本发明属于有机化学
技术领域：
，具体涉及一种螺环化合物及其药物用途。
背景技术：
：近年研究表明，法尼醇X受体(FXR)激动剂，具有抗淤胆、抗纤维化的效果。FXR是一种核受体，是一种胆酸的传感器，可调控胆酸的合成和胆汁在肝内的流动，同时对于胆汁内环境稳定、脂质代谢、糖代谢以及炎症/免疫应答都有作用。研究数据表明，6-α-乙基鹅去氧胆酸(6-ECDCA，OCA)对于FXR的激活作用是鹅去氧胆酸的100倍，临床研究表明，OCA可以用于治疗原发性胆汁性肝硬化(PBC)、门静脉高压(Portalhypertension)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、胆汁酸性腹泻(Bileaciddiarrhea)、酒精性肝炎、原发性硬化性胆管炎(PSC)等与胆汁分泌有关的疾病(DrrugDiscoveryToday.Volume17，Numbers17/18，2012)。然而，胆酸类化合物OCA在临床上已经出现比较明显的副作用：一是瘙痒副作用比较严重，OCA组141例患者中有33例(23％)发生瘙痒，而安慰剂组142例患者中有9例(6％)出现瘙痒(P＜0.0001)；二是升高了低密度脂蛋白胆，这可能会带来一些不可接受的副作用。因此，开发一种非胆酸类的小分子FXR激动剂，可能可以在保持药效的同时避免OCA的瘙痒、低密度脂蛋白增加等副作用。大量的文献已经报道了各种FXR小分子激动剂：WO2000037077、WO2008025539、Bioorg.Med.Chem.Lett.19(2009)2595-2598、Bioorg.Med.Chem.Lett.19(2009)4733-4739、WO2009012125、WO2011020615、WO2012087519、WO2013007387。虽然这些FXR激动剂已经显示了一些激动活性，但这些化合物各自都存在一些缺点，如FXR激动剂GW4064，其生物利用度低、半衰期短；其结构中的反式二苯乙烯是潜在的毒性基团(toxicology，1981，22(2)，149-160；ToxicolAppl.Pharmacol.2000，167(1)，46-54)；反式二苯乙烯中的烯键对于紫外光不稳定，从而也存在潜在的毒性问题。因此，有必要开发一些新型的FXR激动剂，改善成药性质。本发明提供的这类螺环类化合物，其成药性质通常优于GW4064，其化学结构式如下所示。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有FXR激动剂成药性方面的不足，提供一类新的能够改善成药性质的化合物，更适用于治疗、抑制或改善法尼醇X受体介导的疾病。为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：一种式(I)的化合物，其药学上可接受的盐，或者它们的对映异构体、非对映异构体、互变异构体、消旋体、溶剂化物、N-氧化物或氨基酸共轭物：其中，R1选自5-10元芳环基或5-10元杂芳环基，其中，每一个基团可被1-3个R4取代；R2选自氢、C1-3烷基、卤C1-3烷基或C3-6环烷基，其中C3-6环烷基可被C1-3烷基、卤C1-3烷基取代；Z选自5-10元芳环基或5-10元杂芳环基，其中，每一个基团可被1-3个R4取代；R3选自-CO2R5、-CONR5R6、-CONR5SO2R6、-CONR5(CR7)1-4CO2R5、-SO2R5或四唑；R4选自卤素、C1-6烷基、卤C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤C1-6烷氧基或C3-6环烷基；R5、R6、R7独立地选自氢、C1-6烷基、卤C1-6烷基、C3-6环烷基或卤C3-6环烷基。根据本发明，R2优选为环丙基。