一种h9亚型禽流感病毒株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物兽药技术领域，具体涉及一种H9亚型禽流感病毒株。
【背景技术】
[0002] H9亚型禽流感属于低致病性疫病，但与其他病原特别是大肠杆菌混合感染能够提 高其致病力，引起产蛋量严重下降和死亡率显著提高，给养禽业带来严重的危害。已有的禽 流感（H9亚型）疫苗已在临床广泛使用，但存在抗体水平较低和抗体整齐度方面的问题，从 而影响到疫苗的防治效果。
[0003] 低致病H9亚型禽流感的发生是潜在性的，但也可以给养禽业带来灭顶之灾，对 人类的威胁同样严重。低致病性禽流感病毒的流行特点是分布极为广泛，危害持久和难以 控制。尤其是H9N2禽流感病毒（AlV)，不仅在全世界范围的禽类中广泛流行，而且可以感染 人。因此，对H9N2A1V的研宄工作也非常重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种H9亚型禽流感病毒株；并用该病毒株来制备疫苗，从而 克服由于该新型病毒导致已有的H9亚型禽流感病毒疫苗免疫效果不好的问题。
[0005] 本发明的H9亚型禽流感病毒QDY株（Avian influenza virus)，已于2015年4月 29日保藏于武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC N0:V201517。
[0006] 本发明的H9亚型禽流感病毒QDY株用于制备疫苗
[0007] 本发明另一个方面还提供一种H9亚型禽流感病毒灭活疫苗，包括抗原和疫苗佐 剂，其所用的抗原为灭活的H9亚型禽流感病毒QDY株。
[0008] 其中的H9亚型禽流感病毒株经过甲醛溶液灭活后作为抗原备用；
[0009] 上述的疫苗中H9亚型禽流感病毒的含量不低于为106_°EID5(l/0. 3ml。
[0010] 本发明将H9亚型禽流感病毒（QDY株），接种鸡胚后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛 溶液灭活后加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提 高免疫后抗体的整齐度，保证了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。
【具体实施方式】
[0011] 本发明筛选出效价高、免疫原性好的禽流感毒株（QDY株）经灭活后作为抗原，加 入油佐剂，制备了新型的禽流感病毒灭活疫苗。
[0012] 下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。本发明所应用的方法可以采用疫 苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
[0013] 实施例1、制苗用抗原毒株（H9亚型禽流感病毒QDY株）的筛选
[0014] 2013年从山东城阳地区已接种了 H9亚型禽流感病毒疫苗的发病鸡群中，无菌采 集发病鸡的心、脾等脏器和喉头、泄殖腔拭子，灭菌平皿中无菌条件下进行研碎，按1:5的 比例加入含4000单位/ml双抗的生理盐水，于-20°C反复冻融3次。棉拭子直接放入含1 万单位双抗的生理盐水中，2~8°C作用4h，脏器及棉拭子均3500rpm离心10min，取上清， 混合后接种10日龄的SPF鸡胚5枚，0. 2ml/枚。鸡胚置37°C孵育，每天早晚各照检一次， 及时取出死胚置4°C冰箱中保存，弃去24h内的死亡胚，至96h时取出全部鸡胚。逐胚收集 鸡胚尿囊液，血凝试验检测病毒效价，连续传代3次。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含 量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明该毒株病毒含量为 10 8_9EID5tlA). Iml，该病毒仅与H9亚型禽流感病毒发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病 毒污染，适合作为制苗用毒株。
[0015] 将筛选QDY株保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所 的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No !M201517。
[0016] 对筛选的QDY株的基因 HA进行测序，结果HA全长为1683bp，编码560个氨基酸； NCBI的blast序列分析表明，QDY株的结构基因 HA与已公开的禽流感病毒的HA存在差异 位点，同源性为97. 5%~98. 8%;表明本发明所筛选的QDY株为一新型的H9亚型禽流感病 毒株。
[0017] 为了检测上述氨基酸的差异对QDY株抗原性的影响，用其来制备抗原来检测其免 疫原性。
[0018] 实施例2 :制苗用抗原的制备
[0019] L制苗用病毒液的制备将生产用毒种（QDY株）经尿囊腔接种10~11日龄SPF 鸡胚，每胚0. 2ml，36°C~37°C孵育，每日照胚2次，取24小时后死亡的鸡胚，至96小时 无论死亡与否全部收获，置4~8°C冷却12~24小时，收获鸡胚液，混合于无菌容器中，置 2~8°C保存。
[0020] 2.制苗用鸡α干扰素蛋白的制备发酵罐通气培养，按发酵罐容积70%配制培养 基，用lmol/L NaOH调节pH值至7.0~7. 2,按培养基总体积0.02%加入消泡剂。灭菌 后按1%~2%接种量接种生产用菌种，按总体积0. 1%的比例加入10%的硫酸卡那霉素 注射液，36°C培养，2. 5小时后，每隔10分钟取样测0D600nm值，待菌液的0D600nm值达到 0. 6~0. 8之间时，再按总体积0. 1%的比例加入10%的硫酸卡那霉素注射液，同时加入灭 菌0. 5mol/L α -乳糖溶液，使其终浓度达到〇. 〇3mol/L，诱导表达5小时。整个培养过程中 通过调节进气量和搅拌速度来控制溶氧35%~50%。培养结束后，快速冷却发酵液至15°C 以下。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体湿重加 IOml生理盐水进行菌体重悬，超 声波破菌，破菌时温度控制在15°C以下。在显微镜下检查破菌液，待99%以上菌体破碎后 停止破菌。破碎后的菌液离心，收集上清液，硫酸铵法提取纯化鸡α干扰素蛋白，经过滤除 菌，4°C保存备用。
[0021] 3.灭活将病毒液置于灭活瓶内，计量加入10%甲醛溶液，随加随摇，使其充分混 合，甲醛溶液的最终浓度为0. 1%。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附 的病毒未能接触灭活剂。37°c灭活16小时后取出，置2~8°C保存。
[0022] 4.半成品检验
[0023] (1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
[0024] (2)病毒含量测定将病毒液用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10'10'10' 10- 8、10-95个稀释度，分别尿囊腔接种10~11日龄SPF鸡胚，每胚0. lml，同时设接种生理 盐水对照5枚，每胚0. 2ml。置36~37°C