一种腺癌特异性EpCAM-GM-CSF基因重组融合蛋白及其制备方法
【技术领域】：
[0001] 本发明设及一种基因重组蛋白的制备，特别设及一种腺癌特异性化CAM-GM-CSF 基因重组融合蛋白的制备方法
【背景技术】：
[0002] 肿瘤的细胞免疫治疗已广泛应用于临床，目前在美国登记的治疗型DC值entitle cell,DC)疫苗的临床试验已有数十种。所采用的肿瘤抗原有多种，包括肿瘤细胞裂解物、 肿瘤细胞融合体、肿瘤RNA、肿瘤DNA、肿瘤相关全抗原、蛋白多肤、蛋白单肤等，临床多W肿 瘤细胞裂解物作为抗原制备DC疫苗，从而诱导抗原特异性细胞免疫杀伤。但由于肿瘤微环 境的免疫抑制作用等原因，致使DC疫苗的客观有效率尚不满意。因而如何打破肿瘤免疫耐 受，开发更高效的DC疫苗，成为目前主要的研究方向。
[0003] 化CAM是一种质量为40kDa的、单分子结构的细胞膜糖蛋白，表达在大多正常上 皮细胞，但在大多肿瘤细胞过表达，因而成为上皮来源肿瘤的特征性标记物。化CAM不仅 发挥肿瘤细胞间的粘附作用，而且参与其迁移、增值、及分化等。研究发现，结直肠癌和乳 腺癌的化CAM过表达，且与肿瘤生长、转移及恶性程度密切相关，化CAM过度表达的肿瘤病 人，预后明显变差。研究还发现，应用抗化CAM抗体，能够有效检测出循环血中游离的癌细 胞（Circulatingtumorcells,CTC)，并且对腹腔广泛转移和种植所致腹水，具有良好的疗 效。因而，EpCAM可作为上皮来源肿瘤极好的祀标和抗原，应用于肿瘤检测及肿瘤特异性细 胞免疫治疗。
[0004]粒细胞-巨瞻细胞集落刺激因子（granuloc}fte-mac;rophagecolony-stimulating factor,GM-CS巧在细胞免疫中承担重要的免疫调节功能，能够高效率的促进DC的富集、 抗原吞瞻、抗原加工、抗原提呈、W及T细胞的活化。在DC的扩增培养中，GM-CSF是不可 或缺的辅助细胞因子，而在肿瘤微环境中提高GM-CSF的水平，能部分抵消肿瘤微环境中 的免疫抑制作用，增强DC疫苗的抗原提成功能，从而促进抗原特异性细胞毒T淋己细胞 (切totoxicityTlympho巧tes,CTL)的产生及其特异性杀伤功能。已有很多应用基因转染 技术促进GM-CSF大量分泌的治疗性疫苗进入临床II、III期临床试验。
[0005] 本专利设计目的是，应用基因重组技术，将腺癌特异性化CAM和GM-CSF重组偶联， 制备成纯化程度高、表达稳定的化CAM-GM-CSF融合蛋白，为细胞免疫治疗提供一种腺癌特 异性，同时能促进DC抗原提成功能的重组蛋白抗原，从而显著提高细胞免疫治疗的临床疗 效。
【发明内容】
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[0006] 本发明提供一种腺癌特异性化CAM-GM-CSF基因重组融合蛋白，两种蛋白的氨基 酸序列均为已知序列，EpCAM的氨基酸序列和GM-CSF的氨基酸序列已有文献报道。
[0007] 本发明还提供本发明腺癌特异性化CAM-GM-CSF基因重组融合蛋白的制备方法， 所述方法步骤如下：
[000引步骤1，引物的设计与合成：
[0009] 步骤2,基因扩增和测序，得到化CAM-GM-CSF基因
[0010]步骤3，重组载体祀T-EpCAM-hGM-CSF的构建；
[0011] 步骤4,重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的筛选、鉴定；
[0012] 步骤5,重组质粒祀T-EpCAM-hGM-CSF转化大肠杆菌Rosetta;
[0013] 步骤6,重组化CAM-hGM-CSF融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中诱导表达；
[0014]步骤7，化CAM-hGM-CSF融合蛋白的纯化；
