一种抗xa21蛋白的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种抗XA21蛋白的单克隆抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 有关水稻抗白叶枯病基因 Xa21的工作，最早可以追溯到1977年，当时印度育种 学家S. Devadath等人对非洲马里的长药野生稻（Oryza Iongistaminata)进行接种测验， 发现该野生稻抗所有测试的白叶枯病菌（Xoo)小种。随后，国际水稻研宄所Khush等人将 该野生稻与感病的籼稻栽培品种IR24杂交，经过12年转育，于1990年获得了以IR24为 遗传背景的籼稻近等基因系，命名为IRBB21，Xoo接种鉴定表明，IRBB21对印度和菲律宾 所有的Xoo生理小种都有抗性。遗传分析表明，抗性是由单一遗传位点决定的，Khush将 这一来源于长药野生稻的抗性基因命名为Xa21 (Khush G S, Bacalangco E, Ogawa T. A new gene for resistance to bacterial blight from 0. longistaminate. Rice Genet News Iettj 1990,7:121-122.) 〇
[0003] 由于Xa21具有广谱抗病的特点，所以吸引了分子遗传学家的目光。作为育种学 家的Khush将这份重要的水稻材料提供给了美国康奈尔大学的Tanksley教授。当时在 Tanksley实验室的博士后Pamela Ronald等开始了 Xa21的定位工作。1995年，宋文源等 在美国加州大学戴维斯分校Pamela Ronald实验室并与中科院遗传所等单位合作，克隆 了 Xa21基因，序列分析发现，该基因编码类受体激酶，其预测的胞外结构域为富含亮氨酸 的拉链结构（Lesine-rich repeat, LRR)，其胞内区为丝/苏氨酸蛋白激酶（Song WY, Wang GL, Chen LL, Kim HS, Pi LY, Holsten T, Gardner J, Wang B, Zhai WX, Zhu LH, Fauquet C, Ronald P. A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21. Science. 1995 270(5243) :1804-6.)。由于Xa21 对白叶枯病的广谱 抗性及结构特点，该基因在水稻育种中有重要的应用价值，其机理研宄也具有重要的理论 意义。通过传统的回交转育策略，Xa21已经被导入多个常规水稻品种中（翟文学，李晓兵， 田文忠，周永力，潘学彪，曹守云，赵显峰，赵彬，章琦，朱立煌.由农杆菌介导将白叶枯 病抗性基因 Xa21转入我国的5个水稻品种.中国科学（C辑），2000, 43 (4) : 361-368.吴家 道，杨剑波，许传万，李莉，向太和，倪大虎，汪秀峰，贾士荣，唐益雄，张世平，Fauquet C M.水稻抗白叶枯病基因 Xa21转基因水稻及其杂交稻研宄.作物学报，2001，27(1) :29-34. 赵显峰，翟文学，李平，王春连，潘学彪，钱前，李世贵，朱立煌.不同Xa21转基因杂 交稻组合的大田试验与分析.作物学报，2002, 28(4) :521-527.)，所以，检测鉴定水稻材料 中的Xa21具有重要的应用价值。由于Xa21的序列已知，用PCR扩增的方法可以方便地检 测Xa21的存在与否，但这种基于DNA的扩增并不能了解XA21蛋白质的表达与否及表达的 时空特性，所以制备抗XA21蛋白质的抗体，建立基于免疫学的方法具有重要的现实意义和 应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种抗XA21蛋白的单克隆抗体及其应用。
[0005] 本发明所提供的抗XA21蛋白的单克隆抗体具体由杂交瘤细胞系60632-18分泌产 生。杂交瘤细胞系60632-18,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入 册编号为 CGMCC No. 10416。
[0006] 上述分泌抗XA21蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系60632-18也属于本发明的保 护范围。
[0007] 将所述单克隆抗体用标记物进行标记后形成的标记抗体也属于本发明的保护范 围。
[0008] 其中，所述标记物可为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、异硫氰酸荧光素、荧 光染料Cy3、荧光染料Cy5、磁珠或琼脂糖。
[0009] 所述杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No. 10416或所述单克隆抗体或所述标记抗体 在如下（al)_(a4)任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0010] (al)检测或辅助检测待测样品中是否含有水稻XA21蛋白；
[0011] (a2)从含有水稻XA21蛋白的样品中富集或分离水稻XA21蛋白；
[0012] (a3)通过与水稻XA21蛋白结合形成复合物用于对所述XA21蛋白的结构和/或功 能进行分析；
[0013] (a4)通过与水稻XA21蛋白结合形成复合物。
