专利名称：定点突变的人胰岛素原基因及其腺病毒重组载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物遗传领域，尤其是用于治疗糖尿病的定点突变的人胰 岛素原基因及其腺病毒重组载体。
背景技术：
目前糖尿病已成为仅次于心脑血管病症和癌症的第三大死亡疾病，据
WH0统计，全民糖尿病患者已接近1.5亿，我国目前糖尿病患者的总数已达 到5000万人。它是一种影响体内胰岛素和糖含量的疾病，共有两种主要类 型，分别为I型和II型，其共同特征是胰岛P细胞损伤或不能产生足够 的胰岛素或机体不能有效的利用胰岛素，所以胰岛素就被作为治疗糖尿病 的特效药应用于临床。由于随时需要注射胰岛素，给患者带来了极大的不 便，目前国际上对糖尿病进行胰岛移植和基因治疗研究成为了热点。
在I型糖尿病中，免疫系统被误导，对分泌胰岛素的胰腺细胞发动攻 击导致调控糖代谢的胰岛素水平降低甚至不复存在。I型糖尿病病人必须每 天注射胰岛素才能维持生命。II型糖尿病的发病机制较复杂，与多种因素 相关，身体不能生成足够的胰岛素或者不能有效利用胰岛素。目前的治疗 主要着眼于改善机体的胰岛素敏感性，纠正代谢紊乱，其基因治疗报道甚 少。如果糖尿病患者不能适当地控制其血糖水平，则可能产生严重的并发 症，包括心脏病、肾衰、失明和神经损伤。
胰岛素主要用于i型糖尿病和口服降糖药不理想及严重并发症的n型
糖尿病的治疗，其作为糖尿病的特效药用于临床已有70多年的历史。但是 由于胰岛素半衰期短，糖尿病患者随时需要注射胰岛素，给患者带来了极 大痛苦和不便，虽然口服胰岛素和长效胰岛素在某种程度上有所进步，但 是未能从根本上解决问题。研究者们就把目光转向了对糖尿病患者进行胰 岛移植和基因治疗。胰腺或胰岛移植被认为是治愈I型糖尿病的有效手段， 但是供体来源不足、自身免疫排斥反应、供体存活率低和代价昂贵等问题 限制了这一疗法的广泛应用。而基因治疗恰恰可避免上述缺陷，它是通过 将胰岛素基因导入不受自身免疫攻击的非P细胞，使之表达胰岛素，行使代替P细胞的功能，从而达到从根本上治愈I型糖尿病的目的。
随着分子生物学领域取得的迅猛发展，特别是随着基因重组和转基因 技术的发展，使基因治疗糖尿病成为可能。基因治疗糖尿病目前存在的两 个主要问题，S卩胰岛素原基因在非e细胞中不能表达为成熟的胰岛素； 选择什么样的安全有效的载体系统。研究发现，只有胰岛P细胞含有特定 前激素转化酶(PC2和PC3)，可以把人胰岛素原合成为成熟的具有生理活性 的胰岛素A链和B链复合体。而非P细胞不含这类酶，研究者们直接将人 胰岛素原基因转染到其中，并不能合成成熟的胰岛素。但在大多数非3细
胞内普遍表达furin蛋白酶，它的底物是Arg Thr Lys Arg或Arg Gin Lys Arg。在C肽的两端进行定点突变，使其成为furin蛋白酶的底物。另外， 对于选择安全有效的载体系统，腺病毒载体是在基因治疗、基因免疫等方 面应用开发得较早的一种基因载体，在美国近三分之一的基因治疗临床试 验中采用腺病毒载体。这些腺病毒载体现在正在被评估作为载体对癌症、 心血管疾病和遗传紊乱等病人进行基因治疗的安全性和有效性。根据美国 国家卫生院的生物技术活动办公室统计，在过去的20年里，己进行了将近 144例使用腺病毒载体的基因治疗临床试验，在所有参与基因治疗临床试验 的病人中，将近五分之一己引入了腺病毒载体。研究者们把定点突变的人 胰岛素原基因构建到真核表达载体(如pcDNA3. 1、 p (G1RE) 3BP-1、 p EF1 a-GFP等)或逆转录病毒载体(pLNCX、 PLXSN等)中，但是这些真核表达 载体只能转染处于分裂期的细胞，对于非分裂期的细胞它们的转染效率非 常的低；而逆转录病毒载体使用起来不安全，它们转染宿主细胞后要整合 到宿主细胞的基因组中，极有可能引起致癌基因的激活。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是将野生型人胰岛素原基因进行定点突
变，然后将其构建到腺病毒载体系统pAdEasy-l中，为进一步转染非胰岛 e细胞，对糖尿病进行基因治疗奠定基础。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是(1) RT — PCR方 法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原cDNA ; (2)重叠延伸 PCR方法在人胰岛素原cDNA上制造两个突变位点，以使其可以被蛋白酶 Furin切割成熟，该突变型胰岛素原cDNA片段命名为胰岛素一M2