[0015]步骤8，纯化的化CAM-hGM-CSF融合蛋白渗透浓缩。
[0016] 优选的本发明的制备方法如下：
[0017] 步骤1，引物的设计与合成：
[001引化CAM上游引物序列为；
[0019] 5'CATGCCATGGgcATGGCGCCCCCGCAGGT3';(见序列表 1)
[0020] 下游引物序列为：
[0021] 5'ACGCGTCGACTGCATTGAGTTCCCTATGCATC3';(见序列表 2)
[0022] hGM-CSF上游引物序列为；
[0023] 5'ACGCGTCGACATGTGGCTGCAGAGCC3';(见序列表 3)
[0024]下游引物序列为；5'CCGCTCGAGTCACTCCTGGACTGGC3';(见序列表 4)
[0025] 步骤2,基因扩增和测序：
[0026] 从腺癌细胞株LS174-T中提取RNA，然后反转为cDNA，WcDNA为模板，PCR扩增 化CAM基因，WpORFhGM-CSF质粒为模板，PCR扩增hGM-CSF基因；得到的化CAM-GM-CSF基 因；
[0027] 步骤3，重组载体祀T-EpCAM-hGM-CSF的构建；
[002引化CAM片段讯hGM-CSF片段；载体祀T-30a;用T4连接酶进行连接；步骤4,重组 载体祀T-EpCAM-hGM-CSF的筛选、鉴定；
[0029] 化C12法制备大肠杆菌感受态D册a，然后将W上重组载体转化感受态大肠杆菌 D册a，PCR扩增筛选阳性重组载体；
[0030] 步骤5,重组质粒祀T-EpCAM-hGM-CSF转化大肠杆菌Rosetta;
[0031] 将阳性重组载体加入到Rosetta感受态细胞中，加入培养基；
[0032] 步骤6,重组化CAM-hGM-CSF融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中诱导表达；
[0033] 挑取培养基上经重组质粒转化的Rosetta单菌落，接种于卡那抗性的培养基中， 培养，得到菌液，菌液在4°C，600化pm，离屯、20min。弃上清，菌沉-80°C冷冻。
[0034] 步骤7，化CAM-hGM-CSF融合蛋白的纯化；
[003引将收集的菌沉取出，溶于溶液中；超声破碎，离心收集上清。NiSe地arose?6化St Flow上柱，用Washbuffer洗柱 3 次。用Elutionbuffer(50mMPBSPH8.0,0. 3M化Cl， 250mM咪挫）洗脱目的蛋白。
[0036] 步骤8，纯化的化CAM-hGM-CSF融合蛋白渗透浓缩；
[0037] 将洗脱下的、纯化的融合蛋白溶液去除纯化蛋白中含有的咪挫浓缩，离屯、，即得。
[0038]特别优选的，本发明的制备方法如下：
[0039] 步骤1，引物的设计与合成：
[0040] 化CAM上游引物序列为；
[0041] 5'CATGCCATGGgcATGGCGCCCCCGCAGGT3';(见序列表 1)
[0042] 下游引物序列为：
[0043] 5'ACGCGTCGACTGCATTGAGTTCCCTATGCATC3';(见序列表 2)
[0044] 其上下游引物分别引入了限制性内切酶化0I和SalI的酶切位点。
[0045] hGM-CSF上游引物序列为；
[0046] 5'ACGCGTCGACATGTGGCTGCAGAGCC3';(见序列表 3)
[0047]下游引物序列为；5'CCGCTCGAGTCACTCCTGGACTGGC3';(见序列表 4)
[0048] 其上下游引物分别引入了限制性内切酶SalI和化0I的酶切位点。
[0049]W上引物的合成方法根据现有技术，如教科书中的合成方法。
[0050] 步骤2,基因扩增和测序：
[0051] 从腺癌细胞株LS174-T中提取RNA，然后反转为cDNA，WcDNA为模板，PCR扩增 化CAM基因，切胶回收目的片段，将该片段连接至T载体，转化D册a，PCR扩增鉴定阳性斑， 提取阳性斑的质粒并测序。WpORFhGM-CSF质粒为模板，PCR扩增hGM-CSF基因。
