毒Ad5-P16。
[0085] 实施例2重组溶瘤腺病毒Ad5-P16感染肿瘤细胞检测其感染效果及表达情况
[0086] L将培养的2皿U251细胞，I :100分别加入Ad5, Ad-P16病毒（滴度为I :100)。
[0087] 2.培养72小时后，收集细胞裂解蛋白，进行Western blot实验用P16抗体检测 Ad5-P16的表达情况，Beta-Actin抗体作为内参抗体。
[0088] 如图1所示，重组溶瘤腺病毒Ad5_P16感染后的人神经胶质瘤U251细胞，与腺病 毒Ad5感染相比，P16基因的表达水平极显著增强。
[0089] 实施例3MTT法检测比较细胞活力
[0090] 1.将图示不同组织来源的肿瘤细胞按2000/100uL每孔的密度接种于96孔板中。
[0091] 2.培养过夜，待细胞贴壁后，每种癌细胞分为1个对照组及2个实验组，每个组至 少设置3个复孔，每组分别加入磷酸缓冲液PBS，Ad5,以及Ad5-P16各luL。
[0092] 3,培养72小时后，加入IOuL 5mg/mL MTT溶液，继续培养4小时后，每孔加入 IOOuL 10% SDS-0.1 N HCl 溶液。
[0093] 4,培养过夜后，用酶标仪在570nm处读取吸光度，即为相对细胞活力，将对照组设 置为100。
[0094] 如图2所示，重组溶瘤腺病毒Ad5_P16,在Ad5肿瘤细胞杀伤作用基础上，对多种 肿瘤细胞系均有进一步杀伤效果，即P16基因的修复，对腺病毒杀伤肿瘤细胞，具有协同作 用。实施例4颅内肿瘤生长情况实验
[0095] 将表达荧光素酶的人神经胶质肿瘤U251细胞按I X IO5个于10微升PBS中的密 度，原位接种于裸小鼠脑室内。2周后，原位脑室注射生理盐水、Ad5或Ad-P16病毒。2周 后，腹腔注射荧光素酶底物，小动物活体成像仪观察
[0096] 如图3~4所示：Ad5病毒能显著抑制神经胶质瘤在小鼠颅内生长，重组溶瘤腺病 毒Ad5-P16所携带P16基因与病毒溶瘤作用，协同抑制了肿瘤的体内生长，抑制效果显著增 强。
[0097] 其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描 述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经 创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
【主权项】
1. 一种具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16,其特征在 于：所述重组溶瘤腺病毒Ad5-P16全基因组是由P16⑶S基因替换原溶瘤腺病毒Ad5全基因 组上的固有基因E3gp-19K得到。2. 根据权利要求1所述具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒 Ad5-P16,其特征在于：所述P16CDS基因序列如SEQ ID No. 1所示。3. -种权利要求1所述含有高效表达抗癌基因P16的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16的构建 方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 以pCMV pl6 INK4A为模板，设计含有酶切位点和保护碱基的引物上下游引物PF和 PR, PF ：ctgatatgcatggagccggcggcggggag, PR ：gccgcggccgctcaatcggggatgtctgagg ； 2) 经PCR得到P16⑶S序列 PCR条件为：预变性95°C 5分钟，变性95°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 30秒，循 环34次，最后延伸72°C 10分钟； 3) 将PCR产物连接入TA载体，挑选单克隆，并鉴定出阳性克隆子； 4) 然后在E3gp-19K上游启动子U6前方设计上游引物Pl和E3gp-19K编码区终止密码 子后方设计下游引物P6,分别为： Pl ：cggaagcttacgtaccggtccaatccgtc? P6 ：ggcgaattcaggtcgtaaacgtccacacgt ； 并以Ad5腺病毒全基因组为模板，进行PCR ; PCR条件为：预变性95°C 5分钟，变性95°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 