针对人腺癌抗原的新的重组和嵌合抗体的制作方法

专利名称：针对人腺癌抗原的新的重组和嵌合抗体的制作方法
技术领域：
本发明提供新的DNA化合物和重组DNA克隆载体，它们编码单克隆抗体KS1/4及衍生自KS1/4的小鼠/人嵌合抗体。这些载体可使新的DNA化合物在非淋巴真核细胞中表达。本发明还提供用这些新克隆载体转化的宿主细胞。转化的宿主细胞表达重组或嵌合KS1/4抗体或其衍生物。本发明的DNA化合物中有许多可用来产生以往无论在自然界还是在实验室都从未合成过的KS1/4衍生物，因此本发明还包括这些独特的分子。
单克隆抗体KS1/4是一种鼠类抗体，它与～40，000道尔顿的细胞表面抗原特异结合，此抗原以高密度存在于腺癌细胞上，并且也存在于正常上皮细胞上。已证明这种抗体能有效地用于疾病的体外检测以及腺癌的体内诊断和治疗。最近的研究证实，KS1/4-药物结合物对肿瘤生长具有剂量依赖性抑制作用(见Spearmanetal.，J.Pharmacol.andExp.Therapeutics241∶695-703，1987;Bumoletal.，inCeriani，R.L.edImmunolo-gicalApproachestotheDiagnosisandTherapyofBreastCancer.NewYorkandLondonPlenumPress;205-215，1987;Bumol，inReisfeld，R.A.andSell，S.eds.MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy.NewYorkAlanR.Liss，Inc;257-259，1985)。
在鼠类抗体用于人体时有一个问题，就是癌症患者的免疫系统对鼠类的免疫球蛋白产生抗体。这一免疫反应并不是在所有患者中都发生，但如果发生就将在多剂量给药过程中导致疗效逐渐下降。患者的免疫反应能引起鼠类抗体从患者血流中迅速清除。这样一种反应还会导致更严重的反应，如过敏反应或血清病。这种免疫原性妨碍了抗体的多剂量给药，因此降低了这一治疗方法的临床价值。
人单克隆抗体很难制备，因此可构建嵌合抗体以避免免疫学上的问题。嵌合抗体含有一个得自某一物种的抗原特异区或可变区，与另一个物种的恒定区相连(见OiandMorrison，BioTechniques4∶214-221，1986)。因为免疫反应常常是针对恒定区的，所以如果用人的恒定区代替鼠的恒定区，将大大减轻患者的免疫反应。因此，嵌合抗体很适合于疾病的治疗。
嵌合抗体的一般概念已有描述，但仍需发展具有某些特异性的新嵌合抗体。本发明所公开的重组DNA和氨基酸顺序含有完整的KS1/4单克隆抗体分子。已对这些顺序进行操作而使其表达某些嵌合抗体，这些抗体具有与KS1/4相同的组织特异性，但所含的恒定区来自人类来源。因此本发明将提供一种用组织特异性不变的单克隆抗体KS1/4进行治疗的方案，但免疫学副作用大大减轻。
本发明还包括KS1/4的重组DNA和氨基酸顺序。这些顺序的知识使得专业人员能研究出对KS1/4抗原的亲和性有所改变的新KS1/4衍生物。本发明还包括在非淋巴细胞系中产生重组和嵌合KS1/4的方法，从而克服常常由于淋巴细胞中杂合抗体的双重分泌造成的问题。
就此处公开并请求保护的本发明的目的而言，下列术语定义如下A脱氧腺苷。
Ala一个丙氨酸残基。
ApR氨苄青霉素抗性表型或赋予该表型的基因。
Arg一个精氨酸残基。
Asn一个天冬酰胺残基。
Asp一个天冬氨酸残基。
C脱氧胞苷。
嵌合抗体一种抗体，它含有来自某一物种(一般是小鼠)的一个可变区与来自第二个不同物种(一般是人)的一个恒定区相连。
Cys一个半胱氨酸残基。
dhfr二氢叶酸还原酶表型或赋予该表型的基因。
Enh一种得自BK病毒的增强子顺序。
G脱氧鸟苷。
Gln一个谷氨酰胺残基。
Glu一个谷氨酸残基。
Gly一个甘氨酸残基。
G418RG418抗性表型或赋予该表型的基因。也可写为KmR。
His一个组氨酸残基。
HmR潮霉素抗性表型或赋予该表型的基因。
Ile一个异亮氨酸残基。
IVS编码一个内含子的DNA，也称为插入顺序。
KSAUCLA-P3细胞的可被单克隆抗体KS1/4识别的～40，000道尔顿细胞表面糖蛋白抗原。
KS1/4一种得自杂交瘤细胞系的鼠类单克隆抗体，所述抗体能识别见于P3-UCLA细胞表面的～40，000道尔顿糖蛋白抗原。
Leu一个亮氨酸残基。
LP一个含有腺病毒晚期启动子活性的DNA片段。
Lys一个赖氨酸残基。
Met一个甲硫氨酸残基。
MoAB单克隆抗体。
初生蛋白mRNA转录本翻译后产生的未进行任何翻译后修饰的多肽。
pA一个编码多聚腺苷酸化信号的DNA顺序。
Phe一个苯丙氨酸残基。
pL一个含有λ噬菌体左向启动子活性的DNA片段。
Pro一个脯氨酸残基。
启动子一个指导DNA转录成RNA的DNA顺序。
重组DNA克隆载体任何自主复制剂，包括(但不限于)质粒和噬菌体，它们含有一个DNA分子，其上能够或已经加入一个或多个另外的DNA片段。
重组DNA表达载体任何已掺入一个启动子的重组DNA克隆载体。
重组KS1/4在被可驱动KS1/4表达的载体转化的细胞中表达的单克隆抗体KS1/4分子。
复制子一个控制并允许质粒或其它载体自主复制的DNA顺序。
限制片段任何由一种或多种限制性核酸内切酶的作用产生的线性DNA顺序。
敏感宿主细胞如果没有赋予对给定的抗生素或其它毒性化合物抗性的DNA片段，就不能在该化合物存在下生长的宿主细胞。
Ser一个丝氨酸残基。
结构基因编码功能性多肽的任何DNA顺序，包括翻译起始和终止信号。
T脱氧剀铡 TcR四环素抗性表型或赋予该表型的基因。
Thr一个苏氨酸残基。
Trp一个色氨酸残基。
Tyr一个酪氨酸残基。
Val一个缬氨酸残基。


图1质粒pL32构建过程的图示。为了本公开的目的，没有准确地按比例作图。
图2质粒pNM789的限制位点和功能图谱。
图3质粒120构建过程的图示。
图4质粒pL110构建过程的图示。
图5BK病毒和质粒pBKneol的限制位点和功能图谱。
图6质粒pLPcat和pBLcat的限制位点和功能图谱。
图7质粒pL133构建过程的图示。
图8质粒pLPC、pSV2hyg和pLPChygl的限制位点和功能图谱。
图9质粒pBW25构建过程的图示。
图10质粒pBW32构建过程的图示。
图11质粒pLPChd和phd的限制位点和功能图谱。
图12质粒pGKC2310和pG2A52的限制位点和功能图谱。
图13质粒CHKC2-6和CHKC2-18的限制位点和功能图谱。
图14质粒CH2A5和CH2A5IG2的限制位点和功能图谱。
图15质粒CH2A5IG3和CH2A5IG4的限制位点和功能图谱。
本发明的重组DNA化合物包括编码一条单克隆抗体轻链的DNA，其中的轻链为单克隆抗体KS1/4的轻链，并具有与下列顺序基本相同的氨基酸残基顺序GlnIleLeuLeuThrGlnSerProAlaIleMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMetThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrMetLeuTrpTyrGlnGlnLysProGlySerSerProLysProTrpIlePheAspThrSerAsnLeuAlaSerGlyPheProAlaArgPheSerGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuIleIleSerSerMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysHisGlnArgSerGlyTyrProTyrThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLysArgAlaAspAlaAlaProThrValSerIlePheProProSerSerGluGlnLeuThrSerGlyGlyAlaSerValValCysPheLeuAsnAsnPheTyrProLysAspIleAsnValLysTrpLysIleAspGlySerGluArgGlnAsnGlyValLeuAsnSerTrpThrAspGlnAspSerLysAspSerThrTyrSerMetSerSerThrLeuThrLeuThrLysAspGluTyrGluArgHisAsnSerTyrThrCysGluAlaThrHisLysThrSerThrSerProIleValLysSerPheAsnArgAsnGluCys此外，本发明的重组DNA化合物包括编码一条单克隆抗体重链的DNA，其中的重链为单克隆抗体KS1/4的重链，并具有与下列顺序基本相同的氨基酸残基顺序
GlnIleGlnLeuValGlnSerGlyProGluLeuLysLysProGlyGluThrValLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyrGlyMetAsnTrpValLysGlnThrProGlyLysGlyLeuLysTrpMetGlyTrpIleAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAspAspPheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaSerThrAlaPheLeuGlnIleGlnGlnProGlnAsnMetArgThrMetAlaThrTyrPheCysValArgPheIleSerLysGlyAspTyrTrpGlyGlnGlyThrSerValThrValSerSerAlaLysThrThrAlaProSerValTyrProLeuAlaProValCysGlyAspThrThrGlySerSerValThrLeuGlyCysLeuValLysGlyTyrPheProGluProValThrLeuThrTrpAsnSerGlySerLeuSerSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerAspLeuTyrThrLeuSerSerSerValThrValThrSerSerThrTrpProSerGlnSerIleThrCysAsnValAlaHisProAlaSerSerThrLysValAspLysLysIleGluProArgGlyProThrIleLysProCysProProCysLysCysProAlaProAsnLeuLeuGlyGlyProSerValPheIlePheProProLysIleLysAspValLeuMetIleSerLeuSerProIleValThrCysValValValAspValSerGluAspAspProAspValGlnIleSerTrpPheValAsnAsnValGluValHisThrAlaGlnThrGlnThrHisArgGluAspTyrAsnSerThrLeuArgValValSerAlaLeuProIleGlnHisGlnAspTrpMetSerGlyLysGluPheLysCysLysValAsnAsnLysAspLeuProAlaProIleGluArgThrIleSerLysProLysGlySerValArgAlaProGlnValTyrValLeuProProProGluGluGluMetThrLysLysGlnValThrLeuThrCysMetValThrAspPheMetProGluAspIleTyrValGluTrpThrAsnAsnGlyLysThrGluLeuAsnTyrLysAsnThrGluProValLeuAspSerAspGlySerTyrPheMetTyrSerLysLeuArgValGluLysLysAsnTrpValGluArgAsnSerTyrSerCysSerValValHisGluGlyLeuHisAsnHisHisThrThrLysSerPheSerArgThrProGlyLys
本发明的化合物代表重组单克隆抗体KS1/4和迄今为止仍然未知的KS1/4氨基酸顺序和核苷酸顺序。由于DNA碱基配对具有互补性质，所以双链DNA分子的一条链的顺序就足以确定相反链的顺序。KS1/4轻链的核苷酸顺序为CAAATTCTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCTCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCGCCCAAACCCTGGATTTTTGACACATCCAACCTGGCTTCTGGATTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCATAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCATCAGCGGAGTGGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT而KS1/4重链的核苷酸顺序为CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAAC TGGGTGAAGCAGACTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAACCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTTTTTGCAGATTCAACAACCTCAGAATATGAGGACTATGGCTACATATTTCTGTGTAAGATTTATTTCT
AAGGGGGACTACTGGGGTCAAGGAACGTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCTTGGGTGGACCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAA本发明还包括一种重组DNA化合物，它所含的DNA编码一条嵌合抗体轻链，该链含有一个得自第一种哺乳动物的抗原特异性可变区和一个得自第二种不同的哺乳动物的恒定区，所述轻链可变区具有与下列顺序基本相同的氨基酸顺序GlnIleLeuLeuThrGlnSerProAlaIleMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMetThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrMetLeuTrpTyrGlnGlnLysProGlySerSerProLys
ProTrpIlePheAspThrSerAsnLeuAlaSerGlyPheProAlaArgPheSerGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuIleIleSerSerMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysHisGlnArgSerGlyTyrProTyrThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLysArg轻链可变区的核苷酸顺序为CAAATTCTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCTCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCGCCCAAACCCTGGATTTTTGACACATCCAACCTGGCTTCTGGATTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCATAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCATCAGCGGAGTGGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGT此外，本发明包括上面公开的轻链可交区的衍生物，这样一种衍生物具有与下列顺序基本相同的氨基酸残基顺序GlnIleLeuLeuThrGlnSerProAlaIleMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMetThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrMetLeuTrpTyrGlnGlnLysProGlySerSerProLysProTrpIlePheAspThrSerAsnLeuAlaSerGlyPheProAlaArgPheSerGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuIleIleSerSerMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysHisGlnArgSerGlyTyrProTyrThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLysGly
该轻链可变区衍生物的核苷酸顺序为CAAATTCTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGCTCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCGCCCAAACCCTGGATTTTTGACACATCCAACCTGGCTTCTGGATTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCATAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCATCAGCGGAGTGGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAGGT此外，本发明还包括一种重组DNA化合物，它所含的DNA编码一个得自第一种哺乳动物的嵌合抗体重链可变区和一个得自第二种不同的哺乳动物的恒定区，所述重链可变区具有与下列顺序基本相同的氨基酸顺序GlnIleGlnLeuValGlnSerGlyProGluLeuLysLysProGlyGluThrValLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyrGlyMetAsnTrpValLysGlnThrProGlyLysGlyLeuLysTrpMetGlyTrpIleAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrAlaAspAspPheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaSerThrAlaPheLeuGlnIleGlnGlnProGlnAsnMetArgThrMetAlaThrTyrPheCysValArgPheIleSerLysGlyAspTyrTrpGlyGlnGlyThrSerValThrValSerSer该重链可变区的核苷酸顺序为
CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGACTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAACCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTTTTTGCAGATTCAACAACCTCAGAATATGAGGACTATGGCTACATATTTCTGTGTAAGATTTATTTCTAAGGGGGACTACTGGGGTCAAGGAACGTCAGTCACCGTCTCCTCA本发明的轻链分子和重链分子都与特殊的信号肽相连。轻链信号肽的氨基酸残基顺序与下列顺序基本相同MetAspPheGlnValGlnIlePheSerPheLeuLeuIleSerAlaSerValIleMetSerArgGly该信号肽的核苷酸顺序为ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTTAGCTTCCTGCTAATCAGTGCTTCAGTCATAATGTCCAGAGGA重链信号肽的氨基酸残基顺序与下列顺序基本相同MetAspTrpLeuTrpAsnLeuLeuPheLeuMetAlaAlaAlaGlnSerAlaGlnAla该信号肽的核苷酸顺序为ATGGATTGGCTGTGGAACTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTGCCCAAGCA本发明的新DNA化合物得自某些cDNA克隆，这些克隆是由产生单克隆抗体KS1/4的杂交瘤细胞系的mRNA制备的。质粒pGKC2310含有单克隆抗体KS1/4轻链的整个编码顺序、与轻链相连的信号肽的编码顺序、以及该分子的5′和3′非翻译区。5′非翻译区的DNA顺序为5′-TCTGACAGACACTACTGTGCCTCGTCGGTTGGGACCTAAAAGGGCTAGTAGAATCCGCAAGCTTTTTAATCTCTCCAAAGAAGATGATGTCCGCCAGTATGTTGTCAGGAAGCCCTTAAACAAAGAAGGTAATTAGCTAGGGACCAAAATTCAAAGACAAG-3′而3′非翻译区的DNA顺序为5′-TAGAGACAAAGGTCCTGAGACGCCACCACCAGCTCCCCAGCTCCATCCTATCTTCCCTTCTAAGGTCTTGGAGGCTTCCCCACAAGCGACATACCACTGTTGCGGTGCTCCAAACCTCCTCCCCACCTCCTTCTCCTCCTCCTCCCTTTCCTTGGCTTTTATCATGCTAATATTTGCAGAAAATATTCAATAAAGTGAGTCTTTGCACTTG-3′.
