一种拉洛他赛水溶性粉针剂的制备及应用
【专利摘要】本发明涉及新一代紫杉烷类药物拉洛他赛，装载于载体辅料中，形成纳米级微粒，进而冻干形成的粉针剂。该载体辅料为两亲性嵌段共聚物，包括亲水性链段以及疏水性链段，所述亲水性链段是聚乙二醇单甲醚，所述疏水性链段包括聚乳酸、聚己内酯、聚谷氨酸、聚三亚甲基碳酸酯以及聚甲基丙烯酸甲酯等。制备完成的载药胶束，具有较高的载药量，包封率，稳定性，大大提高了药物的水溶性；所得胶束粒径在10-100nm之间，并且聚乙二醇化能够避免内皮吞噬系统的识别清除，延长体内循环，被动靶向于肿瘤组织，进而提高疗效，减小毒副作用。
【专利说明】一种拉洛他赛水溶性粉针剂的制备及应用 发明领域
[0001] 本发明涉及拉洛他赛水溶性粉针剂的制备及其应用，属于药物技术领域，具体涉 及生物可降解载体材料包载拉洛他赛形成水溶性制剂的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是人类健康的严重威胁，是仅次于心脑血管疾病的第二杀手，根据美国癌症 协会估计在未来几年时间内癌症将会成为人类第一致死病因。世界卫生组织(WHO)报告中 显示，中国作为人口大国，随着环境污染以及食品安全的恶化，癌症发病形势极为严峻。
[0003] 目前，临床最常用的抗肿瘤药物为紫杉烷类化合物，广泛用于乳腺癌，宫颈癌，非 小细胞肺癌，前列腺癌等癌症的治疗。然而由于长期使用，出现了获得性耐药现象，拉洛他 赛(Larotaxel，LTX)作为新一代紫杉烷类药物，能够克服耐药现象，其分子式为:C 45H53NO14， 分子量为:831.90g/mol，结构式如下：
[000
[0005] 拉洛他赛的抗癌作用机制和特点与其他紫杉醇类化合物相似，属于抗微管蛋白类 药物。拉洛他赛通过与微管蛋白结合，促进其组装成微管，同时可阻止这些已组装的微管解 体，使微管稳定，进而抑制细胞的有丝分裂和间期细胞功能的发挥。与其它已上市的紫杉醇 类药物相比，该药与P糖蛋白介导的排药栗有较低的亲和力，发生药物耐受性的机率更低， 可用于治疗多药耐药性肿瘤。体外研究显示，拉洛他赛在对阿霉素、长春碱、紫杉醇和多西 他赛耐药的细胞株中表现出活性。然而，拉洛他赛同其他紫杉烷类药物一样，几乎不溶于 水，口服吸收差，目前只能采用注射给药方式。目前，由山西振东制药研发的拉洛他赛脂质 微球注射液获已经获批临床试验，而在美国和法国等国家已完成乳腺癌单独用药的III期 临床评价，并在全世界进行多中心多瘤谱单独用药和联合用药的Π 期或III期临床评价。本 专利采用聚合物胶束包载拉洛他赛，具有更高载药量、包封率以及稳定性，解决了拉洛他赛 的疏水性问题，同时能够改善体内药物分布，提高生物利用度，降低毒副作用。
[0006] 经专利和文献检索，未见报道涉及拉洛他赛纳米聚合物胶束相关制剂的研究。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种拉洛他赛水溶性粉针剂，能够克服药物的疏水性，是一 种不含任何增溶剂或者有机溶媒的水性制剂，因此不会带来上述溶剂引起的相关毒副作 用。而本发明的又一目的是提供一种纳米缓释靶向制剂，具有较高的稳定性、生物利用度、 较长的体内循环时间、提高了药效、减少了毒副作用等特点。只要得悉了本文描述的公开内 容，本领域普通技术人员将会理解本发明的其它目的。
[0008] 本发明提供了一种载药系统，其特征在于该载药系统为聚合物胶束，载体材料为 两亲性嵌段共聚物，具有生物相容性以及生物可降解性。所述的嵌段共聚物亲水端为聚乙 二醇单甲醚，均分子量为2000,所述的疏水端为聚乳酸、聚己内酯、聚谷氨酸、聚三亚甲基碳 酸酯以及聚甲基丙烯酸甲酯中的一种，均分子量为1000~10000,优选2000~5000。