5(INS-M2) ; (3)将INS-M2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆 位点(Hind III和XhoI)上，并与骨架载体共转染至BJ5183细菌内，通过 细菌内同源重组得到重组载体。
一种定点突变的人胰岛素原基因，通过重叠延伸PCR方法在人胰岛素 原cDNA上制造两个突变位点163-164和263位点，使其被蛋白酶Fur in切 割成熟，获得定点突变的人胰岛素原基因。
人胰岛素原cDNA的碱基序列为SEQ ID NO. 1，经过两个突变位点获得 定点突变的人胰岛素原基因的碱基序列为SEQ ID NO. 3，命名为INS-M2。
一种定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体，将INS-M2亚克隆至 腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点Hind III和Xhol上，并与骨架载 体共转染至BJ5183细菌内，通过细菌内同源重组得到重组载体。
将腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV和突变型人胰岛素原基因頂S—M2分 别用HindIII和Xhol双酶切，纯化、回收双酶切产物进行连接，连接产物 命名为pAdtrack-INS-M2; pAdtrack-INS-M2质粒经Pmel酶线性化、去磷 酸化，以回收的CIAP处理的线性化pAdtrack-INS-M2质粒转化常规氯化钙 方法制备的BJ5183pAdEasier-1感受态细胞，接种于卡那霉素的LB培养基 内，获得定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体，命名为pAd-INS-M2， 构建策略见图6。
腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV和突变型人胰岛素原基因INS—M2进行 连接反应条件为INS—M2双酶切产物5y 1、pAdtrack-CMV双酶切产物3u 1、 Buffer lul、 T4 DNA连接酶ltil， 16°C 16h。
pAdtrack-INS-M2质粒经Pmel酶线性化的条件是pAdtrack-INS-M2 质粒2ug，尸/ffe/ 1U， 10 X NEB buff er4 5uL， 100 XBSA 0. 5 u L，补足 去离子水至总体积50uL， 37。C水浴4小时，95度水浴10分钟，Takara胶 回收试剂盒纯化回收。
线性化质粒的去磷酸化的条件是线性化的pAdtrack-頂S-M2质粒 lug， 10 XCIAP buffer 5yL， CIAP 1U，补足去离子水至总体积50 u L， 37t:水浴4小时，65度水浴30分钟灭活CIAP，赛百盛小量胶回收试剂盒 浓縮回收。
以回收的CIAP处理的线性化pAdtmck-INS-M2质粒转化常规氯化转方
6法制备的BJ5183pAdEasier-1感受态细胞，铺卡那霉素抗性的LB平板，37 t:孵箱倒置培养14 16小时，挑选数个体积最小的卡那霉素抗性菌落，接 种于3mL含有50 u g/mL卡那霉素的LB培养基内，37°C中速振荡培养过夜。 本发明的有益效果使人胰岛素原基因在非e细胞内可以表达为成熟 的胰岛素分泌出来成为可能，为高效的转染处于非分裂期的细胞奠定了基 础。
图1野生型INS cDNA凝胶电泳分析
图2突变型INS—M1和INS—M2凝胶电泳分析(M: DL2000 Marker; 1: PCR1 products; 2: PCR2 products; 3: PCR products of INS —Ml; 4: PCR3 products; 5: PCR4 products; 6: PCR products of頂S—M2;)
图3 pAd—INS—M2的凝胶电泳分析及PCR鉴定(M: DL15000 marker; 1: pAd-INS-M2; 2: Digestion with Pac I ; 3: PCR products of INS-M2)
图4载体构建图。
具体实施例方式
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明 本发明的定点突变的人胰岛素原基因，通过重叠延伸PCR方法在人胰
岛素原cDNA上制造两个突变位点163-164和263位点，使其被蛋白酶Furin 切割成熟，获得定点突变的人胰岛素原基因。
一、野生型人胰岛素原基因的获得应用RT-PCR方法从胎龄5m的经 水囊引产的健康胎儿胰腺组织中克隆野生型人胰岛素原基因。