质粒pGKC2310可用常规方法从大肠杆菌K12MM294/pGKC2310中分离，该菌株已于1988年4月1日保藏于北方地区研究实验室(NRRL，Peoria，Illinois)的永久性原种培养物保藏机构并构成该保藏机构的一部分。可以从NRRL以登记号B-18356得到大肠杆菌K12MM294/pKC2310的培养物。质粒pKC2310的限制位点和功能图谱示于附图12。
质粒pG2A52含有单克隆抗体KS1/4重链的整个编码顺序、与该重链相连的信号肽的编码顺序、以及该分子的5′和3′非翻译区。该分子编码的重链属IgG2A亚型。5′非翻译区的DNA顺序为5′-TCGTTTGTCTTAAGGCACCACTGAGCCCAAGTCTTAGACATC-3′而3′非翻译区的DNA顺序为5′-TGAGCTCAGCACCCACAAAACTCTCAGGTCCAAAGAGACACCCACACTCATCTCCATGCTTCCCTTGTATAAATAAAGCACCCAGCAATGCCTGGGACCATGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGG-3′质粒pG2A52可用常规方法从大肠杆菌K12MM294/pG2A52中分离，该菌株也已于1988年4月1日保藏于NRRL的永久性原种培养物保藏机构并构成该机构的一部分。可以从NRRL以登记号NRRLB-18357得到大肠杆菌K12MM294/pG2A52的培养物。质粒pG2A52的限制位点和功能图谱示于附图12。
质粒CHKC2-6含有单克隆抗体KS1/4天然轻链可变区的cDNA编码顺序、与该轻链相连的信号肽的cDNA编码顺序、以及编码人免疫球蛋白轻链恒定区的基因组DNA顺序。质粒CHKC2-6可用常规方法从大肠杆菌K12DH5/CHKC2-6中分离，该菌株也已于1988年4月1日保藏于NRRL的永久性原种培养物保藏机构中并构成该机构的一部分。可以从NRRL以登记号NRRLB-18358得到大肠杆菌K12DH5/CHKC2-6的培养物。质粒CHKC2-6的限制位点和功能图谱示于附图13。
质粒CHKC2-18含有单克隆抗体KS1/4衍生轻链可变区的cDNA编码顺序、与该轻链相连的信号肽的cDNA编码顺序、以及编码人免疫球蛋白轻链恒定区的基因组DNA顺序。该顺序的变异包括3′端密码子的改变。天然轻链可变区的3′末端含一个精氨酸密码子，而在质粒CHKC2-18中，该位置的密码子编码一个甘氨酸残基。质粒CHKC2-18可用常规方法从大肠杆菌K12DH5/CHKC2-18中分离，该菌株也已于1988年4月1日保藏在NRRL的永久性原种培养物保藏机构并构成该机构的一部分。可以从NRRL以登记号NRRLB-18359得到大肠杆菌K12DH5/CHKC2-18的培养物。质粒CHKC2-18的限制位点和功能图谱示于附图13。
质粒CH2A5含有单克隆抗体KS1/4重链可变区的cDNA编码顺序、与该重链相连的信号肽的cDNA编码顺序、以及编码人免疫球蛋白IgGl重链恒定区的基因组DNA顺序。质粒CH2A5可用常规方法从大肠杆菌K12MM294/CH2A5中分离，镁暌惨延 988年4月1日保藏在NRRL的永久性原种培养物保藏机构中，并成为该机构的一部分。可以从NRRL以登记号NRRLB-18360得到大肠杆菌K12MM294/CH2A5的培养物。质粒CH2A5的限制位点和功能图谱示于附图14。
质粒CH2A5IG2含有单克隆抗体KS1/4重链可变区的cDNA编码顺序、与该重链相连的信号肽的cDNA编码顺序、以及编码人免疫球蛋白IgG2重链恒定区的基因组DNA顺序。质粒CH2A5IG2可用常规方法从大肠杆菌K12DH5/CH2A5IG2中分离，此菌株也已于1988年4月1日保藏在NRRL的永久性原种培养物保藏机构中，并构成该机构的一部分。可从NRRL以登记号NRRLB-18361得到大肠杆菌K12DH5/CH2A5IG2的培养物。质粒CH2A5IG2的限制位点和功能图谱示于附图14。
质粒CH2A5IG3含有单克隆抗体KS1/4重链可变区的cDNA编码顺序、与该重链相连的信号肽的cDNA编码顺序、以及编码人免疫球蛋白IgG3重链恒定区的基因组DNA顺序。质粒CH2A5IG3可用常规方法从大肠杆菌K12DH5/CH2A5IG3中分离，该菌株也已于1988年4月1日保藏在NRRL的永久性原种培养物保藏机构中并成为该机构的一部分。可以从NRRL以登记号NRRLB-18362得到大肠杆菌K12DH5/CH2A5IG3的培养物。质粒CH2A5IG3的限制位点和功能图谱示于附图15。
质粒CH2A5IG4含有单克隆抗体KS1/4重链可变区的cDNA编码顺序、与该重链相连的信号肽的cDNA编码顺序、以及编码人免疫球蛋白IgG4重链恒定区的基因组DNA顺序。质粒CH2A5IG4可用常规方法从大肠杆菌K12DH5/CH2A5IG4中分离，该菌株也已于1988年4月1日保藏在NRRL的永久性原种培养物保藏机构并成为该机构的一部分。可以从NRRL以登记号NRRLB-18363得到大肠杆菌K12DH5/CH2A5IG4的培养物。质粒CH2A5IG4的限制位点和功能图谱示于附图15。
本发明的编码重组KS1/4和衍生物的DNA化合物特别适于构建供各种抗体链在哺乳动物细胞和其它真核细胞中转化和表达的载体。许多哺乳动物宿主细胞都具有对信号肽进行识别和正确加工所必需的细胞机构，这些信号肽存在于包括在本发明中的各种抗体链的氨基末端。某些哺乳动物宿主细胞还提供见于抗体分子中的翻译后修饰，如糖基化。现有多种可供进行真核宿主细胞转化的载体，但以下列举的特殊载体决不是要限制本发明的范围。
本发明的表达载体可驱动重组KS1/4及其嵌合衍生物的生成，它们都是用质粒phd构建的。质粒phd可由多种公众可得到的原料构建。质粒phd的限制位点和功能图谱示于附图11。
构建质粒phd时首先从大肠杆菌K12BE1201/pKC283中分离质粒pKC283。此培养物可从NRRL以登记号NRRLB-15830(1984年8月3日保藏)得到。质粒pKC283含有噬菌体λ的杂交lpp-pL启动子。此质粒得自大肠杆菌K12 BE1201细胞，因为这些细胞含有整合入细胞DNA的温度敏感性cI阻遏物基因。首先用限制酶PvuⅡ消化质粒pKC283，从该质粒中切下不需要的lacZ部分。然后向消化后的DNA中加入特殊的DNA连接子，将PvuⅡ位点转化为单一的XhoⅠ位点，从而产生质粒pKC283PX。质粒pKC283和pKC283PX的分离方法分别在实例1和2中详细叙述。质粒pKC283和pKC283PX的限制位点和功能图谱示于附图1。如实例3所述，将质粒pKC283PX转化入大肠杆菌K12 MO(λ+)。大肠杆菌K12MO(λ+)可从NRRL以登记号NRRL B-15993(1985年8月14日保藏)得到。
接着，用限制酶BglⅡ和XhoⅠ消化质粒pKC283PX。载体纯化后，将带有BglⅡ和XhoⅠ末端的DNA连接子连入该载体，形成质粒pKC283-L。BglⅡ-XhoⅠ连接子还含有XbaⅠ位点。然后将质粒pKC283-L的XhoⅠ位点转变为BamHⅠ位点，方法是用限制酶XhoⅠ完全消化质粒pKC283-L，接着用Klenow酶处理，然后加入BamHⅠ连接子而形成质粒pKC283-LB。质粒pKC283-L和pKC283-LB构建过程的详细叙述分别示于实例4和5。质粒pKC283-L和pKC283-LB的限制位点和功能图谱示于附图1。
接着，从质粒pKC283PX中再切下一些大肠杆菌DNA，方法是用限制酶SalⅠ进行完全消化，接着用Klenow酶处理～4.0kb载体，然后加入EcoRⅠ连接子。经连接反应而再环化后，就形成了质粒pKC283PRS。然后用限制酶PstⅠ和SphⅠ柿KC283PRS，分离出～0.85kbPstⅠ-SphⅠ限制片段。以类似的方式，用限制酶PstⅠ和SphⅠ消化质粒pKC283-LB，分离出～3.0kb片段。然后将pKC283PRS的～0.85kbPstⅠ-SphⅠ片段连入pKC283-LB的～3.0kbPstⅠ-SphⅠ载体片段，形成质粒PL32。质粒pKC283PRS和PL32构建过程的详细描述示于实例6。质粒pKC283PRS和PL32的限制位点和功能图谱示于附图1。
其次，质粒pNM789(1987年5月4日保藏)以大肠杆菌K12RV308/pNM789的形式得自NRRL，登记号为B-18216。质粒pNM789的限制位点和功能图谱示于附图2。将质粒pNM789用限制酶PvuⅡ部分消化，用限制酶BamHⅠ完全消化，然后用碱性磷酸酯酶处理。接着，将一个新的PvuⅡ-BamHⅠ连接子连入经过消化和磷酸酯酶处理的载体pNM789中，形成质粒120。然后用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ完全消化质粒120，分离出编码EK-BGH的～0.6kbXbaⅠ-BamHⅠ限制片段。质粒pL32也用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ消化，分离出～3.9kb载体片段。然后将质粒120的～0.6kbXbaⅠ-BamHⅠ片段连入质粒pL32的～3.9kb载体片段，形成质粒pL47。质粒120和pL47构建过程的详细叙述示于实例6和7。质粒120和pL47的限制位点和功能图谱分别示于附图3和4。
质粒pPR12含有温度敏感性pL阻遏物基因cI857和质粒pBR322的四环素抗性基因。质粒pPR12已在1984年3月13日颁发的美国专利4，436，815中公开并请求保护。质粒pPR12的限制位点和功能图谱示于附图4。从质粒pPR12中除去EcoRⅠ位点，方法是首先用限制酶EcoRⅠ完全消化该质粒，然后用Klenow酶处理。然后通过连接反应使载体再环化而形成质粒pBR12△R1。然后用限制酶AvaⅠ消化质粒pPR12△R1并用Klenow酶处理。然后将这个经AvaⅠ消化并经Klenow处理的pPR12△R1与EcoRⅠ连接子连接，用限制酶EcoRⅠ切割，然后再环化形成质粒pPR12AR1。质粒pPR12AR1构建过程的详细描述示于实例8。质粒pPR12AR1的限制位点和功能图谱示于附图4。
将质粒pPR12AR1先用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ消化，然后分离出质粒pPR12AR1的～2.9kbPstⅠ-EcoRⅠ限制片段。用限制酶PstⅠ和BamHⅠ消化质粒pL47，分离出～2.7kbPstⅠ-BamHⅠ限制片段。在另一个反应中，用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化质粒pL47，分离出～1.03kbEcoRⅠ-BamHⅠ片段。将质粒pL47的～2.7kbPstⅠ-BamHⅠ和～1.03kbEcoRⅠ-BamHⅠ限制片段与质粒pPR12AR1的～2.9kbPstⅠ-EcoRⅠ限制片段相连，形成质粒pL110。质粒pL110构建过程的详细叙述示于实例9。质粒pL110的限制位点和功能图谱示于附图4。
本发明的BK增强子型载体含有一个BK增强子-腺病毒晚期启动子盒，加上一个潮霉素抗性基因和一个鼠类二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。与腺病毒晚期启动子结合使用BK病毒增强子，可大大增加重组基因在真核宿主细胞中的转录。潮霉素抗性基因是作为用于真核宿主细胞的可选择标记而存在的。鼠类二氢叶酸还原酶基因在适当条件下可在宿主染色体中扩增。这种扩增还能包括与dhfr基因紧密相邻的DNA顺序。有关这一扩增的综述见文献(Schimke，Cell37705-713，1984)。dhfr基因在dhfr阴性细胞中是一个可选择标记，因此可用来通过使宿主细胞与浓度不断增加的氨甲蝶呤接触而增加某个DNA片段的拷贝数。
质粒pLPChd可用来构建一个真核表达载体，用于表达本发明的新KS1/4。质粒pLPChd含有dhfr基因、腺病毒2型启动子和BK病毒增强子。含有BK病毒增强子的BK病毒可以买到，也易于按实例10所述方法大量分离。BK病毒也可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到，登记号为ATCCVR-837。BK病毒的限制位点和功能图谱示于附图5。
将BK病毒基因组与一部分质粒pdBPV-MMTneo合并，构建出质粒pBKneol和pBKneo2。质粒pdBPV-MMTnec的大小约为15kb，可从ATCC以登记号ATCC37224得到，它含有质粒pBR322的复制子和β-内酰胺酶基因、其定位可驱动一个结构基因(编码赋予新霉素抗性的酶)表达的小鼠金属硫因启动子、以及约8kb的牛乳头状瘤病毒(BPV)DNA。质粒pdBPV-MMTneo可以用限制酶BamHⅠ消化而产生两个片段含BPVDNA的～8kb片段和含其它上述顺序的～7kb片段。BK病毒只有一个BamHⅠ限制位点，因此构建质粒pBKneo1和pBKneo2时是将质粒pdBPV-MMTneo的～7kbBamHⅠ限制片段与用BamHⅠ线性化的BK病毒DNA连接。质粒pBKneo1和pBKneo2的构建方法见实例11，这两个构建方法的区别仅在于BK病毒DNA的取向不同。质粒pBKneol含有～2.1kbSalⅠ-HindⅢ限制片段，而质粒pBKneo2含有～1.0kb限制片段。质粒pBKneo1的限制位点和功能图谱示于附图5。
质粒pBKneo1和pBKneo2都含有完整的BK病毒基因组，包括增强子顺序，因此它们可用作本发明表达载体的原料。表达载体质粒pBLcat含有与人腺病毒2型晚期启动子串联的BK增强子顺序，该启动子的定位能够驱动氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达。质粒pSV2cat是CAT基因的方便来源，可从ATCC得到，登记号为ATCC37155。人腺病毒2型DNA可以买到，也可以从ATCC得到，登记号为ATCCVR-2。