[0009] 本发明提供了一种拉洛他赛水性粉针剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法 包括下述步骤，采用薄膜分散法：
[0010] 1)聚合物载体材料 mPEG-PDLLA，mPEG-PCL，mPEG-PGA，mPEG-PTMC，mPEG-PMMA中的 一种以及拉洛他赛药物充分溶解于有机溶剂中，使材料和拉洛他赛形成均匀溶液I;
[0011] 2)将溶液I中的有机溶剂通过减压蒸馏、冷冻干燥或喷雾干燥中的一种方式彻底 除掉，优选减压蒸馏，得到均匀的材料-药物透明薄膜基质；
[0012] 3)向上述基质中加入预热的注射用水，通过晃动、搅拌、超声、涡旋等方式，载体材 料水化自组装成胶束，将拉洛他赛包裹于疏水性内核中，形成拉洛他赛胶束溶液Π ;
[0013] 4)向拉洛他赛胶束溶液Π 中加入冻干保护剂，然后分别过0.45μπι粗滤，再过0.22μ m精滤除菌；
[0014] 5)将滤液置于-50°c冰箱中，预冻2~6h，优选2-3h，再逐步升华除掉水分，冻干即 得拉洛他赛水溶性粉针剂。
[0015] 本发明中所述载体材料与拉洛他赛质量比为(3:1)~（100:1);
[0016] 本发明中所用的有机溶剂为乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、二氧六环、二氯 甲烷、氯仿的任意一种；
[0017] 本发明中，将载体材料以及拉洛他赛充分溶解于有机溶剂中采用的是搅拌、超声 或者加热等方式来助溶。
[0018] 本发明中，所述步骤（2)中减压蒸馏过程中压力为-0.1~OMPa，优选-0.1~-0.08MPa;冷冻干燥过程中冻干溶剂可以是乙醇：水（I: 10~1:100)，叔丁醇：水（I: 10~1: 100)。
[0019] 所述步骤(3)中所述预热注射用水的温度为40~60°C;
[0020] 所述步骤(4)中冻干保护剂为乳糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、麦芽糖、氨基 酸、聚乙二醇果糖、海藻酸钠或者明胶中的任一种，或者它们的混合物。
【附图说明】
[0021] 附图1拉洛他赛胶束冻干粉以及复溶后溶液外观，从左至右依次是水、冻干粉以及 胶束复溶溶液。
[0022] 附图2拉洛他赛胶束粒径分布图
[0023] 附图3拉洛他赛胶束粒子透射电镜图 [0024]附图4拉洛他赛胶束粒子原子力显微镜图
[0025]附图5拉洛他赛胶束体外释药曲线图
[0026] 附图6拉洛他赛胶束对细胞有丝分裂的影响图
[0027] 附图7拉洛他赛胶束对小鼠 Lewis肺癌生长抑制作用图
[0028] 附图8拉洛他赛胶束对荷瘤小鼠生存周期的影响图
【具体实施方式】
[0029] 本发明将结合下述实施例或实施例做进一步详细阐述，但应当理解，下述实施例 仅仅用于阐述和解释本发明，而并不限制本发明的范围。应当理解，对于本发明中提及但没 有详细说明的方法、步骤、装置、仪器、材料等，普通技术人员可以采用本领域熟知的相应方 法、步骤、装置、仪器、材料等，或者按照本领域的常规知识和技术获得。
[0030] 实施案例1