1、 RNA提取采用Trizol—步法，1)无菌取健康新鲜流产胎儿胰腺 组织块70mg用液氮在研钵中研磨成粉末，加入lmlTrizol，吹打混匀，转移 至一个1. 5ml的EP管中，室温静置5分钟。2)加入0. 2ml氯仿，剧烈振 荡15秒，室温静置2-3分钟。12000g， 4。C，离心15分钟。3)取上清，加 入0.5 ml异丙醇室温静置15分钟。12000g, 4°C，离心15分钟。4)弃上 清，加入lml 75%的乙醇洗，7500g， 4°C，离心5分钟。4)弃上清，沉淀 晾干，加入30ial DEPC水溶解。
2、 逆转录为cDNA (40yl):取2. 5mMdNTP4 ii 1 ， 5xfirst strand buffer 8 u 1 ， DTT4u 1， 01igodT2ul，水16. 6 u 1 ，混匀后加入RNA约2ug， 65°C水浴5分钟，快速冰浴2-3分钟。加入50u/u lRNasin0. 4 u 1， Superscript II (200u/u 1 ) 1 u 1混匀后37°C水浴>1小时。取出后70。C 水浴10分钟。—20。C保存。
3、 PCR扩增野生型人胰岛素原基因根据Genebank发表的人胰岛素 原基因cDNA序列，综合利用Primer5和01igo6引物设计软件设计人胰岛 素原基因全长的引物，INS1: 5—GCT CTC GAG GCC ACC ATG GCC CTG TGG AT —3 ; INS2: 5— GAG AAG CTT GCT GCG TCT AGT TGC AGT AGT-3，划 线部分为酶切位点(Xhol和Hindin)。
反应条件以胰腺组织cDNA为模板，以上述頂S1和INS2为引物，扩 增人INS全长基因序列。采用50uL体系，具体如下
10XPCR Buffer (含Mg2+1.5mM) 5uL
4XdNTP (10mM/mL) 4yL
INS上游引物(20pmol/L) 2uL
INS下游引物(20pmol/L) 2"L
c腿 2 u L
Pyrobest DNA聚合酶 0. 3 u L
灭菌去离子水 补足到50uL PCR扩增程序为
反应条件为94。C变性5minute ;94。C变性30 seconds, 60。C退火30 seconds, 72°C延伸1 minute; 72°C延伸10 minute,共35个循环。
4、测序载体的构建PMD-18T载体为本实验室所保存。将PMD18T载 体用Xhol和HindIII双酶切，野生型人胰岛素原基因PCR产物回收后补加 Taq酶O. 5uL， 72°C 15minute，与PMD-18T载体连接后，按常规方法氯化 钙转化，挑取单个克隆，摇菌后小量提取质粒，经PCR和Xhol /Hindlll 双酶切鉴定后，送测序，见SEQ IDNO.l，该基因完全符合Genebank上发 表的人胰岛素原基因序列，命名为INS (见图l)。
二、人胰岛素原基因的定点突变根据PCR定点突变原理，分别在人 胰岛素原基因B链/C肽及C肽/A链连接处进行两次突变，突变引物设计如 下INS3: 5—TTC TTC TAC ACA CCC巡ACC CGC—3; INS4: 5—GCG GGTC^" GGG TGT GTA GAA GAA —3 ; INS5: 5—GTC CCf GCA GAA GCG TGG CAT TGT —3; 1懸5—ACA ATG CCA CGC TTC TGC， GAC —3;弓l物INS3、 INS4 和引物INS5、頂S6分别是互补的，只有斜粗体划线部分为突变的位点。
1、 第一个位点的突变以获得的经测序正确的野生型人胰岛素原基因 为模板，首先进行B链/C肽连接处的突变。用引物INS1、 INS4和引物INS3、 頂S2分别扩增出两段PCR产物1和2，PCR1的扩增条件为94。C变性5minute ; 94。C变性30 seconds, 60。C退火30 seconds, 72°C延伸1 minute; 72°C延 伸10 minute,共35个循环。PCR2的扩增条件为94。C变性5minute ; 94 。C变性30 seconds, 62。C退火30 seconds, 72°C延伸1 minute; 72°C延 伸10 minute,共35个循环。利用引物INS3和頂S4的互补部分使这两段 PCR产物互为模板和引物，在DNA聚合酶的作用下延伸出整条人胰岛素原基 因，扩增条件为94。C5minute ; 94°C 30 seconds, 60°C 30 seconds, 72 °C 30 seconds; 7 Cycles。然后再加入引物INS1和INS2各1 u L，并补加 Pyr0beSt DNA聚合酶0. 5 u L，继续扩增含有第一个突变位点的人胰岛素原 基因，扩增条4牛为94°C 5minute ; 94°C 30 seconds, 60°C 30 seconds, 72°C 30 seconds; 30 Cycles; 72°C 7minute。并补力卩Taq酶0. 5 u L， 72°C 15minute，然后将扩增产物连接到T载体中，并送测序公司测序鉴定。测 序结果显示第一个位点突变成功，序列见SEQIDNO. 2。命名为INS—M1 (见 图2)。