说明性质粒pBLcat的构建方法如下。将人腺病毒2型DNA的含晚期启动子的～0.32kbAccⅠ-PvuⅡ限制片段与平末端BclⅠ连接子连接，后者只与AccⅠ-PvuⅡ限制片段的PvuⅡ末端相连。然后，将所得片段与质粒pSV2cat的～4.5lkbAccⅠ-StuⅠ限制片段连接，生成中间质粒pLPcat。由质粒pLPcat构建所需质粒pBLcat的方法是将BK病毒DNA的含复制起点和增强子的～1.28kbAccⅠ-PvuⅡ限制片段与质粒pLPcat的～4.8lkbAccⅠ-StuⅠ限制片段相连。质粒pBLcat的构建方法进一步描述于实例12。质粒pLPcat和pBLcat的限制位点和功能图谱示于附图6。
接着，由质粒pHC7、pSV2gpt和pSV2-β-球蛋白构建质粒pL133。质粒pHC7含有编码人C蛋白的DNA顺序。质粒pHC7可从大肠杆菌K12RR1/pHC7中分离，后者可从NRRL得到，登记号为NRRLB-15926(1985年1月29日保藏)。用限制酶BanⅠ切割质粒pHC7，分离出～1.25kb限制片段。加入连接子，然后用限制酶ApaⅠ和HindⅢ切割该片段，然后分离出所需的～1.23kb限制片段。接着用限制酶PstⅠ切割质粒pHC7，分离出～0.88kb限制片段，加入连接子，用限制酶ApaⅠ和BglⅡ再切割该片段，分离出～0.19kbApaⅠ-BglⅡ限制片段。用限制酶HindⅢ和BglⅡ消化质粒pSV2gpt(ATCC37145)，分离出～5.1kb片段。然后将～1.23kbHindⅢ-ApaⅠ限制片段、～0.19kbApaⅠ-BglⅡ片段和～5.1kbHindⅢ-BglⅡ片段连在一起，形成中间质粒pSV2-HPC8。质粒pSV2-HPC8构建方法的更详细叙述见实例13。此构建方法的简图示于附图7。
然后，用限制酶HindⅢ和SalⅠ切割质粒pSV2-HPC8，分离出～0.29kb限制片段。同样，还可用限制酶BglⅡ和SalⅠ切割质粒pSV2-HPC8，分离出～1.15kb限制片段。用限制酶BglⅡ和HindⅢ切割质粒pSV2-β-球蛋白(NRRLB-15928，1985年1月29日保藏)，分离出～4.2kb限制片段。然后把这三个片段连在一起形成质粒pL133。用限制酶HindⅢ消化质粒pL133，然后用碱性磷酸酯酶处理。质粒pBLcat也用限制酶HindⅢ切割，分离出～0.87kb限制片段。将此片段连入经HindⅢ切割的、磷酸酯酶处理的质粒pL133载体，形成质粒pLPC。因为质粒pBLcat的HindⅢ片段能以两种取向插入质粒pL133，所以应当注意，在质粒pLPC中，正确的取向提供了一个～1.0kbNdeⅠ-StuⅠ片段。质粒pLPC和质粒pL133一样，含有SV40增强子、早期和晚期启动子、T抗原结合位点、以及复制起点。构建质粒pL133和pLPC的详细方案见实例13和14。质粒pL133和pLPC的限制位点和功能图谱分别示于附图7和8。
质粒pLPC上的各SV40成分紧密定位在一起，很难画出来。T抗原与T抗原结合位点的结合是SV40复制所必需的，已知这种结合能增强由SV40晚期启动子的转录，并意外地对BK晚期启动子也有类似的作用。由于由T抗原驱动的含SV40复制起点的质粒的高水平复制一般使宿主细胞致死，因此质粒pLPC和质粒pL133都不能在SV40T抗原存在下作为游离(染色体外的)成分而稳定保持，而必须整合到所要稳定保持的宿主细胞染色体DNA中。BK增强子区的整体结构与SV40非常类似，因为BK增强子、复制起点、早期和晚期启动子，以及T抗原结合位点的BK对应位点，也是紧密定位在一起的，因此也很难在BK病毒DNA上画出来。但当含有BK复制起点和T抗原结合位点的质粒在BKT抗原存在下培养时，其复制并不达到致死的程度，因而在拗飨赴凶魑卫氤煞侄榷ū３帧４送猓梢岳肨抗原驱动的复制来增加含BK复制起点的载体的拷贝数，使得在施加选择压时，有更多个拷贝的质粒整合到宿主细胞染色体DNA中。显然是由于BK和SV40T抗原与它们各自的结合位点之间有类似的结构一功能关系，BK复制也受SV40T抗原的刺激。
重组DNA表达载体的游离保持并不总是优于整合到宿主细胞染色体中。但由于缺少能在真核细胞中起作用的可选择标记，质粒pLPC的稳定的真核转化体难于鉴定，除非质粒pLPC是与另一个含有可选择标记的质粒共转化。因此，曾对质粒pLPC进行修饰而产生可在真核宿主细胞中选择的衍生质粒，其方法是把质粒pLPC与一部分质粒pSV2hyg连接，质粒pSV2hyg是一种含有潮霉素抗性基因的质粒。质粒pSV2hyg可从NRRL得到，登记号为NRRLB-18039(1986年2月11日保藏)。质粒pSV2hyg的限制位点和功能图谱示于附图8。
用限制酶BamHⅠ消化质粒pSV2hyg，分离出含完整潮霉素抗性基因的～2.5kbBamHⅠ限制片段，用Klenow酶(用枯草杆菌蛋白酶切割大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ产生的大片段)处理，然后与质粒pLPC的经Klenow酶处理的～5.82kbNdeⅠ-StuⅠ限制片段连接，生成质粒pLPChyg1和pLPChyg2。质粒pLPChyg1和pLPChyg2的区别仅在于潮霉素抗性片段的取向不同。质粒pLPChyg1含有一个～5.0kbHindⅢ片段，而质粒pLPChyg2含有一个～1.0kb片段。质粒pLPChyg1和pLPChyg2的构建方案见实例15。质粒pLPChyg1的限制位点和功能图谱示于附图8。
接着，构建含有鼠类二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的质粒pBW32。用限制酶TthlllⅠ切割质粒pTPA102(NRRLB-15834，1984年8月10日保藏)，分离出～4.4kb限制片段。将此片段用Klenow酶处理，加入连接子，然后用限制酶HindⅢ和BamHⅠ切割该片段，生成～2.0kb限制片段。然后将pTPA102的～288bpClaⅠ-EcoRⅠ限制片段连入ClaⅠ-EcoRⅠ切割的载体pKC7，构建出质粒pRC。质粒pKC7可从ATCC得到，登记号为ATCC37084。用限制酶BamHⅠ和HindⅢ消化质粒pRC，然后与上面形成的质粒pTPA102的～2.0kb限制片段连接，生成质粒pTPA103。质粒pTPA103的构建方案见实例16A。此构建方法的简图示于附图9。
用限制酶BglⅡ切割质粒pTPA103，用Klenow酶处理，加入NdeⅠ连接子。然后连接此混合物，形成质粒pTPA103derNdeⅠ。用限制酶AvaⅡ切割质粒pTPA103derNdeⅠ，分离出～1.4kb片段。用Klenow酶处理此片段，然后，在加入HpaⅠ连接子后用限制酶EcoRⅠ切割。将含有trpPO和TPA氨基末端的～77obp片段连入经EcoRⅠ-SmaⅠ消化的载体pUC19，形成pUC19TPAFE。用限制酶HpaⅠ部分消化质粒pUC19TPAFE，然后用限制酶BamHⅠ完全切割。然后将所得的～3.42kbHpaⅠ-BamHⅠ限制片段与得自质粒pTPA103的～1.015kbScaⅠ-BamHⅠ片段连接，形成质粒pBW25。质粒pBW25的构建方案见实例16B。此构建方法的简图示于附图9。
用限制酶HindⅢ和EcoRⅠ切割质粒pBW25，将所得的～810bp片段连入经HindⅢ-EcoRⅠ切割的噬菌体M13mp8(NewEnglandBiolabs)，形成噬菌体pM8BW26。然后在噬菌体pM8BW26上进行体外诱变反应(缺失编码某些氨基酸残基的DNA)，形成噬菌体pM8BW27。用限制酶EcoRⅠ和NdeⅠ切割噬菌体pM8BW27，分离出～560bp限制片段。合成一个～48bp的合成NdeⅠ-XbaⅠ连接子。用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ切割质粒pTPA103，分离出～689bp片段。用限制酶BamHⅠ部分消化质粒pL110(在实例9中构建)，然后用XbaⅠ完全切割，分离出～6.0kb片段。然后把这个～6.0kb载体片段、质粒pTPA103的～689bp片段、噬菌体pM8BW27的～560bp片段、～48bp连接子都连接在一起，形成质粒pBW28。质粒pBW28的构建方案见实例16C。此构建方法的简图示于附图10。
接着，将质粒pTPA103的～2.0kbHindⅢ-BglⅡ片段与质粒pSV2-β-球蛋白的～4.2kbHindⅢ-BglⅡ片段连接，形成质粒pTPA301。用限制酶PvuⅡ切割质粒pSV2-dhfr(ATCC37146)。加入BamHⅠ连接子后，将含dhfr基因的～1.9kb片段连入经BamHⅠ切割的、磷酸酯酶处理的质粒pTPA301，形成质粒pTPA303。用限制酶EcoRⅠ和BglⅡ切割质粒pTPA301，生成一个～2.7kb片段。用限制酶HindⅢ和EcoRⅠ切割质粒pTPA303，生成含dhfr基因的～2340bp片段。用限制酶HindⅢ和SstⅠ懈钪柿TPA303，生成一个～1.7kb片段。用限制酶XhoⅡ和SstⅠ切割质粒pBW28，生成一个～680bp片段。将质粒pTPA301的～2.7kbEcoRⅠ-BglⅡ片段、质粒pTPA303的～2340bpHindⅢ-EcoRⅠ片段、质粒pTPA303的～1.7kbHindⅢ-SstⅠ片段、以及质粒pBW28的～680bpXhoⅡ-SstⅠ片段都连接在一起，形成质粒pBW32。质粒pBW32的构建方案见实例16D。该构建方法的简图示于附图10。
分离出质粒pBW32的含dhfr基因的～1.9kbBamHⅠ限制片段，用Klenow酶处理，并将其插入用EcoRⅠ部分消化的质粒pLPChyg1中，生成质粒pLPChd1和pLPChd2。质粒pLPChyg1含有两个EcoRⅠ限制酶识别位点，一个在潮霉素抗性基因内，一个在得自质粒pBR322的顺序内。将含有dhfr基因的片段插入位于质粒pLPChyg1的得自pBR322的顺序中的EcoRⅠ位点，生成质粒pLPChd1和pLPChd2。为本公开的目的，已将质粒pLPChd1定名为pLPChd。质粒pLPChd的限制位点和功能图谱示于附图11。构建质粒pLPChd1和pLPChd2的区别仅在于含dhfr基因的DNA片段的取向不同。这两个质粒的构建方法见实例17。
接着，用下述方法构建质粒phd，用质粒pLPChd转化大肠杆菌dam-1菌株，并从中再分离质粒pLPChd。然后用限制酶BclⅠ消化质粒pLPChd，并再环化而形成质粒phd。质粒phd是由质粒pLPChd缺失在质粒pLPcat构建过程中连入的额外BclⅠ连接子及两个相邻的大小共约1.45kb的BclⅠ限制片段而生成的。将编码单克隆抗体KS1/4轻链的全长cDNA的编码DNA连入质粒phd中，形成表达载体pL-KSL。用Klenow酶处理质粒pGKC2310的～1100bp EcoRⅠ片段，将其与BamHⅠ连接子连接，然后连入经BclⅠ消化的质粒phd。质粒phd和pL-KSL构建方法的详细叙述见实例18和19。质粒phd的限制位点和功能图谱示于附图11。
质粒pH-KS是本发明的一种载体，得自质粒phd和质粒pG2A52。分离出质粒pG2A52的～1.6kbEcoRⅠ片段，用Klenow酶处理，并与BamHⅠ连接子连接。此片段含有编码单克隆抗体KS1/4重链的全长cDNA。接着将此片段连入经BclⅠ消化的质粒phd，形成表达质粒pH-KS。质粒pL-HD是由质粒phd和质粒CHKC2-18构建的一种表达载体，该载体中含有编码与人轻链恒定区相连的KS1/4轻链可变区衍生物的DNA。分离出质粒CHKC2-18的～1.3kbFnuDⅡ-HindⅢ片段，用Klenow酶处理。然后将此片段连入经BclⅠ消化的、Klenow酶处理的质粒phd，形成表达质粒pL-HD。质粒pH-KS和pL-HD构建方法的详细叙述分别示于实例20和21。
质粒pL-HD2是一种由质粒phd和质粒CHKC2-6构建的表达载体，该载体中含有编码与人轻链恒定区相连的KS1/4轻链可变区天然顺序的DNA。分离出质粒CHKC2-6的～1.3kbFnuDⅡ-HindⅢ片段，用Klenow酶处理。然后将此片段连入经BclⅠ消化的、Klenow酶处理的质粒phd，形成表达质粒pL-HD2。由质粒phd和质粒CH2A5构建质粒pH1-HD，该质粒含有与编码人IgG1恒定区的基因组DNA相连的编码KS1/4重链可变区的cDNA。用限制酶EcoRⅠ消化质粒CH2A5，用Klenow酶处理，然后与BamHⅠ连接子连接。接着，用限制酶BamHⅠ消化该质粒，分离出～7.4kb限制片段。将此片段连入经BclⅠ消化的质粒phd，形成表达质粒pH1-HD。质粒pL-HD2和pH1-HD构建方法的详细叙述分别示于实例22和23。
由质粒phd和质粒CH2A5IG2构建质粒pH2-HD，该质粒含有与编码人IgG2恒定区的基因组DNA相连的编码KS1/4重链可变区的cDNA。用限制酶EcoRⅠ消化质粒CH2A5IG2，用Klenow酶处理，然后与BamHⅠ连接子连接。接着用限制酶BamHⅠ消化该质粒，分离出～6.1kb限制片段。将此片段连入BclⅠ消化的质粒phd，形成表达质粒pH2-HD。由质粒phd和质粒CH2A5IG3构建质粒pH3-HD，该质粒含有与编码人IgG3恒定区的基因组DNA相连的编码KS1/4重链可变区的cDNA。用限制酶EcoRⅠ消化质粒CH2A5IG3，用Klenow酶处理，然后与BamHⅠ连接子相连。接着，用限制酶BamHⅠ消化该质粒，分离出～7.4kb限制片段。将此片段连入BclⅠ消化的质粒phd，形成表达质粒pH3-HD。质粒pH2-HD和pH3-HD构建方法的详细叙述分别示于实例24和25。
