一种同一体系中同时对两个蛋白进行特异性标记或修饰的方法与流程

本发明属于蛋白质标记的标记与修饰领域，特别涉及一种同一体系中同时对两个蛋白进行特异性标记或修饰的方法。

背景技术：

蛋白质标记的标记与修饰，在蛋白质研究应用领域具有重要的位置。如对蛋白质进行可视化标记可用于蛋白质示踪，观察蛋白质的动态变化，以对蛋白质结构功能进行探索；对蛋白质药物类进行功能化修饰可用于维持蛋白质药物的稳定性，延长其半衰期等。传统的蛋白质标记或修饰手段主要是通过化学反应，利用待标记物与蛋白质中氨基酸残基侧链基团反应，从而将待标记物添加于目标蛋白上。但是上述方法往往不具有特异性，因为蛋白质中可能会存在多个相同的氨基酸残基，造成标记多个位点，影响目标蛋白质的标记效果。

为了解决这一问题，蛋白质内含子介导的蛋白质标记技术得到深入的研究与应用，可以通过反式剪接技术实现目标蛋白质的特异性标记。尤其是新型蛋白质内含子s1与s11型的出现，使蛋白质的特异性标记技术得到进一步深入。s1型intein的n-intein片段仅含有11个氨基酸，s11型intein的c-intein片段仅含有6个氨基酸，如此短的intein片段可以通过人工化学合成，而可以在合成的过程中，引入待标记物，通过后续的蛋白质反式剪接将待标记物标记于目标蛋白质上。

已有研究报道，可通过新型蛋白质内含子将标记物位点特异性的标记于目标蛋白的n端或c端，用于目标蛋白质的结构功能等研究，但往往仅是在体外实现单一目标蛋白的标记，具有一定的局限性。蛋白质往往是通过各个蛋白间协同作用来发挥某种功能，如信号通路中的蛋白相互作用、抗原抗体相互作用等，这种情况下需要同时研究两个甚至是多个目标蛋白，以探索整个通路或体系。因此，同一体系中同时标记多个目标蛋白对于探索蛋白质间的相互作用等研究显得尤为重要。若两个或多个新型intein，可在同一体系中能够发生剪接反应，且互不影响剪接效果，则可借助不同intein的反式剪接实现多个目标蛋白的特异性位点标记。这为同一体系实现多个目标蛋白的特异性位点标记提供一种有效的新方法。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种同一体系中同时对两个蛋白进行特异性标记或修饰的方法，该方法操作简单，且标记效率高，在蛋白质标记领域具有重要的应用价值。

本发明的一种同一体系中同时对两个蛋白进行特异性标记或修饰的方法，包括：

(1)将目标蛋白1与s1型intein的c-intein片段相连构建融合蛋白1；将目标蛋白2与s11型intein的n-intein片段相连构建融合蛋白2；

(2)化学合成s1型intein的n-intein片段同时在其n端加入linker序列ggg，在linker的首个氨基酸g引入特异性标记1或修饰1，得到合成片段1；化学合成s11型intein的c-intein片段同时在其c端加入linker序列cfnk，在linker的最末氨基酸k引入特异性标记2或修饰2，得到合成片段2；

(3)将融合蛋白1、合成片段1、融合蛋白2及合成片段2混合于同一体系中；通过s1型intein的反式剪接，融合蛋白1的n端被标记上特异性标记1或修饰1，通过s11型intein的反式剪接，融合蛋白2的c端被标记上特异性标记2或修饰2。

所述步骤(1)中的目标蛋白1和目标蛋白2为蛋白酶类、多肽类、蛋白药物或抗体。均可以通过基因克隆构建融合表达质粒，将目标蛋白与intein的大片段相连进行融合表达。

所述s1型intein的n-intein片段包含11个氨基酸，易进行人工化学合成；s1型intein的c-intein片段在其内部含有6his-tag用于融合蛋白1的纯化；s11型intein的c-intein片段包含6个氨基酸，易进行人工化学合成；s11型intein的n-intein片段含有6his-tag用于融合蛋白2的纯化。

s1型intein和s11型intein能够在同一体系中独立进行剪接反应，无交叉反应，互不影响剪接效果；且能够在高度混合复杂的体系(如细胞裂解液)中发生剪接。

所述s1型intein为rbs1intein，具体序列如seqidno.1(n-intein)和seqidno.2(c-intein)所示；或者sgs1intein，具体序列如seqidno.5(n-intein)和seqidno.6(c-intein)所示。