2、 第二个位点的突变以INS—M1基因为模板，进行C肽/A链连接处 的突变。用引物頂S1和頂S6、 INS5和INS2分别扩增PCR3和PCR4产物片 断。PCR3的扩增条件为94。C变性5minute ; 94。C变性30 seconds, 62°C 退火30 seconds, 72°C延伸1 minute; 72°C延伸10 minute,共35个循 环。PCR4的扩增条件为94。C变性5minute ; 94。C变性30 seconds, 60°C 退火30 seconds, 72°C延伸1 minute; 72°C延伸10 minute,共35个循 环。利用引物INS5和INS6的互补部分使这两段PCR产物互为模板和引物， 在DNA聚合酶的作用下延伸出整条人胰岛素原基因，扩增条件为94°C 5minute ; 94。C 30 seconds, 60°C 30 seconds, 72。C 30 seconds; 7 Cycles。 然后再加入引物INS1和INS2各1 u L，并补加PyrobestTMDNA聚合酶0. 5 u L， 继续扩增含有第一个突变位点的人胰岛素原基因，扩增条件为94°C
95minute ; 94。C 30 seconds, 60°C 30 seconds, 72。C 30 seconds; 30 Cycles; 72°C 7minute。补加Taq酶O. 5uL， 72°C 15minute。然后将扩增产物连接 到T载体中，并送测序公司测序鉴定，见SEQIDN0.3。测序结果显示第二 个位点突变也突变成功。命名为INS—M2。(见图2)
三、 穿梭腺病毒载体的构建
穿梭质粒pAdtrack-CMV保存于DH5 a菌株中。自-80。C冰箱中取出冻 存的甘油菌，用灭菌的接种针刮拭少许菌液，立即划板于含50ug/mL卡那 霉素的LB琼脂平板表面。平板放置37'C过夜继续培养。12小时后自抗性 LB琼脂平板表面挑取中等大小的单克隆菌落，接种于含有相应抗生素的LB 液体培养基中，37°C 200rpm培养过夜。然后小量提取质粒。将腺病毒穿梭 质粒pAdtmck-CMV和突变型人胰岛素原基因(INS—M2)分别用HindIII和 Xhol双酶切，纯化、回收双酶切产物进行连接，连接反应条件为INS—M2 双酶切产物5ti1、 pAdtrack-CMV双酶切产物1、 Buffer lu 1、 T4 DNA 连接酶lul， 16°C 16h，连接产物命名为pAdtrack-INS-M2，转化DH5a感 受态细胞，铺板、挑菌、摇菌、提取质粒，HindIII、 Xho I酶切鉴定。结果 显示穿梭腺病毒载体构建成功。
四、 重组腺病毒载体的构建
1、 pAdtrack-INS-M2质粒经Pmel酶线性化 pAdtrack-INS-M2质粒 2 ti g 尸膨/ 1U
10XNEB buffer4 5uL 100XBSA 0. 5uL
补足去离子水至总体积50u L， 37。C水浴4小时，95度水浴10分 钟，Takara胶回收试剂盒纯化回收。
2、 线性化质粒的去磷酸化
线性化的pAdtrack-INS-M2质粒 1 p g
10XCIAP buffer 5uL CIAP 1U 补足去离子水至总体积50 u L， 37。C水浴4小时，65度水浴30分钟灭 活CIAP，赛百盛小量胶回收试剂盒浓縮回收。3、 BJ5183 pAdEasier-l氯化钙法感受态细胞的制备
E. coli BJ5183甘油菌复苏，常规氯化f丐方法制备BJ5183感受态细胞。 取1 li L pAdEasier-1质粒转化BJ5183感受态细胞，铺链霉素/氨节青霉素 双抗性LB平板(浓度均为50ug/mL)，置37"孵箱培养。12-16h后，挑 取数个克隆，接种于链霉素/氨苄青霉素双抗性LB培养基，37r振荡过夜。 次日晨收菌，将含有pAdEasier-l质粒的BJ5183菌按照常规氯化钙的方法 制备BJ5183pAdEasier-l感受态细胞。
4、 细菌内同源重组及鉴定
以回收的CIAP处理的线性化pAdtrack-INS-M2质粒转化常规氯化钙方 法制备的BJ5183pAdEasier-l感受态细胞，铺卡那霉素抗性的LB平板，37 'C孵箱倒置培养14 16小时。挑选数个体积最小的卡那霉素抗性菌落，接 种于3mL含有50 p g/mL卡那霉素的LB培养基内，37°C中速振荡培养过夜。 用赛百盛质粒抽提试剂盒小量抽提质粒DNA， 0. 8%琼脂糖凝胶电泳根据质粒 大小初步鉴定。选取近40Kb大小的质粒，用PCR及尸sc/酶切的方法鉴定 重组子。