由质粒phd和质粒CH2A5IG4构建质粒pH4-HD，该质粒含有与编码人IgG4恒定区的基因组DNA相连的编码KS1/4重链可变区的cDNA。用限制酶EcoRⅠ消化质粒CH2A5IG4，用Klenow酶处理，然后与BamHⅠ连接子相连。接着，用限制酶BamHⅠ消化该质粒，分离出～6.4kb限制片段。将此片段连入经BclⅠ消化闹柿hd，形成表达质粒pH4-HD。该构建方法的更详细叙述见实例26。
本发明决不仅限于此处列举的特定的真核启动子的应用。其它启动子，如同源或异源免疫球蛋白启动子、SV40晚期启动子或来自某些真核基因的启动子，也都易于分离和修饰可方便地用在为在真核宿主细胞内产生抗体而设计的重组DNA表达载体上。上述真核基因的例子有雌激素诱导性鸡卵清蛋白基因、干扰素基因、糖皮质激素诱导性酪氨酸氨基转移酶基因、胸苷激酶基因、主要的早期腺病毒基因、SV40早期启动子。还可以用串联的真核启动子来驱动这类抗体的表达。此外，已知有大量的还原病毒(retroviruses)能感染广范围的真核宿主细胞。还原病毒DNA中的长段末端重复顺序常常编码启动子活性，因此可用来代替上述的BK增强子-腺病毒晚期启动子，驱动KS1/4及其衍生物的表达。本发明也不限于此处所举的质粒上列举的具体的可选择的标记。对真核和原核宿主细胞来说都有多种可选择标记适于用在含本发明DNA化合物(或顺序)的重组DNA克隆或表达载体上。
可将各种表达载体转化入多种真核宿主细胞尤其是哺乳动物宿主细胞中，并在其中进行表达。这些表达载体还含有允许在大肠杆菌中复制的顺序，因为在大肠杆菌中比在其它宿主细胞中制备质粒DNA通常更为有效。在发生抗体表达的宿主细胞中，特定的启动子与抗体结构基因功能相连。专业人员会懂得，可以利用多种真核宿主细胞，采用BK增强子-腺病毒晚期启动子来表达各种不同的抗体，只要该宿主细胞表达大DNA病毒的直接早期基因产物就行。因为将直接早期基因产物引入宿主细胞可以采用多种手段，如用质粒或其它载体进行转化，所以实际上任何真核宿主细胞都能用于本方法。在本发明的方法中，人体细胞是优选的宿主细胞，因为人体细胞是BK病毒的天然宿主，因而可能含有能刺激BK增强子的细胞因子。虽然人体细胞可用作宿主细胞，但用腺病毒12转化的、表达ElA基因产物的金黄仓鼠细胞系AV12最为优选，该细胞系可从ATCC得到，登记号为ATCCCRL9595(1987年11月24日保藏)。一般的转化方法详述于实例27。
AV12细胞在用编码免疫球蛋白重链的表达载体转化时，将经过加工的重链分泌到上清液中。但是用编码轻链的表达载体转化的AV12细胞不分泌所述轻链，除非细胞还用编码重链的表达载体共转化。表达本发明各种免疫球蛋白链的克隆的分离方法见实例28。因此，可以从已用编码轻链和重链的载体共转化的AV12细胞的上清液中，纯化出功能性的KS1/4和KS1/4衍生物。以此方式，可以通过混合和搭配本发明的不同轻链和重链，产生KS1/4的许多变异体。
在非淋巴系统中表达免疫球蛋白轻链和重链分子明显优于在淋巴系统中表达。传统方法是从淋巴系统，如骨髓瘤或杂交瘤细胞中分离纯化单克隆抗体。这类细胞常常表达大量的不均一抗体。这一现象源于淋巴细胞天然分泌抗体这个事实。在用编码另一种抗体的DNA进行转化或与产生不同抗体的其它细胞融合时，这类淋巴细胞有时会变成双重分泌细胞。这样，双重分泌细胞系就产生许多具有杂交分子结构的抗体，其中很大一部分是不需要的。因此，必须用昂贵而费时的技术从所要的产物中分离除去这些不需要的杂交分子。本发明的方法则避开了这一问题，因为非淋巴细胞天然不分泌抗体分子。因此，分泌到上清液中的唯一抗体就是所需的均一产物。
有可能对本发明的说明性DNA顺序和质粒进行许多修改和变化。例如，遗传密码的简并性使得整个多肽编码区的核苷酸都可进行替换，也可以用
翻译终止信号替换具体列举的
翻译终止信号。这些顺序可以从KS1/4的已知氨基酸或DNA顺序推测，也可用下列常规合成法来构建。这些合成方法可以基本按照文献方法进行(Itakura et al.，Science 1981056，1977;Crea et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 755765，1978)。此外，合成基因和连接子可用Systec1450A型DNA合成仪(SystecInc.，3816ChandlerDrive，Minneapolis，MN)或ABS380A型DNA合成仪(AppliedBiosystems，Inc.，850LincolnCenterDrive，FosterCity，CA94404)来合成。本领域内已知有许多其它DNA合成仪也都可用于制备合成DNA片段。因此，本发明决不仅限于具体列举的DNA顺序和质粒。
本领域专业人员应该知道，本发明的表达载体可用来转化真核宿主细胞，使该宿主细胞可表达具有各种不同轻链和重链结构的多肽。如果用一种载体转化宿主细胞，而该载体所含的启动子可在该宿主细胞中发挥作用而驱动这些免疫球蛋白结构基因的转录，并且该宿主细胞具有加工信号肽的细胞机构，那么这些细胞就可分泌成熟的抗体或抗体链。在其它表达条件下，例如在该宿主细胞只表达免疫球蛋白轻链时，必须从该宿主细胞中分离轻链。
如上所述，本发明的载体、方法、转化体和抗体都将对与癌症作斗争产生深刻的影响。Bumol证明了单克隆抗体KS1/4是腺癌诊断、预测和治疗的一种有效试剂(Reisfeld，R.A.andSell，S.eds.MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy.NewYorkAlanR.Liss，Inc.，1985，257-259)。Spearman等人公开了单克隆抗体-长春花生物碱结合物在肿瘤定位与治疗中的应用(J.Pharmacol.andExp.Therapeutics241695-703，1987)，其技术内容列为本文参考文献。这种KS1/4-DAVLB(4-去乙酰基长春花碱)结合物还与肿瘤生长抑制作用有关(Bumoletal，inCeriani，R.L.ed.ImmunologicApproachestotheDiagnosisandTherapyofBreastCancer，NewYorkandLondonPlenumPress;205-215，1987;其技术内容列为本文参考文献)。生化和免疫学研究表明，本发明的重组和嵌合KS1/4分子具有与得自杂交瘤细胞的KS1/4分子相同的抗原反应性。
但是，使用鼠类抗体的问题是，所述抗体常常在人体内诱发免疫反应。这在某些接受KS1/4治疗的患者中已有发生。这个问题可以通过使用本发明的嵌合抗体来克服。用来源于人的恒定区代替KS1/4的恒定区，就能使患者的免疫系统将该嵌合抗原识别为“自体”，因而产生较少的抗KS1/4抗体。此外，应用人的恒定区还将有助于补体的激活和其它细胞反应。
专业人员还会知道，可以利用迄今尚属未知的KS1/4氨基酸和DNA顺序来产生新的、高亲和性或低亲和性的衍生物。该抗体的各个不同部分都可以缺失或突变而产生新的抗体，或一条链的某些部分可以用另一条链的某一段来代替。X射线结晶学研究将证实该抗体的哪些氨基酸残基最接近KS1/4所结合的抗原的氨基酸残基。利用蛋白质工程技术，可对KS1/4进行修饰而使带负电的残基接近抗原上的带正电残基。这样，这些“改造的”抗体对癌症患者体内的细胞表面抗原所表现的亲和性就会有所改进。
下列实例进一步说明此处公开的发明。这些实例叙述了本发明的构建方法，并在适当的地方对这些方法作了解释。
实例1质粒pKC283的分离从NRRL得到大肠杆菌K12BE1201/pKC283的冻干物，登记号为NRRLB-15830。将这些冻干物倒入装有10mlLB培养基(10g细菌用胰化胨、5g细菌用酵母抽提物、每升10gNaCl;调pH至7.5)的管中，于32℃培养2小时，此时在培养物中加50μg/ml氨苄青霉素，然后于32℃下培养过夜。在32℃下培养大肠杆菌K12BE1201/pKC283细胞是因为这些细胞含有整合到细胞DNA中的温度敏感性cI阻遏物基因。如本文的后续实例所述，当这一质粒分离方法用于含有野生型λpL阻遏物基因或不含λpL启动子的细胞时，培养温度为37℃。
取一小部分过夜培养物，以某种方式置于含50μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂(加15g/l细菌用琼脂的LB培养基)平板上，从而获得大肠杆菌K12BE1201/pKC283的单菌落分离菌。将得到的单菌落接种到10ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于32℃下剧烈振荡培养过夜。取10ml过夜培养物接种到500ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于32℃下剧烈振荡培养，直到培养物达到静止期。
以下操作沿用Maniatis等人的方法(MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratory，1982)。
于4℃下以4000g离心10分钟收集细胞，弃去上清液。用100毫升冰冷的STE缓冲液(0.1MNaCl;10mMTris-HCl，pH7.8;1mMEDTA)洗涤细胞沉淀。洗涤后，将细胞沉淀再悬浮于100ml含5mg/ml溶菌酶的溶液1(50mM葡萄糖;25mMTris-HCl，pH8.0;10mMEDTA)中，室温下放置10分钟。然后向经溶菌酶处理的细胞中加入20ml溶液2(0.2NNaOH和1%SDS)，用倒转法小心混合该溶液。将该混合物在冰上保温10分钟。
向溶解的细胞混合物中加入15ml冰冷的5M乙酸钾，pH4.8，倒转混合该溶液。将该溶液在冰上保温10分钟。5M乙酸钾溶液的制备方法是在28.5ml水和60ml5M乙酸钾中加入11.5ml冰乙酸;所得的钾浓度为3M，乙酸浓度为5M。
于4℃下，将溶解的细胞混合物以20，000rpm在BeckmanSW27(或同等规格的转子)中离心20分钟。细胞的DNA和碎片在管底形成沉淀。回收到约36ml上清液，加入0.6倍体积的异丙醇并混合，所得溶液在室温下放置15分钟。室温下以12，000g离心30分钟收集质粒DNA。弃去上清液，用70%乙醇于室温下洗涤DNA沉淀。倒出乙醇洗涤液，将沉淀置于真空干燥器中干燥。然后将沉淀再悬浮于8mlTE缓冲液中(10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA)。
向DNA溶液中加入8克CsCl。在每10mlCsCl-DNA溶液中加入约0.8ml10mg/ml溴乙锭水溶液。该溶液的最终密度约为1.55g/ml，溴乙锭浓度约为600μg/ml。将溶液移至Beckman50型离心管中，管顶用石蜡油装满，密封后于20℃下以45，000rpm离心24小时。离心后，在可见光下可看见两条DNA带。取下离心管盖后，用带有21号皮下注射针头的注射器沿离心管壁插入而吸出较低的DNA带。
用水饱和的1-丁醇萃取若干次，除去溴化乙锭。用TE缓冲液透析除去CsCl。用缓冲的苯酚而后用氯仿萃取后，沉淀出DNA，用70%乙醇洗涤，干燥。得到约1mg质粒pKC283，于4℃下在TE缓冲液中以约1μg/μl的浓度贮存。质粒pKC283的限制位点和功能图谱示于附图1。
实例2质粒pKC283pX的构建将约10μl实例1制备的质粒pKC283 DNA与20μl 10X中盐限制缓冲液(500mM NaCl;100mM Tris-HCl，pH7.5;100mM MgCl2;10mM DTT)、20μl 1mg/ml BSA、5μl限制酶PvuⅡ(～50单位，按Bethesda Research Laboratories(BRL)的定义，这里所用的所有限制酶都得自BRL)及145μl水混合，所得反应液于37℃下保温2小时。本文所述的限制酶反应用常规方法终止，方法是，先用苯酚而后用氯仿萃取，然后沉淀出DNA，用乙醇洗涤，将DNA再悬浮于TE缓冲液中。如上所述终止PvuⅡ消化后，沉淀出PvuⅡ消化的质粒pKC283 DNA，然后再悬浮于5μl TE缓冲液中。
将约600微微摩尔(pM)XhoⅠ连接子(5′-CCTCGAGG-3′)用激酶处理。反应混合物中含有10μl 5X激酶缓冲液(300mM Tris-HCl，pH7.8;50mM MgCl2;25mM DTT)、5μl 5mM ATP、24μl H2O、0.5μl T4多核苷酸激酶(按P-L Bioche-micals的定义约为2.5单位)、5μl 1mg/ml BSA、5μl 10mM亚精胺。将该混合物在37℃保温30分钟。
向5μl经PvuⅡ消化的质粒pKC283DNA中加入约12.5μl经激酶处理的XhoⅠ连接子，然后向该DNA中加入2.5μl 10X连接酶缓冲液(300mM Tris-HCl，pH7.6;100mM MgCl2;50mM DTT)、2.5μl 1ml/ml BSA、7μl 5mM ATP、2.5μl(按P-L Biochemicals的定义约为2.5单位)T4DNA连接酶、2.5μl 10mM亚精胺、3μl水。所得连接反应液于4℃下保温过夜。连接反应后，调整反应混合物使其具有高盐缓冲液的组成(0.1M NaCl;0.05M Tris-HCl，pH7.5;10.0mM MgCl2;1mM DTT)。向该混合液中加入约10μl(100单位)限制酶XhoⅠ，所得反应液于37℃下保温2小时。
终止反应后，沉淀出经XhoⅠ消化的DNA，再悬浮，如上所述进行连接，但连接混合液中不加XhoⅠ连接子。连接后的DNA就构成了所需的质粒pKC283PX。质粒pKC283PX的限制位点和功能图谱示于附图1。