所述s11型intein为te3s11intein，具体序列如seqidno.3(n-intein)和seqidno.4(c-intein)所示；或者sgs11intein，具体序列如seqidno.7(n-intein)和seqidno.8(c-intein)所示。

所述步骤(2)中的特异性标记1和特异性标记2为多肽或荧光标记；修饰1和修饰2为磷酸化修饰或乙酰化修饰。

所述linker序列ggg仅有3个氨基酸，长度极短，且首个g存在的游离的氨基，便于与化学修饰相连；linker序列cfnk最后一个氨基酸k具有游离的氨基，可与化学修饰相连；linker序列可根据标记的需要进行长度的增加，可在化学合成的过程中在其上引入不同的修饰，后续通过intein的反式剪接将化学修饰标记于目标蛋白上。

有益效果

本发明能够实现同一体系两个目标蛋白的特异性标记，且rbs1和te3s11intein的剪接效率可达50％以上，因此具有较好标记效率；且两intein的小片段非常短，极易进行人工化学合成，因此可以在合成的过程中引入多种标记或修饰物，为目标蛋白的标记提供了更多的可选择性；两个目标蛋白可经本发明方法进行不同的特异性位点标记，为蛋白质的相互作用研究、结构功能研究等提供可行的方法或途径。

附图说明

图1a为剪接反应体系中前体蛋白和剪接产物示意图；

图1b为剪接反应体系的sds-page和荧光扫描检测结果；

图1c为剪接反应体系的sds-page和western-blot检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

在同一体系中分别对trx和mbp目标蛋白(具体序列如seqidno.9(mbp)和seqidno.10(trx)所示)进行特异性的fitc和rhodamineb荧光标记：

以修饰后的pet-32a为载体，插入片段rbs1的c-intein和trx，构建融合表达质粒pmrbs1c，用于表达融合蛋白rbs1c-trx；同时以修饰后的pmal为载体，插入片段mbp和te3s11的n-intein，构建融合表达质粒pmte3s11n，用于表达融合蛋白mbp-te3s11n；

将重组质粒转化宿主大肠杆菌bl21，培养于氨苄青霉素抗性的平板，37℃培养过夜；后挑取单克隆接种于3mllb培养基(含终浓度100ug/ml的氨苄青霉素)中，37℃、200rpm培养过夜；后以1:100比例转接于50mllb培养基(含终浓度100ug/ml的氨苄青霉素)中，37℃、200rpm培养至od600为0.6～0.8时，加入终浓度0.3mm的iptg，诱导蛋白表达，20℃、200rpm培养过夜；4000rpm收集过夜培养后的菌体，加入10mllysisbuffer(20mmtris,300mmnacl,ph8.0)重悬菌体；将重悬的菌体进行超声破碎，10000rpm、4℃离心收集上清；参照镍柱纯化方法纯化目标蛋白备用；

化学合成rbs1intein的n-intein小片段同时在其n端加入linker序列ggg，在linker的首个氨基酸g引入fitc标记，得到携带fitc标记的rbs1n；化学合成tes311的c-intein小片段同时在其c端加入linker序列cfnk，在linker的最末氨基酸k引入rhodamineb标记，得到携带rhodamineb标记的te3s11c；

将纯化后的目标蛋白与合成的携带荧光的多肽(携带fitc标记的rbs1n和携带rhodamineb标记的te3s11c)混合进行剪接反应，以标记目标蛋白，在剪接反应中均包含2mm的dtt；然后对剪接反应体系进行sds-page、western-blot和荧光扫描检测；通过rbs1和te3s11intein的特异性剪接反应，目标蛋白trx的n端标记上fitc荧光基团，而mbp的c端则特异性的标记上rhodamineb荧光基团，如图1所示。由图1b可知，目标蛋白mbp的c端被特异性的标记上rhodamineb，trx的n端被特异性的标记上fitc。由图1c可知，与荧光扫描结果相对应，通过特异性抗体(抗trx和mbp)成功检测到剪接产物mbp-rhodamineb和fitc-trx。

sequencelisting

<110>东华大学

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