[0031] 分别称取180mg载体材料(mPEG^m-PDLLAmo)和20mg拉洛他赛置于圆底烧瓶中，加 入IOmL无水乙醇，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液置于旋转蒸发仪40°C下旋蒸 60min将有机溶剂彻底蒸干，得干燥透明的混合薄膜基质。而后加入IOmL在60°C下预热的注 射用水，在搅拌的条件下水化形成胶束，加入甘露醇，先过〇. 45μπι滤膜粗滤，后过0.22μπι无 菌滤膜精滤除菌，滤液冻干，得到样品。
[0032] 实施案例2
[0033] 分别称取150mg载体材料(mPEG2_-PCL2_)和50mg拉洛他赛置于冻干瓶中，加入 5ml叔丁醇，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液冻干，彻底除去有机溶剂，得到药物 与载体材料的混合基质。然后加入IOmL在60°C下预热的注射用水，在搅拌的条件下水化形 成胶束，加入蔗糖，先过0.45μπι滤膜粗滤，后过0.22μπι无菌滤膜精滤除菌，滤液冻干，得到样 品。
[0034] 实施案例3
[0035] 分别称取180mg载体材料(mPEG5_-PGA6_)和20mg拉洛他赛置于圆底烧瓶中，加入 5ml四氢呋喃，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶减压蒸馏彻底除掉有机溶剂，得干 燥透明的混合薄膜基质。然后加入IOmL在50°C下预热的注射水，涡旋3min，加入海藻糖，将 水化液先过0.45μπι滤膜粗滤，后过0.22μπι滤膜精滤除菌，滤液冻干即得样品。
[0036] 实施案例4
[0037] 分别称取190mg载体材料(mPEG2_-PCL2_)和IOmg拉洛他赛置于圆底烧瓶中，加入 I Oml乙腈，加热使载体材料和药物充分溶解。将该溶液喷雾干燥，彻底除去有机溶剂，得到 药物以及载体材料的混合基质。然后加入SmL在50°C下预热的注射用水，在搅拌的条件下水 化形成胶束，加入氨基酸，过0.45μπι滤膜粗滤，后过0.22μπι无菌滤膜精滤除菌，滤液冻干，得 到样品。
[0038] 实施案例5
[0039] 分别称取195mg载体材料(mPEG2_-PMMA5(xx))和5mg拉洛他赛置于圆底烧瓶中，加入 IOmL异丙醇，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液减压蒸馏彻底除去有机溶剂，得干 燥透明的混合薄膜基质。而后加入15mL在60°C下预热的注射用水，在搅拌的条件下水化形 成胶束，加入乳糖，过0.45μπι滤膜粗滤，后过O . 22μπι无菌滤膜精滤除菌，滤液冻干，得到样 品。
[0040] 实施案例6
[0041 ] 分别称取199mg载体材料(mPEG2_-PMTC5_)和Img拉洛他赛置于圆底烧瓶中，加入 I OmL二氯甲烷，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液减压蒸馏彻底除去有机溶剂，得 干燥透明的混合薄膜基质。而后加入IOmL在50°C下预热的注射用水，在涡旋的条件下水化 形成胶束，加入麦芽糖，先过0.45μπι滤膜粗滤，后过0.22μπι无菌滤膜精滤除菌，滤液冻干，得 到样品。
[0042] 实施案例7
[0043] 分别称取1.99g载体材料(mPEG2_-PCL2_)和IOmg拉洛他赛置于圆底烧瓶中，加入 I OmL氯仿，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液喷雾干燥，收集固化物，得到药物以 及载体材料的混合基质。而后加入IOOmL在60°C下预热的注射用水，在搅拌条件下水化形成 胶束，加入乳糖，先过0.45μπι滤膜粗滤，后过0.22μπι无菌滤膜精滤除菌，滤液冻干，得到样 品。