30秒，循 环34次，最后延伸72°C 10分钟； 得到含有E3gp-19K序列的PCR产物；将PCR产物和pUC18载体进行双酶切，连 接后并转化大肠杆菌，挑选单克隆后进行酶切与测序鉴定，得到阳性克隆，即构建为 pUC18-E3gp-19K ； 5) 在E3gp-19K编码区初始密码子前方设计下游以snal酶切位点及其保护碱基为5'末 端的正向引物 P2 :ctgatatgcatatggacacaaggatgacga， 及其反相互补弓丨物 P3 :tcgtcatccttgtgtccatatgcatatcag ; 在E3gp-19K编码区终止密码子后方设计下游以notl酶切位点及其保护碱基为5'末 端的正向 P5 引物：gccgcggccgcggggcggaattcgttat， 及其反向互补引物 P4 :ataacgaattccgccccgcggccgcggc ; 6) 以pUC18-E3gp-19K为模板，P1、P2为上下游引物，PCR得到以Hindlll/snal为首尾 的含有E3gp-19K启动子增强子区域序列的DNA产物； PCR条件为：预变性95°C 5分钟，变性95°C 30秒，退火55°C 30秒，延伸72°C 30秒，循 环34次，最后延伸72°C 10分钟； 7) 以pUC18-E3gp-19K为模板，P3、P4为上下游引物，PCR得到以snal/notl为首尾的 含有E3gp-19K编码区序列的DNA产物； PCR条件为：预变性95°C 5分钟，变性95°C 30秒，退火60°C 30秒，延伸72°C 30秒，循 环34次，最后延伸72°C 10分钟； 8) 以pUC18-E3gp-19K为模板，P5、P6为上下游引物，PCR得到以notl/EcoRI为首尾的 含有E3gp-19K编码后方3 '无义区的DNA产物； PCR条件为：预变性95°C 5分钟，变性95°C 30秒，退火58°C 30秒，延伸72°C 30秒，循 环34次，最后延伸72°C 10分钟； 9) 将上述3种DNA产物分别以各自首尾酶切位点的内切酶进行双酶切，并将 pUC18-E3gp-19K以HindIII及EcoRI进行双酶切并回收pUC18载体，经回收共得到4段两 端均为粘性末端的DNA片段； 10) 以连接酶将这4段DNA以Hindlll/snal/notl/EcRI的顺序连接成环，转入大肠杆 菌并挑选单克隆，经过酶切鉴定及测序鉴定得到阳性克隆，即为导入有snal/notl酶切位 点的pUC18-E3gp-19K新序列； 11) 将P16CDS序列的PCR产物及导入snal/notl酶切位点的pUC18-E3gp-19K新序列 用snal以及notl双酶切； 12) 连接酶连接，并转入大肠杆菌，经单克隆筛选、酶切与测序鉴定，阳性克隆即为含有 E3gp-19K启动增强子及P16CDS序列的pUC18-P16 ; 13) 将Ad5溶瘤腺病毒及上面得到的pUC18-P16用Pmel酶切，并于BJ5183细胞内进行 同源重组，挑选单克隆，经酶切与测序鉴定得到鉴定为阳性的克隆，即为高效表达人P16S 因的重组人溶瘤腺病毒Ad5-P16。4. 一种权利要求1所述具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒 Ad5-P16在肿瘤细胞内能特异性增殖并杀伤肿瘤细胞及其抗肿瘤的中应用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性的重组溶瘤腺病毒Ad5-P16及其应用。溶瘤腺病毒是在腺病毒基础上经基因改造使其只能在肿瘤细胞内而不能在正常细胞内复制，从而具有肿瘤组织靶向性。P16是一种抑癌基因，其突变与缺失被发现与多种癌症的发生发展有着密切联系。正常组织中P16抑制基因组复制，阻止细胞从G1期向S期转化，而肿瘤细胞P16的缺失或突变导致细胞周期加速、失控，癌细胞恶性生长。本发明公开的溶瘤腺病毒Ad5-P16，将腺病毒原有的E3gpP16基因利用导入酶切位点突变技术替换为抑癌基因P16，使其兼具肿瘤组织靶向性和抑癌基因修复性，经体外MTT实验及小鼠颅内肿瘤抑制实验证明，具有高效抑制、杀伤肿瘤细胞的效果。
【IPC分类】C12N15/861, A61P35/00, C12N7/01
【公开号】CN104946602
【申请号】CN201510319233
【发明人】熊方园
【申请人】华中科技大学同济医学院附属同济医院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月11日