状NaHCO3调溶液pH为碱性。静置分层，分出有机相，水相用AcOEt萃取，合并有机相并依次用H2O、饱和食盐水洗涤、无水MgSO4干燥，经减压除去溶剂得粗品，重结晶后得到10-Ac-巴卡亭13纯品，系白色固体，产率：93%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.12 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.63 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 6.34 (s, 1H), 5.64 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 5.00 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 4.90 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.48 (dd, J = 10.5, 6.8 Hz, 1H), 4.32 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.17 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 3.89 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 2.66 – 2.46 (m, 2H), 2.34 – 2.28 (m, J = 7.1 Hz, 5H), 2.26 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 1.95 – 1.82 (m, 2H), 1.73 (s, 1H), 1.68 (s, 3H), 1.12 (s, 6H).13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 204.19, 171.37, 170.67, 167.06, 146.45, 133.70, 131.79, 130.10, 129.32, 128.65, 84.46, 80.77, 79.08, 76.44, 76.24, 74.92, 72.30, 67.92, 58.69, 46.14, 42.70, 38.61, 35.60, 26.96, 22.59, 20.92, 15.60, 9.44.
实施例3 7-Troc-10-Ac-巴卡亭14的合成
于50-93℃条件下，将三氯乙氧基羰酰氯（TrocCl）9.8 mmol缓慢滴加到用吡啶溶解的化合物13（9.3 mmol）中，磁力搅拌，TLC监测反应完全后将反应液冷却至室温并除去吡啶，剩余物用AcOEt/H2O溶解稀释后用HCl调解溶液pH为弱碱性。溶液静置分层，分出有机相，水相用AcOEt萃取，合并有机相并依次用H2O、饱和食盐水洗涤、无水MgSO4干燥，除去溶剂得粗品，经柱层析得到7-Troc-10-Ac-巴卡亭12，产率84.2%。m.p.154.8-158.2℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.11 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.63 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.50 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 6.40 (s, 1H), 5.73 – 5.55 (m, 2H), 5.05 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 5.00 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.89 (dd, J = 13.9, 5.3 Hz, 1H), 4.66 (dd, J = 12.0, 0.9 Hz, 1H), 4.34 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.17 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.03 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 3.54 – 3.46 (m, 1H), 2.72 – 2.59 (m, 1H), 2.31 (s, 5H), 2.18 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.09 – 2.01 (m, 1H), 1.84 (s, 3H), 1.71 (s, 1H), 1.15 (s, 3H), 1.10 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 201.98, 170.77, 169.20, 166.96, 153.24, 145.07, 133.77, 131.60, 130.09, 129.22, 128.68, 94.57, 83.82, 80.46, 78.68, 76.32, 75.92, 74.28, 67.83, 65.87, 56.19, 47.39, 42.75, 38.46, 33.25, 26.68, 22.56, 20.82, 20.18, 15.27, 10.64. HRMS(FAB): calcd for C34H39Cl3O13 (M+NH4+): 778.1800, found: 778.1804.
实施例4 (2′R,3′S)-N-Boc-苯基异丝氨酸甲酯6的合成
将用CH2Cl2溶解的(Boc)2O 50 mmol加入用CH2Cl2/H2O溶解的(2′R,3′S)-苯基异丝氨酸甲酯50 mmol和氢氧化钾3.58 g溶液中，室温下反应进行，TLC监测反应完全后向反应液中加入H2O，静置分层，分出有机相，水相用CH2Cl2萃取，合并有机相并用水洗涤、无水MgSO4干燥。除去溶剂得粗品，重结晶得到(2′R,3′S)-N-Boc-苯基异丝氨酸甲酯，产率93.2%。
实施例5 苯基噁唑啉羧酸甲酯化合物7的合成
将46.4 mmol化合物6、对甲氧基苯甲醛51 mmol和对甲苯磺酸吡啶嗡0.1 g用甲苯溶解、回流，TLC监测反应完全后冷却至室温，除去溶剂得到化合物7。
实施例6 苯基噁唑啉羧酸8的合成
将上述产物7用MeOH溶解，加入稀NaOH，室温下搅拌，TLC监测反应完全后除去MeOH，剩余物用AcOEt/H2O溶解稀释，静置分层。向水相中加入AcOEt，并用稀盐酸调节pH为酸性。混合液静置分层，分出有机相，水相用AcOEt萃取，合并有机相并水洗涤、无水MgSO4干燥，除去溶剂，得到苯基噁唑啉羧酸8，两步总产率92%，m.p.132-133℃。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.50 – 7.31 (m, 7H), 6.94 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.41 (s, 1H), 5.42 (s, 1H), 4.64 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 172.73, 160.44, 151.71, 128.89, 128.33, 128.17, 126.32, 114.00, 92.44, 82.57, 81.14, 63.68, 55.32, 27.82.