[0052] 得到的化CAM-GM-CSF基因。
[0053]步骤3，重组载体祀T-EpCAM-hGM-CSF的构建；
[0054] 用限制性内切酶化0I和SalI酶切测序正确、连有化CAM的T载体，切胶回收 化CAM片段；用限制性内切酶SalI和化0I酶切测序正确、连有hGM-CSF的T载体，切胶 回收hGM-CSF片段；载体祀T-30a用限制性内切酶化0I和化0I，切胶回收载体；然后把 回收的化CAM片段，hGM-CSF片段W及载体用T4连接酶进行连接。
[00巧]步骤4,重组载体祀T-EpCAM-hGM-CSF的筛选、鉴定；
[0056] 化C12法制备大肠杆菌感受态D册a，然后将W上连接产物转化感受态大肠杆菌 畑5a，PCR扩增筛选阳性重组载体，对阳性斑进行质粒提取，并进行酶切鉴定。
[0057] 步骤5,重组质粒祀T-EpCAM-hGM-CSF转化大肠杆菌Rosetta;
[0058] 取5y1鉴定正确的重组质粒加入到100y1Rosetta感受态细胞中，混匀，冰上放 置30min。42°C水浴中热激90秒，热激后迅速置于冰上冷却3-5分钟。加入900y1LB液 体培养基（不含抗性），混匀后37°C振荡培养1小时。4°C，30(K)巧m离屯、lOmin。弃上清， 剩余的重悬菌体（约50y1)涂于含卡那抗性的LB固体培养基，37°C培养12-1化。
[0059] 步骤6,重组化CAM-hGM-CSF融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中诱导表达；
[0060] 挑取LB固体培养基上、经重组质粒转化的Rosetta单菌落，接种于含有卡那抗性 的LB液体培养基中，37°C，振摇培养过夜。次日培养菌液1:50接种于含有卡那抗性的LB 液体培养基中，37°C振摇培养至0D600值达0. 4-0. 6 (约2.化）。培养菌液中，取出1ml做 诱导阴性对照，将IPTG加入到余下的菌液中（终浓度0.ImM)，16°C振摇培养4-化后收集菌 体。诱导后的菌液中，取出1ml，与阴性对照均在4°C，10(K)巧m，离屯、5min。然后将菌沉分别 重悬于100y1 1XSDS凝胶加样缓冲液中，煮沸lOmin，各取20y1，进行SDS-聚丙締酷胺 凝胶电泳（SDS-PAGE)。考马斯亮藍染色，脱色，拍照记录，观察诱导情况。余下的菌液4°C， 6000;rpm，离屯、20min。弃上清，菌沉-80°C冷冻过夜。
[0061]步骤7，化CAM-hGM-CSF融合蛋白的纯化；
[0062] 菌体破碎上清的制备：将收集的菌沉次日取出，冰上放置5min，每400ml诱导菌液 溶于 20mlbuffer6〇mMPBSPH8.0,0. 3MNaCl，lmg/ml溶菌酶）；放置垂直混匀器上 4°C混 匀30min;超声破碎（共lOmin，每破碎3s暂停5s) ;4°C，12000;rpm，离屯、20min，收集上清。 NiSe地arose?ei^astFlow纯化E；pCAM-hGM-CSF融合蛋白；按照HisMagSe地arose(GE) 说明书要求，在菌体超声破碎后得到的上清中加入相应量。放置垂直混匀器上4°C，混匀 30-50min。1000巧m，4°C，离屯、2min，去除上清。Washbuffer(50mMPBSPH8.0,0. 3M化C1， 40mM咪挫）重悬结合融合蛋白的beads,然后上柱，用Washbuffer洗柱3次。用Elution buffer(50mMPBSPH8. 0,0. 3M化Cl，250mM咪挫）洗脱目的蛋白。对纯化前的蛋白W及洗 脱后得到的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳，W观察纯化情况。
[0063]步骤8，纯化的化CAM-hGM-CSF融合蛋白渗透浓缩；
[0064] 将洗脱下的、纯