根据本发明，R1优选为可被1-3个R4取代的苯基；其中，R4选自卤素、C1-6烷基、卤C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤C1-6烷氧基或C3-6环烷基。根据本发明，Z优选为苯基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、呋喃基、恶唑基、噻吩基、噻唑基、吡唑、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、眯唑[1，2-a]吡啶基、吡咯[1，2-b]吡嗪基、吲哚基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并恶唑基、萘基、喹啉基、异喹啉基，其中，每一个基团可被1-3个R4取代；所述的R4选自卤素、C1-6烷基、卤C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤C1-6烷氧基或C3-6环烷基。根据本发明，R3优选为-CO2R5，其中，R5选自氢或C1-6烷基，更优选地，R5独选自氢。根据本发明，典型的化合物举例如下：3-(5-((5-环丙基-3-(2，6-二氯苯基)异恶唑-4-位)甲氧基)六氢环戊[c]吡咯-2(1H)-位)苯甲酸4-(5-((5-环丙基-3-(2，6-二氯苯基)异恶唑-4-位)甲氧基)六氢环戊[c]吡咯-2(1H)-位)苯甲酸6-(5-((5-环丙基-3-(2，6-二氯苯基)异恶唑-4-位)甲氧基)六氢环戊[c]吡咯-2(1H)-位)烟酸2-(5-((5-环丙基-3-(2，6-二氯苯基)异恶唑-4-位)甲氧基)六氢环戊[c]吡咯-2(1H)-位)苯并[d]噻唑-6-甲酸5-(5-((5-环丙基-3-(2，6-二氯苯基)异恶唑-4-位)甲氧基)六氢环戊[c]吡咯-2(1H)-位)-1-异丙基-1H-吡唑-3-甲酸5-(5-((5-环丙基-3-(2，6-二氯苯基)异恶唑-4-位)甲氧基)六氢环戊[c]吡咯-2(1H)-位)-1-萘甲酸6-(5-((5-环丙基-3-(2，6-二氯苯基)异恶唑-4-位)甲氧基)六氢环戊[c]吡咯-2(1H)-位)-1-甲基-1H-吲哚-2-甲酸及其药学上可接受的盐，或者它们的对映异构体、非对映异构体、互变异构体、消旋体、溶剂化物、N-氧化物或氨基酸共轭物。本发明进一步提供所述化合物的甘氨酸、牛磺酸或酰基葡糖苷酸共轭物。本发明还进一步提供所述化合物、其药学上可接受的盐，或者它们的对映异构体、非对映异构体、互变异构体、消旋体和溶剂化物中的一种或多种在制备胆汁调节分泌调节剂或FXR核受体活性调节剂中的应用。本发明进一步提供所述化合物、其药学上可接受的盐，或者它们的对映异构体、非对映异构体、互变异构体、消旋体和溶剂化物中的一种或多种在制备预防和/或治疗胆固醇性胆结石症、原发性胆汁性肝硬化、门静脉高压、非酒精性脂肪肝炎、胆汁酸性腹泻、酒精性肝炎、原发性硬化性胆管炎或动脉粥样硬化，或者与胆汁分泌有关疾病的药物中的应用。本发明进一步提供一种药物组合物，其包括第一治疗剂和药学可接受基质，其中第一治疗剂为选自本发明所述的化合物，或其药学上可接受的盐，或者它们的对映异构体、非对映异构体、互变异构体、消旋体和溶剂化物中的一种或多种的组合。进一步地，所述药物组合物还可以包括第二治疗剂，所述第二治疗剂为选自治疗胆汁淤积等药物中的一种或多种的组合。本发明还提供一种用所述组合物预防和/或治疗胆固醇性胆结石症、原发性胆汁性肝硬化、门静脉高压、非酒精性脂肪肝炎、胆汁酸性腹泻、酒精性肝炎、原发性硬化性胆管炎或动脉粥样硬化，或者与胆汁分泌有关疾病的方法。本发明中，如果无另外说明，用于本发明申请，包括说明书和权利要求书中的术语，定义如下。必须注意，在说明书和所附的权利要求书中，如果文中无另外清楚指示，单数形式“一个”包括复数意义。如果无另外说明，使用质谱、核磁、HPLC、蛋白化学、生物化学、重组DNA技术和药理的常规方法。