专利名称：一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法
技术领域：
本发明涉及一种多药耐药细胞建立的新方法，尤其涉及一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法。
背景技术：
恶性肿瘤是目前危害人类健康的主要疾病指引，其死亡率仅次于心脑血管疾病。目前全世界每年恶性肿瘤的新发病例超过1000万。在我国，每年新发病例160万，死亡140万。胆管癌以前曾经被认为是一种少见疾病，但是随着各种新的诊断技术的不断出现，其发病率逐年上升，已经成为消化道肿瘤中上升速度最快的肿瘤之一。目前国内的发病率为O. 1%0 -O. 73%。，发病年龄多在50-70岁，男女比例约为I. 4:1，而国外尸检发现率为
O.01%-0· 5%。根据Mouzas IA等调查发现从1992年到2000年的9年时间里，胆管癌的发病率从O. 998/10万一2. 329/10万一3. 327/10万人，渐呈上升趋势。胆管癌早期发现率低，大多数患者发现时已失去手术机会，而且手术切除率较低，一般为50%左右，，除了少数的早期病变之外，一般很难通过手术达到根治性切。随着科学技术的发展，虽然手术切除治疗上虽然得到较大的进展，手术切除率已明显提高，手术死亡率也明显下降，手术方法亦日趋规范化，但存在的困难仍然很多，由于真正能达到根治性切除的病例很少，肿瘤复发常常是难以避免的。远期效果仍不佳，需有新的突破。现有的化学药物治疗未见有明显的效果，而且在化疗过程中易出现耐药。放射治疗尽管部分病人能延长生存时间，但仍然很难提高病人的生活质量。目前尚缺乏早期诊断胆管癌的手段，对胆管癌的发病机制的了解也不够深入。进一步提高对胆管癌病因、发病机理、早期诊断以及相应的治疗方法的认识，对于延长患者生命，改善患者生活质量，甚至治愈胆管癌有重要意义。因此，通过对建立的胆管癌细胞系的进一步研究势在必行。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法，建立胆管癌耐药细胞株。本发明的一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法包括以下步骤
O将胆管癌细胞株QBC939放入含表皮生长因子浓度为5-15μ8/πι1，药物浓度为
O.0005-0. 002 μ g/ml的培养液中培养2-4天；
2)弃去药物培养液，将步骤I)处理后的管癌细胞株QBC939放入含表皮生长因子5-15 μ g/ml，药物浓度增加的培养液中培养2-4天；
3)重复步骤2)，直到药物浓度为O.25-0. 3 μ g/ml ；
4)弃去药物培养液，将步骤3)处理后的管癌细胞株QBC939放入含表皮生长因子5-15 μ g/ml，药物浓度降低的培养液中培养2-4天；
5)弃去药物培养液，将步骤4)处理后的管癌细胞株QBC939放入含表皮生长因子5-15 μ g/ml，药物浓度增加的培养液中培养2-4天；
6)重复步骤5)，直到药物浓度比步骤3)的药物浓度高O.1-1 μ g/ml ；
7)重复步骤4)、步骤5)和步骤6)，每次重复后药物浓度均比上一次重复后的药物浓度高O. 1-1 μ g/ml,直到药物浓度为O. 8-1. 5 μ g/ml为止。上述步骤中，优选地，增加药物浓度每次增加O. 004-0. 25 μ g/ml,降低药物浓度每次降低 O. 1-0. 25 μ g/ml O优选地，胆管癌细胞株在培养液中每次培养3天。优选地，所述表皮生长因子的浓度为10 μ g/ml ο所述药物可以为氮芥、环磷酰胺、博莱霉素、长春新碱、平阳霉素、优福啶、哺氟啶或多柔比星等中的任意一种或几种。本发明的一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法采用药物浓度递增结合高低浓度交替作用合并生长因子刺激法，能提高培养效率，相对于药物浓度递增刺激法，在较短时间内就能建立胆管癌耐药细胞株，可用于分析得到胆管癌细胞化疗耐药后的形态学及生物学习性的变化，筛选得到的化疗药物及判断得出化疗药物的敏感性，分析得到的肿瘤化疗多药耐药机制，体外筛选得到的耐药逆转剂更具有代表性、针对性、可靠性和广谱性。·
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明所述的一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法进行详细的介绍和描述，以更好的理解本发明，但是应当理解的是，下述实施例并不限制本发明范围。本实施例中采用药物多柔比星(ADM)，依照本发明的方法，建立胆管癌耐药细胞株QBC939/ADM，具体包括以下步骤
1)将胆管癌细胞株QBC939放入含表皮生长因子浓度为10μ g/ml, ADM浓度为O. 001μ g/ml的DMEM培养液中培养3天；更换培养液，胆管癌细胞株QBC939按顺序分别在含表皮生长因子浓度为 10 μ g/ml, ADM 浓度为 O. 005 μ g/ml>0. 01 μ g/ml>0. 05 μ g/ml、0. Iμ g/ml和O. 25 μ g/ml的DMEM培养液中各培养3天；