实例3大肠杆菌K12 MO(λ+)/pKC283pX的构建大肠杆菌K12 MO(λ+)可从NRRL以冻干形式得到，登记号为NRRL B-15993。大肠杆菌K12 MO(λ+)含有野生型λpL cI阻遏物基因，使得大肠杆菌K12 MO(λ+)细胞中不发生由本发明的杂交pL-1pp启动子启动的转录。将冻干物复原，分离出MO(λ+)单菌落，基本按照实例1的方法制备10ml MO(λ+)细胞过夜培养物，但保温温度为37℃，生长培养基中不用氨苄青霉素。
用50μl过夜培养物接种5ml LB培养基，该培养基中还含有10mM MgSO4和10mM MgCl2。于37℃下，将该培养物剧烈振荡培养过夜。第二天早晨用含有10mM MgSO4和10mM MgCl2的LB培养基稀释培养物至200ml。稀释的培养物于37℃下剧烈振荡培养，直到550nm处的光吸收(A550)约为0.5，这表明细胞密度约为1×108个细胞/ml。在冰水浴中将培养物冷却10分钟，然后于4℃下以4000g离心10分钟收集细胞。将细胞沉淀再悬浮于100ml冷的10mM MgSO4中，然后迅速离心再沉淀。将细胞沉淀再悬浮于100ml 30mM CaCl2中，在冰上保温20分钟。
再一次离心收集细胞，再悬浮于10ml 30mM CaCl2中。取0.5毫升细胞样品加到实例2制备的连接DNA中，该DNA中含30mM CaCl2。将细胞-DNA混合液在冰上保温1小时，于42℃下热休克90秒，然后在冰上冷却约2分钟。将细胞-DNA混合液稀释到装在125ml培养瓶中的10ml LB培养基中，于37℃下保温1小时。取若干100μl等份样品涂布在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于37℃下培养至出现菌落。
单独培养各菌落，利用限制酶分析和凝胶电泳检查各菌落的质粒DNA。按实例1的方法以较小规模进行质粒DNA的分离，但省去CsCl梯度步骤，直到鉴定出所需的大肠杆菌K12 MO(λ+)/pKC283PX转化体。质粒pKC283PX的限制位点和功能图谱示于附图1。
实例4大肠杆菌K12 MO(λ+)/pKC283-L的构建将10μg按实例1方法制备的质粒pKC283PXDNA溶于20μl10X高盐缓冲液、20μl1mg/mlBSA、5μl(～50单位)限制酶BglⅡ、5μl(～50单位)限制酶XhoⅠ和150μl水中，所得反应液于37℃下保温2小时。停止反应，沉淀出经BglⅡ-XhoⅠ消化的DNA后，将DNA再悬浮于5μlTE缓冲液中。
合成一个DNA连接子并用激酶处理，该连接子带有BglⅡ和XhoⅠ限制酶切割所特有的单链DNA末端。基本按照实例2的方法对该连接子进行激酶处理。该DNA连接子具有下列结构
利用本领域公知的方法，由单链脱氧寡核苷酸合成上面所示的连接子。单链脱氧寡核苷酸的合成可以采用市售的仪器，如380A型DNA合成仪(AppliedBiosystems850LincolnCentreDrive，FosterCity，CA94404)，它利用了氨基磷酸化学。合成DNA的其它方法也是本领域内已知的。有人描述了合成单链DNA的修改的常规磷酸三酯法(Itakuraetal.，Science1981056，1977.Creaetal.，Pro.Nat.Acad.Sci.USA755765，1978)，此外，还有人公开了一种特别优选的DNA合成法(Hsiungetal.，NucleicAcidResearch113227，1983;Narangetal.，MethodsinEnzymology6890，1980)。
基本按实例2的方法连接连接子和经BglⅡ-XhoⅠ消化的质粒pKC283PX。连接后的DNA就构成了所需的质粒pKC283-L。质粒pKC283-L的限制位点和功能图谱示于附图1。基本按实例3的方法，用质粒pKC283-L DNA转化大肠杆菌K12 MO(λ+)，并鉴定出所得到的大肠杆菌K12 MO(λ+)/pKC283-L转化体。
实例5大肠杆菌K12 MO(λ+)/pKC283-LB的构建将基本按实例1方法制备的约10μg质粒pKC283-L DNA溶于20μl 10X高盐缓冲液、20μl 1mg/ml BSA、5μl(～50单位)限制酶XhoⅠ和155μl H2O中，所得反应液于37℃下保温2小时。然后从反应混合液中沉淀出经XhoⅠ消化的质粒pKC283-L DNA，方法是加入3倍体积的95%乙醇和十分之一体积的3M乙酸钠，在干冰-乙醇浴中保温5分钟，然后离心。所得DNA沉淀用70%乙醇洗涤，干燥后再悬浮于2μl 10X缺刻翻译缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH7.2;0.1M MgSO4;1mM DTT)、1μl每种脱氧核苷三磷酸各为2mM的溶液、15μl H2O、1μl(按P-L Biochemicals的定义为～6单位)Klenow酶(即大肠杆菌DNA聚合酶I的大片段)和1μl 1mg/ml BSA中。所得反应液于25℃下保温30分钟，将该溶液于70℃下保温5分钟终止反应。
基本按实例2的方法，用激酶处理BamHⅠ连接子(5′-CGGGATCCCG-3′)，并将其与经XhoⅠ消化的、Klenow酶处理的质粒pKC283-LDNA连接。连接反应后，于37℃下，在高盐缓冲液中用约100单位BamHⅠ消化DNA约2小时。BamHⅠ消化后，基本按实例2的方法准备DNA用于连接。
通过连接使～5.9kb BamHⅠ限制片段环化，并基本按实例2和3的方法转化到大肠杆菌K12 MO(λ+)中。鉴定出大肠杆菌K12 MO(λ+)/pKC283-LB转化体，然后基本按实例1的方法制备质粒pKC283-LB DNA。质粒pKC283-LB的限制位点和功能图谱示于附图1。
实例6大肠杆菌K12 MO(λ+)/pL32的构建基本按照实例5的方法，在高盐缓冲液中用限制酶SalⅠ消化10μg质粒pKC283PX，用Klenow酶处理，并与EcoRⅠ连接子(5′-GAGGAATTCCTC-3′)连接，但所用的起始质粒、限制酶和连接子与实例5不同。用限制酶EcoRⅠ进行消化，导致～2.1kbDNA被切除。消化后，通过连接使～4.0kbEcoRⅠ限制片段环化，生成质粒pKC283PRS。基本按实例3的方法，用连接后的DNA转化大肠杆菌K12 MO(λ+)。鉴定出大肠杆菌K12 MO(λ+)/pKC283PRS转化体后，基本核实例1的方法制备质粒pKC283PRS DNA。质粒pKC283PRS的限制位点和功能图谱示于附图1。
在200μl高盐缓冲液中，用各约50单位的限制酶PstⅠ和SphⅠ消化约10μg质粒pKC283PRS。反应液在37℃下保温约2小时后，于～130V和～75mA下、Tris-乙酸缓冲液中使反应混合液在0.6%低胶凝温度琼脂糖(FMCCorporation，MarineColloidsDivision，Rockland，Maine04841)凝胶上电泳2-3小时。
将凝胶置于溴化乙锭稀溶液中染色，用长波紫外光显现出构成～0.85kbPstⅠ-SphⅠ限制片段的DNA带，从凝胶上切下这一条带，为一小胶条。由胶条的重量和密度确定胶条的体积，向装有胶条的试管中加入等体积的10mMTris-HCl，pH7.6。然后在72℃下保温使胶条熔解。得到约1μg质粒pKC283PRS的～0.85kbPstⅠ-SphⅠ限制片段，体积约为100μl。以类似的方式，用限制酶PstⅠ和SphⅠ消化质粒pKC283-LB，利用琼脂糖凝胶电泳分离出所得的～3.0kb限制片段，并准备用于连接。
基本按实例2的方法，使质粒pKC283PRS的～0.85kb PstⅠ-SphⅠ限制片段与质粒pKC283-LB的～3.0kb PstⅠ-SphⅠ限制片段连接。连接后的DNA就构成了所需的质粒pL32。质粒pL32的限制位点和功能图谱示于附图1。基本按实例3的方法，将质粒pL32转化入大肠杆菌K12 MO(λ+)细胞。基本按实例1的方法，从大肠杆菌K12 MO(λ+)/pL32转化体制备质粒pL32 DNA。质粒pL32 DNA的分析证实，有不止一个EcoRⅠ连接子与质粒pKC283PX的经Klenow酶处理的SalⅠ末端相连。不止一个EcoRⅠ连接子的存在并不影响质粒pL32或质粒pL32衍生物的应用，并且，这些连接子可以由一个XhoⅠ限制位点的存在来检测，因为只要有两个EcoRⅠ连接子连在一起就会产生一个XhoⅠ位点。构建pL32时也可以对质粒pKC283-LB进行本实例第一自然段的SalⅠ-EcoRⅠ切割和连接。
实例7大肠杆菌K12 MO(λ+)/pL47的构建大肠杆菌K12 RV308/pNM789可以以冻干形式从NRRL得到，登记号为NRRL B-18216。pNM789的限制位点和功能图谱示于附图2。基本按实例1的方法从培养物中提取质粒DNA，但保温温度为37℃。将10μg pNM789悬浮于200μl PvuⅡ缓冲液中(50mM Tris-HCl(pH7.5)、60mM NaCl、6mM MgCl2)。加入1单位PvuⅡ，反应混合液在37℃下保温5分钟。于65℃下加热10分钟使酶失活。然后加入30μl 10X BamHⅠ缓冲液(200mM Tris-HCl(pH8.0)、1M NaCl、70mM MgCl2)、70μl H2O和10单位BamHⅠ，反应液于37℃下保温1小时。然后加入5单位碱性磷酸酯酶，于65℃下保温1小时。在1%琼脂糖凝胶上分离各DNA片段，并纯化出一个大小为单切割片段的DNA片段(图3)。
基本按实例4的方法合成一个带有一个平末端和一个BamHⅠ末端的DNA连接子。此连接子(示于图3)具有下列结构
基本按实例2的方法将该连接子用激酶处理，并连入经BamHⅠ-PvuⅡ消化的质粒pNM789。用此连接混合物转化大肠杆菌K12RV308细胞，基本按实例3的方法对这些转化体进行质粒的分离。选择出若干含适当大小的PvuⅡ片段(494bp)和XbaⅠ-BamHⅠ片段(628bp)的质粒。从接近BamHⅠ位点的独特的SmaⅠ位点进行测序，确定至少两个质粒的顺序，选择出一个具有所需顺序的克隆。这个中间质粒定名为质粒120。此方法的图示和质粒120的限制位点和功能图谱示于附图3。
为分离EK-BGH的编码DNA，在含有限制酶XbaⅠ和BamHⅠ各约50单位的200μl高盐缓冲液中消化约10μg质粒120。利用琼脂糖凝胶电泳分离消化产物，基本按实例6的方法分离编码EK-BGH的～0.6kbXbaⅠ-BamHⅠ限制片段，并准备用于连接。
此外，用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ消化质粒pL32，分离出～3.9kb限制片段，并准备用于连接。基本按实例2的方法，使质粒pL32的～3.9kb XbaⅠ-BamHⅠ限制片段与质粒120的～0.6kb XbaⅠ-BamHⅠ限制片段连接，生成质粒pL47。质粒pL47的限制位点和功能图谱示于附图4。基本按实例3的方法，将质粒pL47转化入大肠杆菌K12 MO(λ+)，鉴定出大肠杆菌K12 MO(λ+)/pL47转化体。基本按实例1的方法，从转化体中制备质粒pL47 DNA。
实例8大肠杆菌K12RV308/pPR12AR1的构建质粒pPR12含有温度敏感性pL阻遏物基因cI857和质粒pBR322的四环素抗性基因。质粒pPR12已在1984年3月13日颁发的美国专利4，436，815中公开并请求保护。质粒pPR12的限制位点和功能图谱示于附图4。
于37℃下，在200μl高盐缓冲液中用约50单位限制酶EcoRⅠ消化约10μg质粒pPR122小时。基本按实例5的方法沉淀出经EcoRⅠ消化的质粒pPR12DNA并用Klenow酶处理。Klenow酶反应后，基本按实例2的方法通过连接使经EcoRⅠ消化、Klenow酶处理的质粒pPR12DNA再环化。连接后的DNA就构成了所需的质粒pPR12△R1。基本按实例3的方法用此DNA转化大肠杆菌K12RV308，但选择过程是根据四环素(5μg/ml)抗性而不是氨苄青霉素抗性。大肠杆菌K12RV308可从NRRL得到，登记号为NRRLB-15624。鉴定出大肠杆菌K12RV308/pPR12△R1转化体后，基本按实例1的方法由这些转化体制备质粒pPR12△R1DNA。
在37℃下，在200μl中盐缓冲液中用约50单位限制酶AvaⅠ消化约10μg质粒pPR12△R12小时。基本按实例5的方法沉淀出经AvaⅠ消化的质粒pPR12△p1DNA并用Klenow酶处理。Klenow酶反应后，基本按实例2的方法使经AvaⅠ消化的、Klenow酶处理的质粒pPR12△R1DNA与EcoRⅠ连接子(5′-GAGGAATTCCTC-3′)连接。连接子连接后，沉淀出DNA，然后再悬浮于含约50单位限制酶EcoRⅠ的约200μl高盐缓冲液中。所得反应液于37℃下保温约2小时。EcoRⅠ消化后，基本按实例6的方法，将反应混合液加到琼脂糖凝胶上，纯化出～5.1kbEcoRⅠ限制片段。基本按实例2的方法，通过连接使～5.1kbEcoRⅠ限制片段再环化。连接后的DNA就构成了所需的质粒pPR12AR1。基本按实例3的方法将质粒pPR12AR1DNA转化入大肠杆菌K12RV308，但选择过程是根据四环素抗性而不是氨苄青霉素抗性。鉴定出大肠杆菌K12RV308/pPR12AR1转化体后，基本按实例1的方法制备质粒pPR12AR1DNA。质粒pPR12AR1的限制位点和功能图谱示于附图4。
实例9大肠杆菌K12RV308/pL110的构建将约10μg质粒pPR12AR1DNA悬浮于约200ml含限制酶PstⅠ和EcoRⅠ各约50单位的高盐缓冲液中，将消化反应液在37℃下保温约2小时。然后基本按实例6的方法，将反应混合液加到琼脂糖凝胶上，分离出质粒pPR12AR1的～2.9kbPstⅠ-EcoRⅠ限制片段，并准备用于连接。