[0014] 在所述（al)中，所述检测的方法包括但不限于利用所述单克隆抗体直接和抗原 结合的酶联免疫吸附检测（ELISA)、免疫印迹（Western Blot)、流式细胞术（FACS)、免疫组 织化学（IHC)检测或者免疫PCR检测方法。在所述检测中，所述单克隆抗体可单独或与通 过化学键偶联，静电吸附或者亲疏水性吸附，而连接缀合物包括辣根过氧化物酶（HRP)，碱 性磷酸酶（AP)，生物素（Biotin)，异硫氰酸荧光素（FITC)，Cy3、Cy5、磁珠和琼脂糖等缀合 物连接。
[0015] 在所述（a2)中，所述分离的方法包括但不限于利用琼脂糖免疫、免疫磁珠吸附或 流式细胞术完成生物分离方法或阳性细胞分选。
[0016] 在所述（a3)中，是通过将所述单克隆抗体或将所述抗体的重链与轻链可变区序 列经重组表达后制备的工程抗体与所述水稻XA21蛋白形成稳定复合物的晶体结构，进而 实现对水稻XA21蛋白的激酶区结构进行研宄。
[0017] 本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测水稻XA21蛋白的试剂盒。
[0018] 本发明所提供的检测或辅助检测水稻XA21蛋白的试剂盒中含有独立包装的所述 单克隆抗体或所述标记抗体。
[0019] 所述试剂盒中还可含有独立包装的水稻XA21蛋白标准品。
[0020] 所述水稻XA21蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示。
[0021] 本发明还保护一种更大范围的抗水稻XA21蛋白的抗体。
[0022] 该抗水稻XA21蛋白的抗体，由重链和轻链组成，所述重链可变区的氨基酸序列如 序列表中序列3所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
[0023] 进一步，所述抗体的重链恒定区的亚型为IgGla;所抗体的轻链恒定区的亚型为 κ轻链。
[0024] 所述抗体由杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No. 10416分泌产生。
[0025] 编码所述抗体的基因也属于本发明的保护范围。
[0026] 在所述抗体的编码基因中，所述重链可变区的编码基因具体如序列表中序列5所 示；所述轻链可变区的编码基因如序列表中序列6所示。
[0027] 含有所述基因的重组载体、重组菌、重组细胞系、重组病毒或表达盒也属于本发明 的保护范围。
[0028] 本发明的优点及有益效果：
[0029] (1)本发明获得的Xa21单克隆抗体，能识别重组XA21蛋白，具有检测多种转基因 植物的XA21蛋白的特性，具有广阔的用途。
[0030] (2)本发明获得的Xa21单克隆抗体为一种IgGla类抗体，与XA21蛋白的结合有极 强特异性和敏感性，ELISA方法的最低检测限为4ng，采用免疫印迹法检测时其检测灵敏度 为 30ng)。
[0031] (3)可对常规及转基因水稻中的XA21蛋白含量进行定量分析。
[0032] (4)本发明获得的Xa21单克隆抗体可独立或与生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷 酸酶等偶联，用于WB、双抗体夹心ELISA、间接ELISA、免疫组织化学、免疫PCR等方法对转基 因生物进行检测和筛查，特异性和灵敏度高，具有很高的使用价值。
[0033] (5)本发明的Xa21单克隆抗体可以通过与琼脂糖、磁珠结合，进行生物样本的亲 和富集和分离。
[0034] (6)通过将本发明的Xa21单克隆抗体与FITC、Cy3、Cy5等荧光分子偶联，用于转 基因细胞的流式细胞术分析与分选，进而完成qPCR、ELISpot或单细胞分析。
[0035] 保藏说明
[0036] 参据的生物材料（株）：60632-18
[0037] 科学描述：杂交瘤细胞系
[0038] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0039] 保藏机构简称：CGMCC
[0040] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0041] 保藏日期：2015年3月31日
[0042] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 10416
【附图说明】
[0043] 图1为XA21激酶区蛋白质（XA21K)在大肠杆菌中的表达。M :分子量标记；Oh :是 诱导前的全菌超声蛋白质样品；S :诱导表达细菌超声破碎离心的上清样品。P :诱导表达细 菌超声破碎离心的沉淀样品。
[0044] 图2为本发明杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No. 10416分泌的单克隆抗体检测重 组的XA21K蛋白质。M :分子量标记，上样量：泳道1-4上样量分别为150、30、6和I. 2ng。
[0045] 图3为用纯化后的本发明杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No. 10416分泌的单克隆 抗体检测水稻叶片样本。M :分子量标记；4021和CX6221b为带有XA21的水稻材料，TP309 和MH86为不带有XA21的水稻材料；XA21 :全长的XA21蛋白质；HSP :用抗HSP抗体检测作 为上样量的内参。
[0046] 图4为双抗体夹心ELISA方法检测XA21蛋白的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0047] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0048] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049] pGTK载体：该载体由中国科学院遗