[0044] 实施案例8
[0045] 分别称取185mg载体材料(mPEG2_-PDLLA棚〇)和15mg拉洛他赛置于圆底烧瓶中，加 入IOmL二氧六环，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液减压蒸馏，将有机溶剂彻底除 掉，得干燥透明的混合薄膜基质。而后加入IOmL在60°C下预热的注射用水，在超声的条件下 水化形成胶束，加入乳糖，过0.22μπι无菌滤膜，滤液冻干，得到样品。
[0046] 实施案例9
[0047] 分别称取150mg载体材料(mPEG2_-PCL35Q())和50mg拉洛他赛置于冻干瓶中，加入 IOmL四氢呋喃，加热超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液冻干，除掉有机溶剂，得到 混合均匀的药物-材料基质。而后加入IOmL在60°C下预热的注射用水，在涡旋的条件下水化 形成胶束，加入海藻糖，先过0.45μπι滤膜粗滤，后过0.22μπι无菌滤膜精滤除菌，滤液冻干，得 到样品。
[0048] 实施案例10
[0049] 分别称取175mg载体材料(mPEG2_-PGA5_)和25mg拉洛他赛置于圆底烧瓶中，加入 IOmL四氢呋喃，加热超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液减压蒸馏30min，并于真空 干燥箱中干燥IOh，将有机溶剂彻底挥干，得干燥透明的混合薄膜基质。而后加入IOmL在60 °C下预热的注射用水，在超声的条件下水化形成胶束，加入乳糖，先过0.45μπι滤膜粗滤，后 过0.22μπι无菌滤膜精滤除菌，滤液冻干，得到样品。
[0050] 试验验证
[0051] (1)取拉洛他赛粉针剂，用注射用水复溶，并稀释至lmg/mL，超声分散均匀后，在25 °(：下，用马尔文激光粒度仪测试粒径大小及分布，结果如图2所示。
[0052] (2)取胶束冻干粉，注射用水复溶后，超声分散后，滴于铜网上，室温晾干后，用2% 磷钨酸负染，室温晾干，用透射电镜观察粒子外观，并拍照，结果如图3所示。
[0053] (3)同样取复溶后的胶束溶液，稀释后超声分散，滴于干净的云母片上，室温晾干 后，置于探针下扫描胶束外观，软件分析处理后，得到3D图片，如图4所示。
[0054] (4)为探究纳米胶束体外释放行为，采用透析袋法进行测定，称取一定量的拉洛他 赛胶束冻干粉用纯化水分散后置于透析袋(截留分子量为3.5KDa)内，相当含量的自由药物 溶解于DMSO中作为对照。将透析袋扎口后置于50mL离心管中，浸没于30mL含有0.5 吐温 80的roS(pH=7.4)中。将离心管置于水浴摇床中，水浴温度为37°C，水平晃动lOOrpm。分别 在O . 5，I，2，4，8，12，24，48，72h时吸取ImL释放液，并补充ImL新鲜介质。吸取的释放液 12000rpm离心10min，用高效液相检测卡巴他赛含量并计算释放度，绘制释放曲线，结果如 图5所示。
[0055] (5)取LLC细胞5 X IO5个接种于在6孔板中，培养12h细胞贴壁后，换液给药，加入相 当于lyg/mL含量的拉洛他赛胶束以及自由药物，用不含药物的正常组作为阴性对照，继续 培养48h后，收集细胞，按照细胞周期检测试剂盒操作步骤，洗涤、固定、染色后，用流式细胞 仪检测细胞周期，结果如图6所示。