术语“烷基”指直链或支链饱和的、含有1～10个碳原子(较佳地1～6个碳原子)的脂族烃类基团；C1～Cn烷基则表示1～n个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团(例如“C1～C10烷基”，是指该基团为烷基，且烷基的碳链碳原子数量在1～10之间，即含1个碳原子、2个碳原子或3个碳原子等，直至包括10个碳原子的烷基。而该1～10的限制并不包括烷基上的取代的碳原子数，如取代烷氨基中的“烷基”，当没有特别限制其碳原子数时，仅指其中指明的烷基部分的碳原子数为1～10，而并不包括烷基上的取代基的碳原子数以及氨基上的其他取代基的碳原子数。术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。术语“元环”包括任何环状结构。术语“元”意为表示构成环的骨架原子的数量。这样，如，环己基、吡啶基、吡喃基和噻喃基是六元环；环戊基、吡咯基、呋喃基和噻吩基是五元环。术语“任选取代”或“取代”指参考基团可以被一个或多个额外基团所取代，额外基团单独地且独立地选自于下列基团中的一个或多个：C1～C10烷基、C3～C20环烷基、C5～C10芳基、C5～C10杂芳基、C2～C20杂脂环烃、羟基、C1～C5烷氧基、烷硫基、芳硫基、烷亚砜基、芳亚砜基、烷砜基、芳砜基、氰基、卤基、羰基、硫代羰基、硝基、卤烷基、氟烷基或氨基(包括单取代和双取代的胺基基团及其被保护的衍生物)，当取代基为多个时，所述的取代基相同或不同。举例说明，任选取代可以是卤化物、-CN、-NO2或LsRs，其中每个Ls独立的选自于下列一个键：-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NH-、-NHC(＝O)-、-C(＝O)NH-、S(＝O)2NH-、-NHS(＝O)2、-OC(＝O)NH-、-NHC(＝O)O-或-(C1～C10烷基)；每个Rs选自于氢、烷基、氟烷基、杂烷基、环烷基、芳基、杂芳基或杂环烷基。可以形成以上取代基的保护衍生物的保护基可以参考Greene和Wuts。一方面，任选取代基选自于卤素、三氟甲基、羟基、氰基、硝基、-SO3H、-SO2NH2、-SO2Me、-NH2、-COOH、-CONH2、C1～C5烷氧基、-N(CH3)2和C1～C10烷基。在某些具体实施例中，所述化合物具有一个或多个立体构中心，且每个中心以R或S型独立存在。在此提到的化合物包括所有非对映体，对映体，差向构体和它们的混合物。立体异构体可通过如手性色谱柱对立体异构体分离的方法得到。本文所述的方法和分子式包括使用N-氧化物(如果合适)，结晶形式(也被称为多晶型)或通式I化合物的药学上可接受的盐，和具有相同活性的这些化合物的活性代谢物。在某些情况下，化合物可能作为互变异构体而存在。所有的互变异构体包括在此提到的化合物的范围之内。在某个具体实施例中，所述化合物以溶剂化物形式存在，药学上可接受的溶剂如水或乙醇等。在其它具体实施例中，所述化合物以非溶剂化形式存在。术语“前药”是指一个药物分子的生物转化衍生物，它在体内经过酶或化学的转化释放出活性母药，然后活性母药发挥期望的药效。关于前药也有其他的描述，例如J.Rautio等的文献(NatRevDrugDiscov.，2008Mar；7(3)：255-70)，据此通过引用将上述文献完整地并入。如本文所用的术语“盐”是指含阳离子和阴离子的化合物，其可通过可接受质子部位的质子化和/或可供质子部位的去质子化来产生。值得注意的是，可接受质子部位的质子化导致形成阳离子类物质，其电荷通过生理阴离子的存在而平衡，而可供质子部位的去质子化导致形成阴离子类物质，其电荷通过生理阳离子的存在而平衡。术语“药学上可接受的盐”指盐是药学上可接受的。