继续孵育，每日照胚2次，观察96小时。测定每 个鸡胚尿囊液的血凝效价，血凝效价不小于24,判为感染并计算EID5Q。
[0025] (3)灭活检验将灭活后的病毒液尿囊腔接种10~11日龄SPF鸡胚10枚，每胚 0. 2ml，置36~37°C继续孵育，连续观察96小时。测定每个鸡胚尿囊液的血凝效价，血凝效 价不小于24,判为感染并计算EID 5(i。
[0026] (4)鸡α干扰素蛋白含量检测参照细胞病变抑制法，检测蛋白对于VSV病毒的抑 制效果，计算鸡α干扰素蛋白效价。
[0027] 实施例3 :
[0028] -、灭活疫苗的制备：经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备（以下配制中 各液体成分按体积比计）。
[0029] (1)油相制备取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80°C 后，再加司本一 805份，至温度达到115°C时，维持30min，冷却后备用。
[0030] (2)水相制备将鸡α干扰素蛋白使用生理盐水稀释成2X104_°~2X10 6 (1单位 /0.1 ml ;将灭活的H9亚型禽流感病毒液使用生理盐水稀释至不低于2X 106_°EID5(l/0. lml。 分别取鸡α干扰素蛋白液和灭活的H9亚型禽流感病毒液各1份，混合配成制苗用抗原液。 取灭菌后的5份吐温-80,加入配液罐中，同时加入制苗用抗原液95份，搅拌20~30min， 使吐温-80完全溶解。
[0031] (3)乳化取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入 水相1份，以l〇〇〇〇r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底 析出的水相应不超过〇. 5ml。
[0032] 二、疫苗成品检验
[0033] (1)性状
[0034] 外观疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。
[0035] 剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不 扩散。
[0036] 稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水 相应不超过0. 5ml。
[0037] 黏度按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0038] (2)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0039] (3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
[0040] (4)安全检验用7日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗I. 0ml，同时设对照5 只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸡采食、饮水及临床情况。应不出现由 疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
[0041] (5)效力检验
[0042] ①用21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗，0. 3ml/只，另取5只同日龄鸡 不免疫作对照，免后21日，采血分离血清，分别测定抗体。免疫组抗体效价，应不低于28,对 照组应均为阴性。
[0043] ②对地方流行毒株的攻毒保护35日龄SPF鸡60只，每只颈部皮下注射疫苗， 0. 3ml/只，另取60只同日龄SPF鸡作为不免疫作对照。于免疫后28日，免疫组和对照组均 采血测定抗体并随机分为5组，攻毒6株各地方分离株，10倍稀释后每只静脉注射0. lml。 结果表明，用QDY株灭活病毒液和适当效价的鸡α干扰素蛋白制备的H9亚型禽流感病毒 灭活疫苗，能抵御各地方分离毒的攻击（参见表1)。
[0044] 表1对地方流行毒株的攻毒保护
[0046] ③疫苗的特异性检测：
[0047] 用本发明的QDY株作为病源进行攻毒实验，对象分别为免疫了目前市售的Η9亚型 禽流感病毒疫苗和本发明制备的疫苗，结果表明本发明疫苗的免疫效果更好，发病率远低 于其市售疫苗（Ρ < 〇. 05)，上述的结果也表明本发明所筛选的病毒与已报道的Η9亚型禽流 感病毒存在遗传背景上的差异。
[0048] ④与未加鸡α干扰素的灭活疫苗免疫效果比较使用鸡α干扰素蛋白制备的Η9 亚型禽流感病毒灭活疫苗免疫21日龄SPF鸡10只，每只颈部皮下注射疫苗，0. 3ml/只；另 1组使用未加鸡α干扰素的灭活疫苗免疫，同样免疫剂量，于免疫后7日、14日、21日、28 日、35日、42日、60日采血检测抗体。结果，使用鸡α干扰素蛋白制备的灭活疫苗免疫组抗 体出现时间早于未加鸡α干扰素的灭活疫苗免疫组，抗体水平显著高于未加鸡α干扰素 的灭活疫苗免疫组，平均抗体最高可提高2 2 (详见表2)。
[0049] 表2:与未加鸡α干扰素的灭活疫苗免疫效果比较
[0050]
【主权项】
1. 一种H9亚型禽流感病毒，其特征在于，所述的病毒为H9亚型禽流感病毒QDY株。2. 如权利要求1所述的H9亚型禽流感病毒，其特征在于，所述QDY株的保藏编号为 CCTCC N0:V201517。3. 权利要求1所述的H9亚型禽流感病毒用于制备疫苗。4. 一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原为灭活的权利要求1所述的H9亚型禽流 感病毒。5. 如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的H9亚型禽流感病毒经过甲醛溶液灭 活。6. 如权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述的H9亚型禽流感病毒的含量不低于为 106 0EID50/0. 3ml〇
【专利摘要】本发明的目的是提供一种H9亚型禽流感病毒株；并用该病毒株来制备疫苗，从而克服由于该新型病毒导致已有的H9亚型禽流感病毒疫苗免疫效果不好的问题。本发明的H9亚型禽流感病毒QDY株(Avian influenza virus)，已于2015年4月29日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V201517。本发明将H9亚型禽流感病毒(QDY株)，接种鸡胚后收取病毒液，经超滤浓缩、甲醛溶液灭活后加油佐剂混合乳化制成疫苗。本发明制备的疫苗能提高免疫后的抗体水平，提高免疫后抗体的整齐度，保证了疫苗的免疫效果，此疫苗具有高效、安全性好的优点。CCTCC NO:V20151720150429
【IPC分类】C12R1/93, C12N7/00, A61P31/16, A61K39/145
【公开号】CN104946600
【申请号】CN201510394351
【发明人】刘新文, 杜元钊, 宫晓, 李陆梅, 程增青, 邹敏, 王龙
【申请人】青岛易邦生物工程有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月7日