实施例7 偶联产物9的合成
将11 mmol苯基噁唑啉羧酸 8、10 mmol 7,10-diTroc-巴卡亭2、20 mmol DCC和1 mmol DMAP用CH2Cl2溶解，室温下反应至反应完全。滤出不溶物，滤液经减压除去溶剂得到偶联产物 9。
实施例8 脱侧链保护基产物10的合成
将上述偶联产物粗品和对甲苯磺酸10 mmol用MeOH溶解，室温下反应，TLC监测反应完全。反应液经减压除去溶剂得脱侧链保护基产物粗品，用柱层析纯化，得白色粉末产物10。
：两步总产率：92.1%。m.p.（159.5-161.2℃）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.12 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.64 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.52 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.46 – 7.32 (m, 5H), 6.30 – 6.18 (m, 2H), 5.71 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.62 – 5.52 (m, 1H), 5.46 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.34 – 5.23 (m, 1H), 4.97 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 4.93 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.80 (d, J = 1.2 Hz, 2H), 4.69 – 4.57 (m, 2H), 4.35 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.19 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 3.93 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 2.71 – 2.58 (m, 1H), 2.41 (s, 3H), 2.34 (s, 2H), 2.13 – 2.03 (m, 1H), 1.97 (s, 4H), 1.87 (s, 3H), 1.72 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 1.37 (s, 9H), 1.29 (s, 3H), 1.22 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 200.77, 170.39, 166.90, 155.41, 153.22, 142.56, 133.85, 131.98, 130.19, 128.94, 128.89, 128.76, 128.13, 126.78, 94.19, 83.67, 80.76, 80.29, 79.16, 78.64, 76.38, 74.16, 73.56, 72.26, 56.23, 46.88, 43.15, 35.29, 33.28, 28.21, 26.32, 22.54, 20.97, 14.71, 10.72. HRMS(FAB): calcd for C49H55Cl6NO18 (M+NH4+): 1175.1865, found: 1175.1835.
实施例9 C2′-芳基异噁唑-多烯紫杉醇偶联产物11的合成
将不同取代的0.11 mmol芳基异噁唑羧酸、0.1 mmol化合物10、0.2 mmol DCC和10 mg DMAP用CH2Cl2溶解，室温条件下反应大约1 h-4.5 h，TLC（石油醚-AcOEt）监测反应。滤出不溶物，滤液经减压除去溶剂得C2′-芳基异噁唑-多烯紫杉醇偶联产物11粗品，未经纯化直接用于下一步反应。
实施例10 C2′-衍生的新型紫杉烷类抗肿瘤化合物12的合成
将0.1 mmol偶联产物11粗品、2 mmol Zn粉和0.26 mL AcOH用AcOEt溶解，室温下反应，TLC监测反应。滤出Zn粉，滤液用饱和NaHCO3溶液调pH为碱性。混合液静置分层，分出有机相，水相用AcOEt萃取，合并有机相并用水洗涤，无水MgSO4干燥，除去溶剂得粗品，经柱层析纯化，得目标产物12。