药学上可接受的盐的例子包括但不限于：(1)酸加成盐，与无机酸形成，如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等等；或与有机酸形成，如羟基乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙烷磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4对甲苯磺酸、樟脑酸、十二烷基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、水杨酸、顺式-已二烯二酸等等；或(2)碱加成盐，和上述无机酸的任一种的共轭碱形成，其中共轭碱包含选自Na+、K+、Mg2+、Ca2+、NHgR”’4-g+中的阳离子组分，其中R”’是C1-3烷基，g是选自0、1、2、3或4的整数。应该理解，所有涉及药学上可接受的盐都包括相同酸加成盐的本文中所定义的溶剂加成形式(溶剂化物)或晶体形式(多晶型物)。术语“制剂”或“剂型”特指包括活性化合物的固体和液体配方且本领域的技术人员将了解活性成分可以不同制剂形式存在，这取决于所需剂量及药代动力学参数。术语“可接受的”，如本文所用，指一个处方组分或活性成分对一般治疗目标的健康没有过分的有害影响。术语“受试者”或“病人”包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，哺乳类：人、非人灵长类如猩猩、猿及猴类；农业动物如牛、马、山羊、绵羊、猪；家畜如兔、狗；实验动物包括啮齿类，如大鼠、小鼠及豚鼠等。非哺乳类动物包括但不限于，鸟、鱼等。在一优选例中，所选哺乳动物是人。“核受体”是指通常与其他转录因子一起活化或抑制细胞核中一个或多个基因的转录(但也可具有第二信使信号传导作用)的受体。核受体由受体的天然同源配体活化。核受体通常见于细胞质或细胞核中，而非膜结合的。法尼醇X受体(FXR)是核受体超家族的一员，它主要表达在肠道系统之中，参与胆汁酸代谢与胆固醇代谢等重要环节。在自然环境中其配体包括初级胆汁酸鹅去氧胆酸、次级胆酸石胆酸、去氧胆酸等。“治疗有效量”是指在给予受试者时足以有效治疗本文所述的疾病或病症的化合物的量。虽然构成“治疗有效量”的化合物的量将根据化合物、病症及其严重度、以及欲治疗受试者的年龄而变化，但可由本领域技术人员以常规方式确定。“调节(modulating/modulate)”是指治疗、预防、抑制、增强或诱导功能、病况或病症。如本文所用的“治疗(treating/treatment)”涵盖治疗受试者(优选人类)中本文所述的疾病或病症，并且包括：i.抑制疾病或病症，即，阻止其发展；或ii.缓解疾病或病症，即，引起病症消退。“受试者”是指患有或可能患有一种或多种本文所述的疾病和病症的温血动物，如哺乳动物，优选人类或人类儿童。“胆汁性肝硬化”是指因胆道阻塞，胆汁淤积而引起的肝硬化，分原发性胆汁性肝硬化(PBC)和继发性胆汁性肝硬化。一般认为原发性胆汁性肝硬化是一种自身免疫性疾病。“门静脉高压”是指一组由门静脉压力持久增高引起的症候群。大多数由肝硬化引起，少数继发于门静脉主干或肝静脉梗阻以及原因不明的其他因素。当门静脉血不能顺利通过肝脏回流入下腔静脉就会引起门静脉压力增高。“非酒精性脂肪性肝病”是指一种与胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)和遗传易感密切相关的代谢应激性肝脏损伤，其病理学改变与酒精性肝病(alcoholicliverdisease，ALD)相似，但患者无过量饮酒史，疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholicsimplefattyliver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)及其相关肝硬化和肝细胞癌。“胆汁酸性腹泻”是指回肠吸收胆汁酸障碍时，大量胆汁酸到达结肠所引起的腹泻。“酒精性肝炎”是指长期过量饮酒所致的一种肝脏疾病。