[0056] (6)采用小鼠皮下肿瘤模型考察拉洛他赛粉针剂的体内抑瘤效果。取小鼠 LLC细胞 IO6个/O.lmL，注射于小鼠右侧腋下，待肿瘤长到50-100mm3时，随机分组并开始治疗。分为拉 洛他赛自由药物组、拉洛他赛胶束组以及生理盐水组，采用尾静脉注射，每三天注射一次， 连续治疗4次，治疗过程中用游标卡尺测量小鼠肿瘤大小，并记录小鼠体重。空白组肿瘤长 到2000mm 3以上后，统一处死并解剖肿瘤，计算抑瘤率。剩余小鼠继续饲养，考察生存时间。 肿瘤生长体积以及生存周期如图7,8所示。
【主权项】
1. 一种拉洛他赛水溶性粉针剂，其特征在于该粉针剂以两亲性嵌段聚合物为载体材 料，亲水端是聚乙二醇单甲醚，疏水端可以是聚乳酸、聚己内酯、聚谷氨酸、聚三亚甲基碳酸 酯以及聚甲基丙烯酸甲酯等，优选聚乳酸、聚己内酯。2. 权利要求1所述的拉洛他赛水溶性粉针剂，其特征在于所用两亲性嵌段聚合物的亲 水端聚乙二醇单甲醚均分子量为2000,疏水端聚乳酸、聚己内酯、聚谷氨酸、聚三亚甲基碳 酸酯以及聚甲基丙烯酸甲酯分子量为1000~10000之间，优选2000~5000。3. 根据权利要求书1或2所述拉洛他赛水溶性粉针剂，其特征在于制备方法包括以下步 骤： 1) 将载体材料以及拉洛他赛充分溶解于有机溶剂中，使材料及药物形成均匀的溶液I; 2) 将溶液I中的有机溶剂可通过减压蒸馏或直接冷冻干燥或喷雾干燥中的一种方式彻 底除掉，优选减压蒸馏，得到均匀的材料-药物透明薄膜基质； 3) 向上述基质中加入预热的注射用水，通过晃动、搅拌、超声、涡旋等方式，载体材料水 化自组装成胶束，将拉洛他赛包裹于疏水性内核中，形成拉洛他赛胶束溶液Π ; 4) 向拉洛他赛胶束溶液Π 中加入冻干保护剂，然后分别过0.45μπι粗滤，再过0.22μπι精 滤除菌； 5) 将滤液置于_40°C冰箱中，预冻2~6h，优选2-3h，再逐步升华除掉水分，冻干即得拉 洛他赛水溶性粉针剂。4. 根据权利要求3所述的拉洛他赛水溶性粉针剂制备方法，其特征在于载体材料与拉 洛他赛药物的质量比例为3:1~100:1。5. 根据权利要求3中所述的粉针剂制备步骤（1)中有机溶剂可以是乙腈、甲醇、乙醇、异 丙醇、四氢呋喃、二氧六环、二氯甲烷、氯仿中的任一种。6. 根据权利要求3所述的粉针剂制备步骤(2)中减压蒸馏过程中压力为-0.1~5MPa，优 选-0.1~-0.08MPa。7. 根据权利要求3所述的粉针剂制备步骤（2)中直接冷冻干燥工艺，其溶剂可以是乙 醇:水(1:10~1 :100)，叔丁醇:水(1:10~1:100)，优选叔丁醇与水(2 :8~4:6)。8. 根据权利要求3所述的粉针剂制备步骤(3)中所述预热注射用水，其特征在于温度为 40 ~65 °C，优选55-60 °C。9. 根据权利要求3所述粉针剂制备步骤(4)中所述冻干保护剂选自乳糖、甘露醇、蔗糖、 海藻糖、葡萄糖、麦芽糖、氨基酸、聚乙二醇果糖、海藻酸钠或者明胶中的至少一种。10. 根据权利要求1或2所述的拉洛他赛水溶性粉针剂，用于常见肿瘤的治疗，例如乳腺 癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌、黑色素瘤，胰腺癌，肾癌、骨髓瘤、甲 状腺髓样癌、非何杰金氏淋巴瘤等癌症。
【文档编号】A61K47/34GK105982868SQ201510975809
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年12月23日
【发明人】王成, 张震, 刘宗银, 徐益, 杨爽
【申请人】山东华铂凯盛生物科技有限公司