于37℃下，在200μl高盐缓冲液中用限制酶PstⅠ和BamHⅠ消化约10μg质粒pL472小时。基本按实例6的方法，将PstⅠ-BamHⅠ消化的DNA加到琼脂糖凝胶上，分离出含复制起点的～2.7kbPstⅠ-BamHⅠ限制片段和一部分氨苄青霉素抗性基因，并准备用于连接。在另一个反应中，基本按实例6的方法，于37℃下，在200μl高盐缓冲液中，用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化约10μg质粒pL47DNA2小时，分离出含有新的转录和翻译激活顺序和EK-BGH编码DNA的～1.03kbEcoRⅠ-BamHⅠ限制片段，并准备用于连接。用所得到的～2μg的～1.03kbEcoRⅠ-BamHⅠ限制片段来构建质粒pL110。
基本按实例2和3的方法，使质粒pL47的～2.7kbPstⅠ-BamHⅠ和～1.03kbEcoRⅠ-BamHⅠ限制片段与质粒pPR12AR1的～2.9kbPstⅠ-EcoRⅠ限制片段相连，从而构建出质粒pL110，用连接后的DNA转化大肠杆菌K12RV308，但利用四环素抗性而不是氨苄青霉素抗性作为选择转化体的根据。
两个PstⅠ限制酶识别位点存在于EK-BGH编码区中，这在附图所示的限制位点和功能图谱中没有画出来。质粒pL110的限制位点和功能图谱示于附图4。
实例10BK病毒DNA的制备BK病毒得自ATCC，登记号为ATCC VR-837。该病毒以冻干形式得到，再悬浮于Hank′s平衡盐溶液中(Gibco，3175 Staley Road，Grand Island，NY 14072)，使其效价约为105个噬菌斑形成单位(pfu)/ml。选择用来制备BK病毒DNA的宿主为初生人胚肾(PHEK)细胞，可从Flow Laboratories，Inc.(7655 Old Springhouse Road，McLean，VA22101)得到，目录号为0-100，也可从M.A.Bioproducts得到，目录号为70-151。
用大约甯龊性 06个PHEK细胞的汇合单层的75mm2聚苯乙烯培养瓶来制备病毒。每瓶中加入约1ml效价为105pfu/ml的BK病毒，然后于37℃下培养1小时，然后加入新鲜培养基(Dulbecco修改的Eegle氏培养基，Gibco，添加了10%胎牛血清)，将感染后的细胞于37℃下培养10-14天，或培养至观察到充分的细胞致病作用。这种细胞致病作用随细胞系和病毒的不同而不同，但通常包括细胞的集拢、聚集和从培养皿上脱落。
通过三次冻融循环使病毒从细胞中释放出来，以5000xg离心除去细胞碎片。沉淀1升上清液中的病毒，加入100gPEG-6000，于4℃下将该溶液保温24小时，以5000xg离心20分钟收集病毒。将沉淀溶于0.1XSSC缓冲液(1XSSC＝0.15MNaCl和0.015M柠檬酸钠，pH＝7)，使体积为原体积的1/100。将该病毒悬浮液铺在离心管中的15ml饱和KBr溶液上，以75，000xg离心3小时。离心后，在KBr溶液中显现出两条带。较低的条带含有完整的病毒粒子，收集后在Sephadex
G-50柱(Sigma Chemical Co.，P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178)上脱盐，用TE(10mM Tris-HCl，pH＝7.8，1mM EDTA)作洗脱缓冲液。
从柱中得到纯化的病毒粒子溶液，向其中加入十二烷基硫酸钠(SDS)至浓度为1%;加入链霉蛋白酶至浓度为100μg/ml，将该溶液在37℃下保温2小时。然后向溶液中加入氯化铯至密度为1.56g/ml，向溶液中加入溴化乙锭至终浓度为100μg/ml。将该溶液置于Sorvall(DuPontInst.Products，BiomedicalDivision，Newton，CT06470)865转子或类似的垂直转子中以260，000xg离心24小时。离心后，分离出病毒DNA条带，用由100mMTris-HCl，pH7.8饱和的异戊醇萃取五次。然后将BK病毒DNA对TE缓冲液透析，直到该DNA的260nm/280nm光吸收比在1.75和1.90之间。调整NaCl浓度至0.15M，加入两倍体积的乙醇并在-70℃下保温溶液至少2小时，以12，000xg离心该溶液10分钟而沉淀出DNA。将所得BK病毒DNA沉淀以1mg/ml的浓度悬浮于TE缓冲液中。BK病毒的限制位点和功能图谱示于附图5。
实例11质粒pBKneo1和pBKneo2的构建从ATCC以冻干形式得到大肠杆菌K12HB101/pdBPV-MMTneo细胞，登记号为ATCC37224。将冻干的细胞涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平板上，于37℃下培养获得单菌落分离菌。
用大肠杆菌K12 HB101/pdBPV-MMTneo的一个菌落接种含50μg/ml氨苄青霉素的1升L-液体培养基(每升含10g胰胨、10g NaCl、5g酵母抽提物)，在37℃下置空气摇床中培养，直到O.D.590为～1个光吸收单位，此时在培养物中加入150mg氯霉素。继续培养约16小时。氯霉素的加入抑制了蛋白质的合成，因此抑制了细胞的进一步分裂，但允许质粒继续复制。
然后，基本按实例1的方法从该培养中分离质粒DNA，将由此方法得到的～1mg质粒pdBPV-MMTneoDNA悬浮于1m1TE缓冲液中，于-20℃下贮存。
在37℃下，分别将约5μg(5μl)上面制备的质粒pdBPV-MMTneo DNA和5μg(5μl)实例10制备的BK病毒DNA在一种溶液中消化2小时，该溶液中含有2μl 10X BamHⅠ缓冲液(1.5M NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.9;60mM MgCl2;1mg/ml BSA)、1μl限制酶BamHⅠ、7μlH2O。用等体积的苯酚萃取一次，然后用氯仿萃取两次，停止反应。然后沉淀出每个经BamHⅠ消化的DNA，离心收集，并再悬浮于5μl H2O中。
在BamHⅠ消化的质粒pdBPV-MMTneo(1μl)和BamHⅠ消化的BK病毒DNA(1μl)的混合物中加入约1μl 10X连接酶缓冲液。在该DNA混合物中加入1μl(～1000单位)T4DNA连接酶和6μlH2O后，将所得反应液于16℃下保温过夜。连接后的DNA就构成了所需的质粒pBKneo1和pBKneo2，它们的区别仅在于BK病毒DNA的取向不同。质粒pBKneo1含有一个～2.1kb SalⅠ-HindⅢ限制片段。
大肠杆菌K12HB101细胞可以从NRRL以冻干形降玫剑羌呛盼狽RRLB-15626。基本按实例3的方法，培养大肠杆菌K12HB101细胞，使其成为转化感受态，并用上面制备的连接后的DNA进行转化。将转化细胞涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平板上。利用氨苄青霉素抗性表型和质粒DNA的限制酶分析鉴定出大肠杆菌K12HB101/pBKneo1和大肠杆菌K12/pBKneo2转化体。质粒pBKneo1的限制位点和功能图谱示于附图5。
实例12质粒pBLcat的构建A.中间质粒pLPcat的构建腺病毒2(Ad2)的病毒粒子DNA是大小约为35.94kb的一个双链线性分子。在Ad2基因组的～0.316kbAccⅠ-PvuⅡ限制片段上能分离出Ad2晚期启动子，这个～0.32kb的限制片段相应于Ad2基因组的5755和6071位核苷酸之间的顺序。为分离所需的～0.32kbAccⅠ-PvuⅡ限制片段，首先用限制酶BalⅠ消化Ad2DNA，分离出含～0.32kbAccⅠ-PvuⅡ限制片段整个顺序的～2.4kbBalⅠ限制片段。然后用AccⅠ和PvuⅡ消化～2.4kbBalⅠ限制片段，得到所需的片段。
将约50μg Ad2 DNA(可从BRL或ATCC VR-2得到)溶于80μl H2O和10μl 10X BalⅠ缓冲液(100mM Tris-HCl，pH＝7.6;120mM MgCl2;100mM DTT;1mg/ml BSA)中。在Ad2 DNA溶液中加入约10μl(～20单位)限制酶BalⅠ，所得反应液于37℃下保温4小时。
将BalⅠ消化的DNA加到琼脂糖凝胶上进行电泳，直到各限制片段完全分开。用溴化乙锭稀溶液(0.5μg/ml)染色凝胶，把染色后的凝胶置于长波紫外(UV)光下显现电泳后的DNA。有一种从琼脂糖中分离DNA的方法如下。在凝胶中的所需片段的前沿切一个小口，把一小片NA-45DEAE膜(SchleicherandSchuell，Keene，NH03431)放在每个小口中。进一步电泳后，DNA就非共价地结合在DEAE膜上。所需片段结合到DEAE膜上后，取出该膜，用低盐缓冲液(100mMKCl;0.1mMEDTA;20mMTris-HCl，pH＝8)冲洗。然后把膜放在一个小管中，用高盐缓冲液(1MNaCl;0.1mMEDTA;20mMTris-HCl，pH＝8)浸泡，然后于65℃下保温1小时，从DEAE膜上移出DNA。65℃保温后，收集保温缓冲液，用高盐缓冲液冲洗膜。将高盐冲洗溶液与高盐保温缓冲液合并。
调整高盐DNA溶液的体积，使NaCl浓度为0.25M，在该溶液中加入3倍体积的冷无水乙醇。混合所得溶液并于-70℃下放置10-20分钟。然后以15，000rpm离心该溶液15分钟。再沉淀一次除去残留的盐后，用乙醇洗DNA沉淀，干燥后再悬浮于20μlTE缓冲液中，构成Ad2的约3μg所需限制片段。将所得的纯化片段溶解于10μlTE缓冲液中。
向Ad2的～2.4kb BalⅠ限制片段的溶液中加入约6μlH2O和2μl 10X AccⅠ缓冲液(60mM NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.5;60mM MgCl2;60mM DTT;1mg/ml BSA)。向该DNA溶液中加入约2μl(～10单位)限制酶AccⅠ，反应液于37℃下保温2小时。AccⅠ消化后，利用乙醇沉淀法收集DNA并再悬浮于16μl H2O和2μl 10X PvuⅡ缓冲液(600mM NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.5;60mM MgCl2;60mM DTT;1mg/ml BSA)中。向该DNA溶液中加入约2μl(约10单位)限制酶PvuⅡ后，反应液于37℃下保温2小时。
将AccⅠ-PvuⅡ消化的Ad2的～2.4kb BalⅠ限制片段加到～6%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，直到含有Ad2晚期启动子的～0.32kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段与其它消化产物分离。用溴化乙锭染色凝胶，用紫外光进行观察，从凝胶上切下含～0.32kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段的胶条，破碎后于室温下在～250μl萃取缓冲液(500mM NH4OAc;10mM MgOAc;1mM EDTA;0.1% SDS)中浸泡过夜。第二天早晨，离心该混合物，弃去沉淀。用乙醇沉淀出上清液中的DNA，加入约2μg tRNA以确保完全沉淀出所需的片段。得到约0.2μg～0.32kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段并悬浮于7μlH2O中。
基本按实例2所述方法用激酶处理约0.25μg(0.5μl)BclⅠ连接子(5′-CTGATCAG-3′，可从New England Biolabs得到)，然后将其加入～0.32kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段溶液中，然后向该DNA溶液中加入1μl(～1000单位)T4DNA连接酶和1μl10X连接酶缓冲液，将所得反应液于16℃下保温过夜。BclⅠ连接子只能与AccⅠ-PvuⅡ限制片段的PvuⅡ末端连接。以后的DNA顺序测定表明，有四个BclⅠ连接子与AccⅠ-PvuⅡ限制片段的PvuⅡ末端连接。这些额外的BclⅠ连接子可通过BclⅠ消化和再连接来除去，然后这些额外的BclⅠ连接子并未除去，因为这些连接子并不干扰含这些连接子的载体正确行使功能。
从ATCC以冻干形式得到大肠杆菌K12HB101/pSV2cat细胞，登记号为ATCC 37155。基本按实例1的方法从这些细胞中分离出质粒pSV2cat DNA。得到约1mg质粒pSV2cat DNA并溶解于1ml TE缓冲液中。将约3μg(3μl)质粒pSV2cat DNA加入2μl 10X AccⅠ缓冲液和16μl H2O中，然后向该pSV2cat DNA溶液中加入3μl(约9单位)限制酶AccⅠ，所得反应液于37℃下保温2小时。然后加入3μl 10X StuⅠ缓冲液(1.0M NaCl;100mM Tris-HCl，pH＝8.0;100mM MgCl2;60mM DTT;1mg/ml BSA)、5μl H2O和约2μl(约10单位)限制酶StuⅠ，从而用限制酶StuⅠ消化经AccⅠ消化的质粒pSV2cat DNA。所得反应液于37℃下保温2小时。用苯酚萃取反应混合液一次，然后用氯仿萃取两次，从而终止反应。得到约0.5μg所需片段并溶解于20μl TE缓冲液中。
将约4μl AccⅠ-StuⅠ消化的质粒pSV2cat DNA与约7μl Ad2的～0.32kb AccⅠ-PvuⅡ(连有BclⅠ连接子)限制片段混合，加入3μl 10X连接酶缓冲液、15μl H2O和2μl(约1000单位)T4DNA连接酶后，将连接反应液于16℃下保温过夜。连接后的DNA构成所需的质粒pLPcat，此质粒含有Ad2晚期启动子，该启动子的定位能够驱动氯霉素乙酰转移酶的转录，因而驱动其表达。质粒pLPcat的限制位点和功能图谱示于附图6。