其主要临床特征是恶心、呕吐、黄疸、肝脏肿大和压痛，可并发肝功能衰竭和上消化道出血等。“原发性硬化性胆管炎”是指慢性胆汁淤积性疾病，其特征为肝内外胆管炎症和纤维化，进而导致多灶性胆管狭窄。大多数患者最终发展为肝硬化、门静脉高压和肝功能失代偿。术语“包括”、“诸如”、“例如”等意指示例性实施方案并且不限制本发明的范围。如本文所用，某一化合物或药物组合物，给药后，可以使某一疾病、症状或情况得到改善，尤指其严重度得到改善，延迟发病，减缓病情进展，或减少病情持续时间。无论固定给药或临时给药、持续给药或断续给药，可以归因于或与给药有关的情况。在本说明书中被描述的所有特征(包括任何所述的权利要求、摘要和图)，和/或任何方法或过程中涉及的所有步骤，均有可能以任意一种组合存在，除非某些特征或步骤在同一组合中是相互排斥的。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明的FXR受体激动剂活性高，代谢稳定，更适用于治疗、抑制或改善法尼醇X受体。具体实施方式以下的实施例用于为本领域中的普通技术人员提供有关如何实施和使用本发明的完整披露和描述，并且这些例子并非意在对发明人所认为的发明范围进行限制，亦非意指下文的实验是被实施的全部实验而且是仅可实施的实验。实验例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件，实施例中所用化学试剂均为分析纯试剂，购买自国药集团。实施例1.制备3-(5-((5-环丙基-3-(2，6-二氯苯基)异恶唑-4-位)甲氧基)六氢环戊[c]吡咯-2(1H)-位)苯甲酸(01)化合物01按照下列流程制备：将酮(1.000g，0.0044mol，1eq)溶解于10mL甲醇，冰浴下分批加入硼氢化钠(0.503g，0.0133mol，3eq)，加毕冰浴下反应30min，TLC显示原料转化完毕，浓缩干，滴入水和稀盐酸淬灭，乙酸乙酯萃取三遍，有机层合并水洗，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩干得类白色固体0.990g。中间体1-3：将1-2(0.990g，0.0044mol，1.5eq)加入10mL无水四氢呋喃，冰浴下加入18-冠-6(1.305g，0.0049mol，1.7eq)和叔丁醇钾(550mg，0.0049mol，1.7eq)，冰浴下搅拌30min。将此溶液滴加入化合物1-1(0.949g，0.0029mol，1.0eq)的10mL无水THF溶液，冰浴保持0度，滴毕自然升至室温搅拌过夜。TLC显示原料转化完毕，加水淬灭乙酸乙酯萃取得粗品，硅胶柱层析(PE/EA＝4/1)得白色固体0.930g。中间体1-4：将中间体1(0.930g，0.0019mol)溶解于5ml二氯甲烷中，室温下加入5ml三氟乙酸，室温下搅拌2小时，TLC显示原料转化完毕，减压浓缩干，加入饱和碳酸钠淬灭，乙酸乙酯萃取三遍，有机层合并后分别用水和食盐水洗涤一遍，干燥后浓缩干得淡黄色油状物635mg，直接用于下一步。中间体1-6：将中间体1-4(150mg，0.381mmol)和5ml乙腈加入闷罐中，加入中间体1-5(200mg，0.762mmol，2eq)和三乙胺(77mg，0.762mmol，2eq)和醋酸铜(76mg，0.381mmol，1eq)。将体系加热到80度搅拌过夜。TLC显示中间体2转化完全，加水淬灭，乙酸乙酯萃取三遍，有机层合并，依次用水和食盐水洗涤一遍，干燥后浓缩干，硅胶柱层析(PE/EA＝10/1，5/1)得淡黄色油状物105mg。化合物01：将中间体：1-6(105mg，0.199mmol，1.0eq)，溶解于5mlTHF和5mlMeOH，加入氢氧化钾(0.034mg，0.597mmol，3.0eq)，和1ml水，加热至90度搅拌4小时，TLC显示原料转化完毕。