：两步总产率79.2%。m.p.（154.6-156.4℃）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.12 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.85 (br, s, 1H), 7.61 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.52 (br, s, 5H), 7.46 – 7.37 (m, 5H), 7.35 (br, s, 1H), 6.47 – 6.14 (m, 1H), 5.70 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 5.65 – 5.48 (m, 2H), 5.25 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.07 – 4.89 (m, 1H), 4.38 – 4.18 (m, 4H), 3.94 (dd, J = 18.3, 6.8 Hz, 1H), 2.67 – 2.54 (m, 1H), 2.49 (s, 1H), 2.39 (s, 2H), 2.27 (s, 1H), 2.00 (s, 3H), 1.86 (s, 2H), 1.77 (s, 3H), 1.36 (s, 9H), 1.25 (s, 6H), 1.14 (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 211.41, 170.32, 169.71, 167.15, 167.01, 163.18, 159.33, 155.68, 155.38, 138.90, 138.45, 135.83, 133.69, 130.92, 130.80, 130.18, 129.19, 129.09, 128.83, 128.72, 128.05, 127.60, 126.92, 126.76, 126.55, 108.95, 84.20, 81.07, 78.92, 78.80, 76.01, 75.02, 74.83, 74.51, 72.53, 71.93, 65.59, 57.63, 49.25, 46.45, 43.10, 36.93, 35.75, 33.89, 30.57, 28.17, 26.46, 26.36, 25.60, 24.91, 22.69, 22.57, 20.91, 19.19, 14.29, 13.73, 9.91. HRMS(FAB): calcd for C53H58N2O16 (M+H+): 979.3865, found: 979.3847.
实施例11 体外抗肿瘤细胞增殖活性评价
发明人采用不同的肿瘤细胞株Hela（宫颈癌细胞）、A549（肺癌细胞）、A2780（卵巢癌细胞）、MCF-7（乳腺癌细胞）以及多药耐药肿瘤细胞株A2780-MDR和MCF-7-MDR等6种细胞株，以多烯紫杉醇（Docetaxel）作为阳性对照，通过MTT方法评价16个新型芳基异噁唑-多烯紫杉醇衍生物对不同肿瘤细胞的抗增殖活性。
对于A549细胞，化合物12f、12g、18b、18d和18f表现出与多烯紫杉醇相似的抑制活性。对于A2780细胞，化合物12d、12h、18a、18b、18d、18e、18g和18h表现出较好的抑制活性，其中12d、18b和18d的抑制活性比多烯紫杉醇强2倍。对于MCF-7细胞，化合物12c、12d、12f、12g、18a、18b、18d、18g和18h表现出与多烯紫杉醇相似的活性。
从横向分析，化合物18b对Hela、A549、A2780和MCF-7均表现出较好的抑制活性，其中对Hela细胞的抑制活性比多烯紫杉醇强3倍。化合物18c虽然对A549、A2780和MCF-7没有表现出较好的抑制活性，但是其选择性抑制Hela细胞的能力比多烯紫杉醇强4倍。化合物18g除了对A549表现不佳外，对Hela、A2780和MCF-7均表现出较好的活性。值得注意的是，化合物18h表现出选择性优先抑制Hela细胞的能力，其活性比多烯紫杉醇强5倍。
整体上看，C10位被乙酰化的化合物的抑制活性要好于没有被乙酰化的，这在18a、18b、18c、18g和18h对Hela细胞的抑制活性中表现的尤其明显。这说明C10乙酰化在一定程度上可以增加这些化合物对肿瘤细胞的抑制活性。
更为重要的是，所有这些化合物均不同程度提高了两个耐药肿瘤细胞A2780-MDR和MCF-7-MDR对多烯紫杉醇的敏感性。对于A2780-MDR细胞来说，化合物12c、12d、12e、12g和12d表现较好，其中化合物12g的活性比多烯紫杉醇强15倍。对于MCF-7-MDR，化合物18f和18h的抑制活性比多烯紫杉醇强10倍。
根据以上结果，发明人认为C2′-芳基异噁唑-多烯紫杉醇衍生物在细胞内经水解释放出活性成分，两部分共同发挥作用，使抗肿瘤活性有所提高。至于二者之间是相互独立或者相互协同发挥作用还需进一步研究。