2)更换培养液，步骤I)获得的胆管癌细胞株QBC939按顺序分别在含表皮生长因子浓度为 10 μ g/ml, ADM 浓度为 O. I μ g/ml,O. 25 μ g/ml 和 O. 5 μ g/ml 的 DMEM 培养液中各培养3天；
3)更换培养液，步骤2)获得的胆管癌细胞株QBC939按顺序分别在含表皮生长因子浓度为 10 μ g/ml，ADM 浓度为 O. 25 μ g/ml、O. 5 μ g/ml 和 O. 75 μ g/ml 的 DMEM 培养液中各
培养3天；
4)更换培养液，步骤3)获得的胆管癌细胞株QBC939按顺序分别在含表皮生长因子浓度为10 μ g/ml, ADM浓度为O. 5 μ g/ml,O. 75 μ g/ml和I μ g/ml的DMEM培养液中各培养3天，最终获得能在I. O u g/ml ADM中生长的QBC939耐药细胞株。本实施方式采用的方法可以防止细胞死亡过快、培养交率低的情况，提高了培养效率，只需3个多月就建立了具有多药耐药性的QBC939/ADM细胞。对本实施方式建立的具有多药耐药性的QBC939/ADM细胞进行细胞生物学性检测，结果如下I.耐药细胞的形态变化
当ADM浓度在O. I μ g/ml以下时，细胞形态与亲本细胞比较，未见明显变化;ADM浓度在O. 5 μ g/ml以上时，细胞形态发生变化，光镜下可见梭形，多边形，椭圆形，不规则形的多核巨细胞，细胞核大呈卵圆形、不规则型、双核型。核染色质粗，细胞质少；iQBC939细胞能在I μ g/ml ADM的培养液中稳定生长并传代时，将其定名为QBC939/ADM。倒置显微镜下对数生长期的胆管癌QBC939/ADM细胞呈铺石状镶嵌紧密排列，细胞呈多边形、梭形、三角形等各种形态，以三角形为主生长活跃。2.倍增时间(Td)的测定
QBC939细胞Td为27小时，QBC939/ADM的Td为31小时，延长了 4小时，增加I. 15倍。3耐药谱分析(MTT法)
三种化疗药对QBC939/ADM细胞株的抑制作用明显降低。与亲本细胞株相比，QBC939/ADM细胞株对多柔比星(ADM)、丝裂霉素(MMC)、长春地辛(VDS)分别产生不同程度的耐药(表 I)。表-IADM、MMC, VDS 对胆管癌 QBC939
权利要求
1.一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将胆管癌细胞株放入含表皮生长因子浓度为5-15μ g/ml，药物浓度为O. 0005-0. 002μ g/ml的培养液中培养2-4天； 2)弃去药物培养液，将步骤I)处理后的胆管癌细胞株放入含表皮生长因子5-15μ g/ml，药物浓度增加的培养液中培养2-4天； 3)重复步骤2)，直到药物浓度为O.25-0. 3 μ g/ml ； 4)弃去药物培养液，将步骤3)处理后的管癌细胞株放入含表皮生长因子5-15μg/ml，药物浓度降低的培养液中培养2-4天； 5)弃去药物培养液，将步骤4)处理后的管癌细胞株放入含表皮生长因子5-15μg/ml，药物浓度增加的培养液中培养2-4天； 6)重复步骤5)，直到药物浓度比步骤3)的药物浓度高O.1-1 μ g/ml ； 7)重复步骤4)、步骤5)和步骤6)，每次重复后药物浓度均比上一次重复后的药物浓度高O. 1-1 μ g/ml,直到药物浓度为O. 8-1. 5 μ g/ml为止。
2.根据权利I所述的一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法，其特征在于，增加药物浓度每次增加O. 004-0. 25 μ g/ml ο
3.根据权利I所述的一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法，其特征在于，降低药物浓度每次降低O. 1-0. 25 μ g/ml。
4.根据权利I所述的一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法，其特征在于，胆管癌细胞株在培养液中每次培养3天。
5.根据权利要求I所述的一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法，其特征在于，所述表皮生长因子的浓度为10 μ g/ml0
6.根据权利要求I所述的一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法，其特征在于，所述药物为氮芥、环磷酰胺、博莱霉素、长春新碱、平阳霉素、优福啶、哺氟啶或多柔比星中的任意一种或几种。
7.—种如权利要求I所述方法建立的多药耐药胆管癌细胞。
全文摘要
本发明的一种人胆管癌多药耐药细胞建立的新方法采用药物浓度递增结合高低浓度交替作用合并生长因子刺激法，能提高培养效率，相对于药物浓度递增刺激法，在较短时间内就能建立胆管癌耐药细胞株，可用于分析得到胆管癌细胞化疗耐药后的形态学及生物学习性的变化，筛选得到的化疗药物及判断得出化疗药物的敏感性，分析得到的肿瘤化疗多药耐药机制，体外筛选得到的耐药逆转剂更具有代表性、针对性、可靠性和广谱性。
文档编号C12N5/09GK102911917SQ20121042277
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年10月30日
发明者刘志华, 秦环龙, 汪建平 申请人:刘志华