尸scl酶切反应条件如下 候选质粒 1 u g
尸sc/ 1U 10XNEB buffer 1 5uL 100XBSA 0. 5uL
补足去离子水至总体积50 ii L， 37t:水浴4小时，0.8%琼脂糖凝胶电泳 分析酶切结果。正确的重组子命名为pAd-頂S-M2。(见图3)，整个构建 图见图4。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的 有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例， 但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
iiSEQUENCE LISTING (序列表) 〈110〉中国医学科学院血液学研究所 〈120〉定点突变的人胰岛素原基因及其腺病毒重组载体 〈160〉 3
<170〉 Paterrtln version 3. 3
〈210〉 <211> 〈212〉 〈213〉
〈220〉 〈221〉 <222>
1
346 DNA
人类(Homo sapiens)
gene
(l).. (346)
〈400〉 1
gccaccatgg ccctgtggat gcgcctcctg cccctgctgg cgctgctggc cctctgggga 60
cctgacccag ccgcagcctt tgtgaaccaa cacctgtgcg gctcacacct ggtggaagct 120
ctctacctag tgtgcgggga acgaggcttc ttctacacac ccaagacccg ccgggaggca 180
gaggacctgc aggtggggca ggtggagctg ggcgggggcc ctggtgcagg cagcctgcag 240
cccttggccc tggaggggtc cctgcagaag cgtggcattg tggaacaatg ctgtaccagc 300
atctgctccc tctaccagct ggagaactac tgcaactaga cgcagc 346<210〉 2
〈211〉 346
<212〉 DNA
〈213> 人类(Homo sapiens) <220>
<221〉 mutation
〈222〉 (163).. (164)
<400〉 2
gccaccatgg ccctgtggat gcgcctcctg cccctgctgg cgctgctggc cctctgggga 60
cctgacccag ccgcagcctt tgtgaaccaa cacctgtgcg gctcacacct ggtggaagct 120
ctctacctag tgtgcgggga acgaggcttc ttctacacac cccggacccg ccgggaggca 180
gaggacctgc aggtggggca ggtggagctg ggcgggggcc ctggtgcagg cagcctgcag 240
cccttggccc tggaggggtc cctgcagaag cgtggcattg tggaacaatg ctgtaccagc 300
atctgctccc tctaccagct ggagaactac tgcaactaga cgcagc 346
〈210〉 3
〈211〉 346
<212> 腿
〈213〉 人类(Homo sapiens) <220〉
<221〉 mutation
<222> (263).■ (263)
〈400〉 3gccaccatgg ccctgtggat gcgcctcctg cccctgctgg cgctgctggc cctctgggga 60
cctgacccag ccgcagcctt tgtgaaccaa cacctgtgcg gctcacacct ggtggaagct 120
ctctacctag tgtgcgggga acgaggcttx ttctacacac cccggacccg ccgggaggca 180
gaggacctgc aggtggggca ggtggagctg ggcgggggcc ctggtgcagg cagcctgc已g 240
cccttggccc tggaggggtc ccggcagaag cgtggcattg tggaacaatg ctgtaccagc 300
atctgctccc tctaccagct ggagaactac tgcaactaga cgcagc 346
1权利要求