基本按实例3的方法，用连接后的DNA转化大肠杆菌K12HB101细胞。将转化细胞涂布在含50μg/ml氨苄青霉素的L琼脂上，利用质粒DNA的限制酶分析来鉴定大肠杆菌K12HB101/pLPcat转化体。基本按实例1所述的质粒分离方法，从转化体中分离出质粒pLPcatDNA用于后续的构建中。
B.质粒pBLcat的最终构建将50μl TE缓冲液中的约88μg质粒pBKneol DNA加入7.5μl 10X AccⅠ缓冲液、30μl H2O和15μl(约75单位)限制酶AccⅠ中，将所得溶液于37℃下保温2小时。将AccⅠ消化的BK病毒DNA加到琼脂糖凝胶上，将含BK增强子的～1.4kb片段与其它消化产物分离。然后基本按实例12A所述方法分离出～1.4kb AccⅠ限制片段。将约5μg该片段再悬浮于5μl 10X PvuⅡ缓冲液、45μl H2O和5μl(约25单位)限制酶PvuⅡ中，将所得反应液于37℃下保温2小时。然后基本按实例12A的方法分离出PvuⅡ消化的DNA并准备用于连接。得到约2μg所需的～1.28kb AccⅠ-PvuⅡ片段并悬浮在5μl TE缓冲液中。
将约1μg质粒pLPcat DNA溶解于5μl 10X AccⅠ缓冲液和40μl H2O中。向质粒pLPcat DNA溶液中加入约5μl(～25单位)限制酶AccⅠ，将所得溶液在37℃下保温。用乙醇沉淀出AccⅠ消化的质粒pLPcat DNA并再悬浮于5μl 10X StuⅠ缓冲液、40μl H2O和5μl(约25单位)限制酶StuⅠ中，将所得反应液于37℃下保温2小时。用乙醇沉淀AccⅠ-StuⅠ消化的质粒pLPcat DNA若干次，纯化出含大肠杆菌复制起点和Ad2晚期启动子的～4.81kb AccⅠ-StuⅠ限制片段，而去除了另一个消化产物，后者是一个大小约为16bp的限制片段。得到约1μg所需的～4.8lkb限制片段并溶解于20μl TE缓冲液中。
将5μl质粒pLPcat的～4.8lkb AccⅠ-StuⅠ限制片段加到5μl BK病毒的～1.28kb AccⅠ-PvuⅡ限制片段中。在DNA混合液中加入3μl 10X连接酶缓冲液、15μl H2O和2μl(约1000单位)T4DNA连接酶后，将所得的连接反应液于16℃下保温过夜。连接后的DNA构成所需的质粒pBLcat。质粒pBLcat的限制位点和功能图谱示于附图6。
基本按实例3所述方法，用连接后的DNA转化大肠杆菌K12HB101细胞。利用质粒DNA的限制酶分析鉴定出大肠杆菌K12HB101/pBLcat转化体。基本按实例1的方法制备质粒pBLcatDNA用于后续的构建中。
实例13质粒pL133的构建A.中间质粒pSV2-HPC8的构建质粒pHC7含有编码人C蛋白的DNA顺序。基本按实例1的方法，用大肠杆菌K12RR1/pHC7(NRRLB-15926)培养物接种1升含15μg/ml四环素的L-液体培养基，并分离纯化质粒pHC7DNA。质粒pHC7的限制位点和功能图谱示于附图7。利用这一方法得约1mg质粒pHC7DNA，将其悬浮于1mlTE缓冲液中，于-20℃下贮存。
将50μl质粒pHC7 DNA与5μl(～50单位)限制酶BanⅠ、10μl 10X BanⅠ反应缓冲液(1.5M NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.9;60mM MgCl2;1mg/ml BSA)和35μl H2O混合，并保温至消化完全。然后将BanⅠ消化的质粒pHC7 DNA在3.5%聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶双丙烯酰胺为29∶1)上进行电泳，直到～1.25kb BanⅠ限制片段与其它消化产物分开。
从凝胶上切下含～1.25kbBanⅠ限制片段的凝胶区，置于一个试管中，破碎成小块。向装有这些小块的试管中加入1ml提取缓冲液(500mM NH4OAc、10mM MgOAc、1mM EDTA、1%SDS、10mg/ml tRNA)，将试管于37℃下放置过夜。利用离心法沉淀出碎片，将上清液移至一个新试管中。碎片用200μl提取缓冲液洗一次，将洗涤上清液与过夜提取的第一次上清液合并。使上清液通过一个玻璃棉塞后，在上清液中加入两倍体积的乙醇并混合。将所得溶液在干冰-乙醇浴中放置～10分钟，然后离心沉淀DNA。
由此方法得到约8μg～1.25kbBanⅠ限制片段。将纯化的片段悬浮于10μlTE缓冲液中并于-20℃下贮存。BanⅠ限制片段必须加入一个连接子进行修饰才能构建出质粒pSV2-HPC8。
将连接子的每条单链各500微微摩尔在20μl反应缓冲液中用激酶处理，反应缓冲液中含有15单位(～0.5μl)T4多核苷酸激酶、2μl 10X连接酶缓冲液、10μl 500μM ATP和7.5μl H2O。将激酶反应液于37℃下保温30分钟，于100℃下保温10分钟终止反应。为确保激酶反应完全，将反应液置冰上冷却，向反应混合液加入2μl 0.2M二硫苏糖醇、2.5μl 5mM ATP、15单位T4多核苷酸激酶并混合，再将反应混合液于37℃下保温30分钟。再在100℃下保温10分钟停止反应，然后置于冰上冷却。
DNA连接子的两条单链虽然分别进行激酶处理，但在激酶反应后混合在一起。为使这两条链退火，将激酶反应混合液置于装有～150ml水的水浴中于100℃下保温10分钟。保温后，关闭水浴使其冷却至室温，此过程需要大约3小时。然后将仍装有激酶处理的DNA管的水浴于4℃下保温过夜。此过程使两条单链退火。所构建的连接子具有下列结构
该连接子于-20℃下贮存备用。
在～50μl连接子(～500微微摩尔)、1μl T4DNA连接酶(～500单位)、10μl 10X连接酶缓冲液和29μl H2O中加入～8μg～1.25kb BanⅠ片段并混合，将所得的连接反应液于4℃下保温过夜。于65℃下保温10分钟停止连接反应。加入NaOAc至终浓度为0.3M，加入2倍体积的乙醇，在干冰-乙醇浴中冷却，然后离心该溶液沉淀出DNA。
将DNA沉淀溶解于10μl 10X ApaⅠ反应缓冲液(60mM NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.4;60mM MgCl2;60mM 2-巯基乙醇)、5μl(～50单位)限制酶ApaⅠ和85μl H2O中，将该反应液于37℃下放置2小时。然后如上所述停止反应并沉淀出DNA。将DNA沉淀溶解于10μl 10X HindⅢ反应缓冲液、5μl(～50单位)限制酶HindⅢ和85μl H2O中，将该反应液于37℃下放置2小时。HindⅢ消化后，基本按实例12A所述方法将反应混合液加到3.5%聚丙烯酰胺凝胶上，分离出所需的～1.23kb HindⅢ-ApaⅠ限制片段。得到约5μg所需片段，将其悬浮于10μl TE缓冲液中，于-20℃下贮存。
将50μl质粒pHC7 DNA与5μl(～50单位)限制酶PstⅠ、10μl 10X PstⅠ反应缓冲液(1.0M NaCl;100mM Tris-HCl，pH＝7.5;100mM MgCl2;1mg/ml BSA)和35μl H2O混合，于37℃下保温2小时。然后基本按上述方法，将PstⅠ消化的质粒pHC7DNA在3.5%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，纯化出所需的～0.88kb片段。得到约5μg所需片段，将其悬浮于10μlTE缓冲液中，于-20℃下贮存。
将～5μg～0.88kbPstⅠ片段加到～50μl下列连接子中并混合
该连接子是用DNA自动合成仪构建的。向DNA混合物中加入约1μlT4DNA连接酶(～10单位)、10μl 10X连接酶缓冲液和29μlH2O，将所得的连接反应液于4℃下保温过夜。
于65℃下保温10分钟停止连接反应。沉淀出连接的DNA后，将DNA沉淀溶解于10μl 10X ApaⅠ反应缓冲液、5μl(～50单位)限制酶ApaⅠ和85μl H2O中，将该反应液于37℃下放置2小时。然后停止反应并再一次沉淀DNA。将DNA沉淀溶解于10μl 10X BglⅡ反应缓冲液(1M NaCl;100mM Tris-HCl，pH＝7.4;100mM MgCl2;100mM 2-巯基乙醇;1mg/ml BSA)、5μl(～50单位)限制酶BglⅡ和85μl H2O中，将该反应液于37℃下放置2小时。BglⅡ消化后，基本按上述方法，将反应混合液加到3.5%聚丙烯酰胺凝胶上，分离出所需的～0.19kb ApaⅠ-BglⅡ限制片段。得到约1μg所需片段，将其悬浮于10μl TE缓冲液中，于-20℃下贮存。
将约10μg质粒pSV2gptDNA(ATCC37145)溶解于10μl10XHindⅢ反应缓冲液、5μl(～50单位)限制酶HindⅢ和85μlH2O中，将该反应液在37℃下放置2小时。然后在反应混合液中加入NaOAc至浓度为0.25M，加入两倍体积的乙醇并在干冰-乙醇浴中保温后，离心沉淀DNA。将DNA沉淀溶解于10μl 10X BglⅡ缓冲液、5μl(～50单位)限制酶BglⅡ和85μl H2O中，将该反应液于37℃下放置2小时。BglⅡ消化后，将反应混合液加到1%琼脂糖凝胶上，电泳分离各片段。用溴化乙锭染色凝胶并在紫外光下观察，从凝胶上切下含有所需的～5.1kb HindⅢ-BglⅡ片段的条带，放在透析管中，继续电泳至DNA走出琼脂糖。用苯酚和CHCl3萃取含有来自透析管的DNA的缓冲液，然后沉淀出DNA。将沉淀再悬浮于10μl TE缓冲液中，就构成～5μg所需的质粒pSV2gpt的～5.1kb HindⅢ-BglⅡ限制片段。
将2μl～1.23kb HindⅢ-ApaⅠ限制片段、3μl～0.19kb ApaⅠ-BglⅡ片段和2μl～5.1kb HindⅢ-BglⅡ片段混合在一起，然后加入10μl 10X连接酶缓冲液、1μl T4DNA连接酶(～500单位)和82μl H2O，于16℃下保温过夜。连接后的DNA构成所需的质粒pSV2-HPC8。质粒pSV2-HPC8的限制位点和功能图谱示于附图7。
基本按实例3所述方法，使大肠杆菌K12RR1(NRRLB-15210)细胞成为感受态用于转化。用上面制备的连接后的DNA转化细胞，取转化混合物的各等份试样涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂平板上。然后将这些平板于37℃下培养。通过质粒DNA的限制酶分析鉴定大肠杆菌K12RR1/pSV2-HPC8转化体。
B.质粒pL133的最终构建将50μg质粒pSV2-HPC8溶解于10μl 10X HindⅢ反应缓冲液、5μl(～50单位)限制酶HindⅢ和85μl H2O中，将该反应液于37℃下保温2小时。HindⅢ消化后，沉淀出DNA，将DNA沉淀溶解于10μl 10X SalⅠ反应缓冲液(1.5M NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.9;60mM MgCl2;60mM 2-巯基乙醇;1mg/ml BSA)、5μl(～50单位)限制酶SalⅠ和85μl H2O中。将所得的SalⅠ反应混合液于37℃下保温2小时。将HindⅢ-SalⅠ消化的质粒pSV2-HPC8加到3.5%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，直到所需的～0.29kb HindⅢ-SalⅠ限制片段与其它反应产物分离。幽褐蟹掷氤鏊杵危玫皆 μg片段并悬浮于10μl TE缓冲液中。
将50μg质粒pSV2-HPC8溶解于10μl 10X BglⅡ反应缓冲液、5μl(50单位)限制酶BglⅡ和85μl H2O中，将该反应液于37℃下保温2小时。BglⅡ消化后，沉淀出DNA，将DNA沉淀溶解于10μl 10X SalⅠ反应缓冲液、5μl(～50单位)限制酶SalⅠ和85μl H2O中。将所得的SalⅠ反应混合液于37℃下保温2小时。将SalⅠ-BglⅡ消化的质粒pSV2-HPC8加到3.5%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，直到所需的～1.15kb SalⅠ-BglⅡ限制片段与其它反应产物分离。从凝胶上分离出～1.15kb SalⅠ-BglⅡ限制片段，得到约8μg片段并悬浮于10μl TE缓冲液中。
将约10μg质粒pSV2-β-球蛋白DNA(NRRL B-15928)溶解于10μl 10X HindⅢ反应缓冲液、5μl(～50单位)限制酶HindⅢ和85μl H2O中，将该反应液于37℃下放置2小时。在反应混合液中加入NaOAc至浓度为0.25M，加入两倍体积的乙醇并在干冰-乙醇浴中保温后，离心沉淀DNA。将HindⅢ消化的质粒pSV2-β-球蛋白溶解于10μl 10X BglⅡ缓冲液、5μl(～50单位)限制酶BglⅡ和85μl H2O中，将该反应液于37℃下放置2小时。BglⅡ消化后，将反应混合液加到1%琼脂糖凝胶上，电泳分离各片段。从凝胶中分离出所需的～4.2kb HindⅢ-BglⅡ限制片段，得到约5μg所需片段并悬浮于10μl TE缓冲液中。
基本按实例13A的方法，将2μl质粒pSV2-HPC8的～0.29kbHindⅢ-SalⅠ片段、2μl质粒pSV2-HPC8的～1.15kbSalⅠ-BglⅡ片段、和2μl质粒pSV2-β-球蛋白的～4.2kbHindⅢ-BglⅡ片段混合在一起并连接。连接后的DNA构成所需的质粒pL133。质粒pL133的限制位点和功能图谱示于附图7。基本按实例16A的方法构建所需的大肠杆菌K12RR1/pL133转化体，但用质粒pL133而不是质粒pSV2-HPC8作为转化DNA。