浓缩去甲醇和THF，残留物加水溶解，水层用MTBE洗涤两次后用1N盐酸调节PH＝2，EA萃取(20ml*2)，干燥后浓缩干得棕色固体48mg。1HNMR(400MHz，CD3Cl)δ：7.44-7.42(m，1H)，7.39-7.20(m，5H)，6.78(d，J＝7.2，1H)，4.21(s，2H)，3.91-3.88(m，1H)，3.44-3.40(m，2H)，3.14-3.11(m，2H)，2.66-2.60(m，2H)，2.10-2.03(m，3H)，1.40-1.20(m，4H)，1.08-1.05(m，2H).ESI-MSm/z：511.3(M-H)-。中间体1-1的制备：中间体1-8：在0℃下，将3mol/L的氢氧化钠溶液(21ml，0.063mol，1.1eq)滴入悬浮的3.3ml水的盐酸羟胺(4.37g，0.063mol，1.1eq)溶液中。再将该混合溶液滴入50ml乙醇与2，6-二氯苯甲醛(10g，0.057mol，1.0eq)的混合溶液中，滴毕，加热到90℃过夜。反应完毕，反应液浓缩干，浓缩干的固体加入29.3ml(H2O∶EtOH＝10∶1)的溶液，打浆析晶后过滤，滤饼抽干，以45℃真空干燥，得到中间体1-8，白色固体10.48g，收率96.5％。中间体1-9将2，6-二氯苯甲羟胺(10.48g，0.055mol，1.0eq)溶于63mlDMF中，分批加入N-氯代丁二酰亚胺(7.36g，0.28mol，1.0eq)。加毕，在40℃搅拌1h。反应液反应完毕，冷却到室温，在0℃倒入200ml的冰水中，用200ml的甲基叔丁基醚萃取一次，水层放弃。有机层盐水洗，无水硫酸钠干燥，在30℃蒸发干形成固体油状，用6ml正己烷捣碎析晶，形成固体过滤，滤饼真空干燥得中间体8-1-2，黄色固体12.10g，收率为97.7％。中间体1-10将三乙胺(10.91g，0.11mol，2.0eq)加到3-环丙基-3-氧代丙酸甲酯(7.66g，0.054mol，1.0eq)的混合物中，在室温下搅拌30min，再冷到10℃。将中间体1-9(12.10g，0.054mol，1.0eq)用24.2mL乙醇溶解，再缓慢加入上述反应液中，内温不超24℃。此外，该反应在室温下搅拌过夜。反应完后，反应液用45mlEA稀释，用15ml水洗，分液，水层用乙酸乙酯萃取一次，合并有机层，用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩到总量的10％，形成沉淀，用乙醚捣碎打浆，过滤，滤饼真空拉干，得中间体1-10，白色固体8.48g，收率为54％。中间体1-11：将1.5mol/L的二异丁基氢化铝(38ml，0.057mol，2.1eq)的甲苯溶液滴入到中间体1-10(8.48g，0.027mol，1.0eq)和54mlTHF的混合溶解的溶液中，控温在0℃左右。加毕，室温搅拌2h。反应完毕加入1.8g的甲醇，搅拌10min，再滴加入27ml水和54mlEA。形成的沉淀通过硅藻土过滤，母液真空拉干。固体加入正己烷捣碎，过滤，滤饼真空下干燥得中间体1-11，白色固体8.46g。中间体1-1：将8.46g的中间体1-11(8.46g，0.030mol，1.0eq)和60mlDCM溶解，加入三苯基膦(11.71g，0.045mol，1.5eq)，混合液冷却到0-10℃，分批加入四溴化碳(14.82g，0.045mol，1.5eq)。反应液在室温下搅拌2h。反应完毕，反应液拌样，柱层析纯化PE∶EA＝10∶1，得到中间体1-1，白色晶体7.35g，收率为71.2％。实施例2.化合物2～7参照实施例1描述的步骤制备，仅对反应原料进行相应的替换，以得到目标化合物。化合物编号、化合物结构和HNMR/MS细节列于表1：表1化合物编号、化合物结构和HNMR/MS结果实施例3法尼醇X受体(FXR)激活试验采用FXR报告基因方法来测试本发明化合物的激活活性，方法如下：I.细胞培养a.胰蛋白酶化，在10ml完全基质中以适当的密度接种细胞。