1、一种定点突变的人胰岛素原基因，其特征在于，通过重叠延伸PCR方法在人胰岛素原cDNA上制造两个突变位点163-164和263位点，使其被蛋白酶Furin切割成熟，获得定点突变的人胰岛素原基因。
2、 根据权利要求l所述的定点突变的人胰岛素原基因，其特征在于， 人胰岛素原cDNA的碱基序列为SEQ ID NO. 1，经过两个突变位点获得定点 突变的人胰岛素原基因的碱基序列为SEQ ID NO. 3，命名为INS-M2。
3、 一种定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体，其特征在于，将 INS-M2亚克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点Hind III和Xhol 上，并与骨架载体共转染至BJ5183细菌内，通过细菌内同源重组得到重组 载体。
4、 根据权利要求3所述的定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体， 其特征在于，将腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV和突变型人胰岛素原基因INS 一M2分别用HindlII和XhoI双酶切，纯化、回收双酶切产物进行连接，连 接产物命名为pAdtrack-INS-M2; pAdtrack-頂S-M2质粒经Pmel酶线性化、 去磷酸化，以回收的CIAP处理的线性化pAdtrack-INS-M2质粒转化常规氯 化钙方法制备的BJ5183pAdEasier-1感受态细胞，接种于卡那霉素的LB培 养基内，获得定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体，命名为 pAd-INS-M2，构建策略见图6。
5、 根据权利要求4所述的定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体， 其特征在于，腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV和突变型人胰岛素原基因INS 一M2进行连接反应条件为INS—M2双酶切产物5 til、 pAdtrack-CMV双酶切 产物3ul、 Buffer liil、 T4 DNA连接酶lyl， 16°C 16h。
6、 根据权利要求4所述的定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体， 其特征在于，pAdtmck-INS-M2质粒经Pmel酶线性化的条件是 pAdtrack-INS-M2质粒2ug，尸历e/lU， 10XNEB buffer4 5iiL， 100XBSA 0. 5uL，补足去离子水至总体积50uL， 37t:水浴4小时，95度水浴10分 钟，Takara胶回收试剂盒纯化回收。
7、 根据权利要求4所述的定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体， 其特征在于，线性化质粒的去磷酸化的条件是线性化的pAdtrack-INS-M2质粒lug， 10XCIAP buffer 5uL， CIAP 1U，补足去离子水至总体积 50uL， 37。C水浴4小时，65度水浴30分钟灭活CIAP，赛百盛小量胶回收 试剂盒浓縮回收。
8、根据权利要求4所述的定点突变的人胰岛素原基因腺病毒重组载体， 其特征在于，以回收的CIAP处理的线性化pAdtrack-頂S-M2质粒转化常规 氯化钙方法制备的BJ5183pAdEasier-l感受态细胞，铺卡那霉素抗性的LB 平板，37'C孵箱倒置培养14 16小时，挑选数个体积最小的卡那霉素抗性 菌落，接种于3mL含有50ug/mL卡那霉素的LB培养基内，37。C中速振荡 培养过夜。
全文摘要
本发明公开了一种定点突变的人胰岛素原基因及其腺病毒重组载体，(1)RT-PCR方法从正常流产胎儿胰腺组织获取野生型人胰岛素原cDNA；(2)重叠延伸PCR方法在人胰岛素原cDNA上制造两个突变位点，以使其可以被蛋白酶Furin切割成熟，该突变型胰岛素原cDNA片段命名为胰岛素-M2(INS-M2)；(3)将INS-M2克隆至腺病毒载体系统的穿梭载体的多克隆位点(Hind III和XhoI)上，并与骨架载体共转染至BJ5183细菌内，通过细菌内同源重组得到重组载体。本发明使人胰岛素原基因在非β细胞内可以表达为成熟的胰岛素分泌出来成为可能，为高效的转染处于非分裂期的细胞奠定了基础。
文档编号C12N15/861GK101555478SQ20081005265
公开日2009年10月14日 申请日期2008年4月8日 优先权日2008年4月8日
发明者琳 石, 韩忠朝 申请人:中国医学科学院血液学研究所