b.在37℃、5％CO2条件下培养细胞24小时。II.细胞接种和转染用FuGENEHD作为转染试剂。a.按照下表制备转染混合物。pBIND-FXR(ng/well)25pG5Luc(ng/well)25FuGENEHD(ul/well)0.15NoFBSmedia(ul/well)1.85Totalmix(ul/well)2.5b.剧烈拍打管子混匀，室温下孵育15分钟。c.胰蛋白酶化，测定细胞密度。d.以600,000细胞/ml密度稀释细胞液至所需体积。e.加入所需体积的转染混合物(预先制备成两份细胞液)，将100ul/孔的细胞液悬浮在试验板上。f.在37℃、5％CO2条件下孵育试验板24小时。III.处理化合物a.制备化合物储液至10mM工作浓度用于FXR，然后用100％DMSO以3倍依次稀释。b.加入10ul化合物到90ul的完全基质中。c.加入5ul化合物溶液到每一孔中。d.在37℃、5％CO2条件下孵育试验板18小时。IV.双荧光素酶报告基因方法萤火虫和海洋腔肠荧光素酶信号通过Promega的双荧光素酶报告基因检测系统来分析。EnVision多标记微孔板检测仪用作化学发光仪。V.结果计算a.数值的标准化是通过将萤火虫荧光信号分成renilla信号实现。“F/R”意思是“Firefly/Renilla”。标准化消除了每一孔中不同细胞数量以及转染效率的差别。b.计算％活化值(％Activationvalue)通过下列方程式计算％活化值，X是每一个浓度点的“F/R”值。Min是无药对照组的“F/R”平均值。Max是参照对照组的“F/R”平均值。c.用GraphPrism5.0计算EC50。VI.结果如表2所示。表2实验结果化合物EC50，(nM)化合物EC50，(nM)0119830589002988065630350000747904321GW4064308结论，本发明化合物显示了很好的FXR受体激活活性，甚至有一些化合物激活活性与阳性对照化合物GW4064相当。实施例4化合物的药代性质式I化合物的药代性质可通过肝微粒体代谢稳定性试验证明：1、缓冲液配制：缓冲液A：1.0L0.1M磷酸二氢钾缓冲液(含1.0mMEDTA)；缓冲液B：1.0L0.1M磷酸氢二钾缓冲液(含1.0mMEDTA)；缓冲液C：0.1M磷酸钾缓冲液(含1.0mMEDTA)，pH7.4，将缓冲液A加入到700mL缓冲液B中，当pH达到7.4时停止。2、化合物给药溶液：500μM溶液：将10μL10mMDMSO储存液加入到190μLACN中；1.5μM给药溶液(溶于肝微粒体，肝微粒体终浓度0.75mg/mL)：将1.5μL500μM溶液与18.75μL20mg/mL肝微粒体加入到479.75uL缓冲液C中。3、NADPH溶液(6mM，溶于缓冲液C中)。4、将30L1.5μM给药溶液加入到96孔板中设置为不同时间点的位置。37℃预热10分钟。5、将15LNADPH溶液(6mM)加入到设置为45分钟时间点的位置，并开始计时。6、在30分钟，15分钟，5分钟，将15LNADPH溶液(6mM)加入到相应时间点的位置。7、培养结束时(0分钟)，将135LACN(含内标)加入到设置为所有时间点的位置中。然后将15LNADPH溶液(6mM)加入到设置为0分钟的位置。8、离心：3220g离心10分钟。9、取出50μL上清液，与50μL超纯水(Millipore)混合，送样至LC/MS分析。实施例中化合物的实验结果列于表3。表3化合物实验结果化合物t1/2(分钟)0155037304105GW406430结果表明，本发明提供了一类结构新颖的比阳性对照化合物GW4064代谢更稳定的化合物。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页1 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