实例14质粒pLPC的构建将约20μg质粒pBLcat DNA溶解于10μl 10X HindⅢ缓冲液和80μl H2O中。向质粒pBLcat DNA溶液中加入约10μl(～100单位)限制酶HindⅢ，将所得反应液在37℃下保温2小时。基本按实例12A的方法，将HindⅢ消化的质粒pBLcat DNA加到琼脂糖凝胶上进行电泳，直到含有BK增强子和Ad2晚期启动子的～0.87kb HindⅢ限制片段与其它消化产物分离;然后分离出～0.87kb片段并准备用于连接。得到约2μg所需片段并将其溶解于5μl TE缓冲液中。
将约1.5μg质粒pL133 DNA溶解于2μl 10X HindⅢ缓冲液和16μl H2O中。向该DNA溶液中加入约1μl(～10单位)限制酶HindⅢ，将所得反应液在37℃下保温2小时。然后基本按实例7的方法，用TE缓冲液将DNA稀释至100μl，并用小牛肠碱性磷酸酯处理。将HindⅢ消化的质粒pL133DNA用苯酚萃取两次，用氯仿萃取一次，用乙醇沉淀，并再悬浮于10μlTE缓冲液中。
在1.5μl HindⅢ消化的质粒pL133中加入约5μl质粒pBLcat的～0.87kb HindⅢ限制片段，然后向该DNA溶液中加入1μl 10X连接酶缓冲液、1μl(～1000单位)T4DNA连接酶和1.5μl H2O，将所得反应液于16℃下保温过夜。连接后的DNA就构成了所需的质粒pLPC。质粒pLPC的限制位点和功能图谱示于附图8。
基本按实例3的方法，用连接后的DNA转化大肠杆菌K12HB101。将转化细胞涂布在含氨苄青霉素的L-琼脂上，利用限制酶分析检查氨苄青霉素抗性转化体的质粒DNA，从而鉴定出大肠杆菌K12HB101/pLPC转化体。编码BK增强子和Ad2晚期启动子的～0.87kbHindⅢ限制片段能以两种取向之一插入HindⅢ消化的质粒pL133中，但只有～1.0kbNdeⅠ-StuⅠ片段的构建体才生成pLPC。
实例15质粒pLPChyg1和pLPChyg2的构建大肠杆菌K12RR1/pSV2hyg细胞得自NRRL，登记号为NRRLB-18039。基本按实例1的方法，从该细胞中得到质粒pSV2hygDNA。质粒pSV2hyg的限制位点和功能图谱示于附图8。
将约10μg(在10μl TE缓冲液中)质粒pSV2hyg加到2μl 10X BamHⅠ缓冲液和6μl H2O中。在该DNA溶液中加入约2μl(约20单位)限制酶BamHⅠ，将所得反应液在37℃下保温2小时。反应液先用苯酚萃取，然后再用氯仿萃取两次。基本按实例12A所述方法，将BamHⅠ消化的质粒pSV2hygDNA加到琼脂糖凝胶上，分离出含潮霉素抗性基因的～2.5kb限制片段。
在BamHⅠ消化的质粒pSV2hyg DNA溶液中加入约5μl 10X Klenow酶缓冲液(四种dNTP各0.2mM;0.5M Tris-HCl，pH＝7.8;50mM MgCl2;0.1M 2-巯基乙醇;100μg/ml BSA)和35μl H2O，然后在该DNA混合物中加入约25单位Klenow酶(约5μl，BRL出售)，将所得反应液于16℃下保温30分钟。将经Klenow酶处理、BamHⅠ消化的质粒pSV2hyg DNA用苯酚萃取一次，用氯仿萃取一次，用乙醇沉淀。得到约2μg所需片段并悬浮于5μl TE缓冲液中。
将约10μg(10μl)质粒pLPC DNA加到2μl 10X StuⅠ缓冲液和6μl H2O中。在该DNA溶液中加入约2μl(～10单位)限制酶StuⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。用乙醇沉淀StuⅠ消化的质粒pLPC DNA，离心收集，再悬浮于2μl 10X NdeⅠ缓冲液(1.5M NaCl;0.1M Tris-HCl，pH＝7.8;70mM MgCl2;60mM 2-巯基乙醇;1mg/ml BSA)和16μl H2O中。在StuⅠ消化的DNA溶液中加入约2μl(～10单位)限制酶NdeⅠ，将所得反应液在37℃下保温2小时。
将NdeⅠ-StuⅠ消化的质粒pLPC DNA用乙醇沉淀，离心收集，并再悬浮于5μl 10X Klenow酶缓冲液和40μl H2O中。在该DNA溶液中加入约5μl(～25单位)Klenow酶，将所得反应液于16℃下保温30分钟。Klenow酶反应后，将反应混合液加到琼脂糖凝胶上，从凝胶中分离出～5.82kb NdeⅠ-StuⅠ限制片段。得到约5μg所需片段并悬浮于5μlTE缓冲液中。
将约2μl质粒pSV2hyg的～2.5kb Klenow酶处理的BamHⅠ限制片段与约1μl质粒pLPC的～5.82kb经Klenow酶处理的NdeⅠ-StuⅠ限制片段混合，向该DNA溶液中加入约3μl 10X连接酶缓冲液、2μl T4DNA连接酶(～1000单位)、1μl T4DNA连接酶(～1单位)和14μl H2O。将所得反应液于16℃下保温过夜。连接后的DNA就构成了所需的质粒pLPChyg1和pLPChyg2，它们的区别仅在于质粒pSV2hyg的～2.5kb Klenow酶处理的BamHⅠ限制片段的取向不同。质粒pLPChyg1的限制位点和功能图谱示于附图8。基本按实例3的方法，用连接后的DNA转化大肠杆菌K12 HB101。将所要的大肠杆菌K12 HB101/pLPChyg1和大肠杆菌K12 HB101/pLPChyg2转化体涂布在含氨苄青霉素的L-琼脂上，利用质粒DNA的限制酶分析进行鉴定。
实例16质粒pBW32的构建A.中间质粒pTPA103的构建质粒pTPA102含有人组织血纤维蛋白溶酶原激活因子(TPA)的编码顺序。质粒pTPA102可从大肠杆菌K12MM294/pTPA102中分离得到，该菌株可从NRRL得到，登记号为NRRLB-15834。质粒pTPA102的限制位点和功能图谱示于附图9。基本按实例1的方法，从大肠杆菌K12MM294/pTPA102中分离质粒pTPA102DNA。
将约50μg质粒pTPA102(在约50μlTE缓冲液中)加到10μl10XTthlllⅠ缓冲液(0.5MNaCl;80mMTris-HCl，pH＝7.4;80mM MgCl2;80mM 2-巯基乙醇;1mg/ml BSA)和80μl H2O中。向该DNA溶液中加入约10μl(～50单位)限制酶TthlllⅠ，将所得反应液于65℃下保温2小时。将反应混合液加到琼脂糖凝胶上，从凝胶中分离出含有TPA编码顺序的～4.4kb TthlllⅠ限制片段。弃去其它消化产物，即3.1kb和0.5kb限制片段。得到约10μg所需的～4.4kb TthlllⅠ限制片段并悬浮于10μl TE缓冲液中。
在含有～4.4kb TthlllⅠ限制片段的溶液中加入约5μl 10X Klenow酶缓冲液和30μl H2O，再加入约5μl Klenow酶(～5单唬┖螅从旌弦河 6℃下保温30分钟。Klenow酶反应后，用乙醇沉淀出DNA并再悬浮于3μl 10X连接酶缓冲液和14μl H2O中。
利用下列方法将具有下列顺序的BamHⅠ连接子(NewEnglandBiolabs)用激酶处理并准备用于连接。
将4μl连接子(～2μg)溶解于20.15μl H2O和5μl 10X激酶缓冲液(500mM Tris-HCl，pH＝7.6和100mM MgCl2)中，于90℃下保温2分钟，然后冷却到室温。向该混合物中加入5μlγ-32P-ATP(～20μCi)、2.5μl 1M DTT和5μl多核苷酸激酶(～10单位)，然后于37℃下保温30分钟。然后加入3.35μl 0.01M ATP和5μl激酶，于37℃下继续反应30分钟。放射性ATp有助于确定连接子是否已连接到目标DNA上。
将约10μl经激酶处理的BamHⅠ连接子加到～4.4kb TthlllⅠ限制片段溶液中，加入2μl T4DNA连接酶(～1000单位)和1μl T4RNA连接酶(～2单位)后，将连接反应液于4℃下保温过夜。用乙醇沉淀出连接后的DNA并再悬浮于5μl 10X HindⅢ缓冲液和40μl H2O中。向该DNA溶液中加入约5μl(～50单位)限制酶HindⅢ，将所得反应液于37℃下保温2小时。
用乙醇沉淀出HindⅢ消化的DNA并悬浮于10μl 10X BamHⅠ缓冲液和90μl H2O中。向该DNA溶液中加入约10μl(～100单位)限制酶BamHⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。BamHⅠ消化后，将反应混合液加到琼脂糖凝胶上，从凝胶中分离出～2.0kb BamHⅠ-HindⅢ限制片段。得到约4μg所需片段并悬浮于约5μl TE缓冲液中。
为构建质粒pTPA103，将得自质粒pTPA102的～2.0kbBamHⅠ-HindⅢ限制片段插入BamHⅠ-HindⅢ消化的质粒pRC中。质粒pRC的构建方法是将含有大肠杆菌trp操纵子的启动子和操纵基因(trpPO)顺序的～288bpEcoRⅠ-ClaⅠ限制片段插入到EcoRⅠ-ClaⅠ消化的质粒pKC7中。质粒pKC7可从ATCC以大肠杆菌K12N100/pKC7的形式得到，登记号为ATCC37084。含trpPO的～288bpEcoRⅠ-ClaⅠ限制片段可从质粒pTPA102中分离，后者可从大肠杆菌K12MM294/pTPA102(NRRLB-15834)中分离。质粒pKC7和质粒pTPA102DNA可基本按实例1的方法从上述细胞系中得到。质粒pTPA102的这个～0.29kbEcoRⅠ-ClaⅠ限制片段含有大肠杆菌trp基因的转录激活顺序和大部分翻译激活顺序，并具有下面画出的顺序。
因此，为构建质粒pRC，将10μl TE缓冲液中的约2μg质粒pKC7加到2μl 10X ClaⅠ缓冲液(0.5M NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.9;60mM MgCl2;1mg/ml BSA)和6μl H2O中。在质粒pKC7 DNA溶液中加入约2μl(～10单位)限制酶ClaⅠ，将所得反应液在37℃下保温2小时。用乙醇沉淀ClaⅠ消化的质粒pKC7 DNA并再悬浮于2μl 10X EcoRⅠ缓冲液和16μl H2O中。在ClaⅠ消化的质粒pKC7 DNA溶液中加入约2μl(～10单位)限制酶EcoRⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。
将EcoRⅠ-ClaⅠ消化的质粒pKC7DNA用苯酚萃取一次，然后用氯仿萃取两次。然后用乙醇沉淀DNA并再悬浮于3μl10X连接酶缓冲液和20μl H2O中。质粒pKC7的限制位点和功能图谱可从文献得到(Maniatis et al.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，1982，第8页)。
将约20μl TE缓冲液中的约20μg质粒pTPA102加到10μl 10X ClaⅠ缓冲液和60μl H2O中。在质粒pTPA102DNA的溶液中加入约10μl(～50单位)限制酶ClaⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。用乙醇沉淀ClaⅠ消化的质粒pTPA102 DNA，并悬浮于10μl 10X EcoRⅠ缓冲液和80μl H2O中。在ClaⅠ消化的质粒pTPA102 DNA溶液中加入约10μl(～50单位)限制酶EcoRⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。
将EcoRⅠ-ClaⅠ消化的质粒pTPA102 DNA用苯酚萃取一次，加到7%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，直到含trpPO的～288bp EcoRⅠ-ClaⅠ限制片段与其它消化产物分离。从凝胶中分离出～288bp EcoRⅠ-ClaⅠ限制片段，得到约1μg所需片段，将其悬浮于5μl TE缓冲液中，然后加到如上所述制备的EcoRⅠ-ClaⅠ消化的质粒pKC7 DNA溶液中。然后在该DNA混合物中加入约2μl(～1000单位)T4DNA连接酶，将所得连接反应液于16℃下保温2小时。连接后的DNA就构成了所需的质粒pRC DNA。
基本按实例3的方法，用连接后的DNA转化大肠杆菌K12HB101感受态细胞。将转化细胞涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂上，利用质粒DNA的限制酶分析筛选出氨苄青霉素抗性转化体，从而鉴定出所需的大肠杆菌K12HB101/pRC菌落。基本按实例1的方法从大肠杆菌K12HB101/pRC转化体中得到质粒pRCDNA。
将2μlTE缓冲液中的约2μg质粒pRCDNA加到2μl10XHindⅢ缓冲液和16μl H2O中。在质粒pRC DNA溶液中加入约2μl(～10单位)限制酶HindⅢ，将所得反应液在37℃下保温2小时。用乙醇沉淀HindⅢ消化的质粒pRC DNA并再悬浮于2μl 10X BamHⅠ缓冲液和16μl H2O中。在HindⅢ消化的质粒pRC DNA溶液中加入约2μl(～10单位)限制酶BamHⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。
将BamHⅠ-HindⅢ消化的质粒pRC DNA用苯酚萃取一次，然后用氯仿萃取两次。用乙醇沉淀DNA并再悬浮于3μl 10X连接酶缓冲液和20μl H2O中。然后向BamHⅠ-HindⅢ消化的质粒pRC DNA溶液中加入～4μg(在～5μl TE缓冲液中)质粒pTPA102的～2.0kb HindⅢ-BamHⅠ限制片段。向该DNA混合物中加入约2μl(～1000单位)T4DNA连接酶，将所得反应液于16℃下保温2小时。连接后的DNA构成了所需的质粒pTPA103DNA。
为减少不期望的转化体，用限制酶NcoⅠ消化连接后的DNA，该酶切割质粒pRC但不切割质粒pTPA103。因此，用NcoⅠ消化连接后的DNA减少了不期望的转化体，因为线性化的DNA转化大肠杆菌的频率比闭环DNA低。为消化连接后的DNA，先用乙醇沉淀DNA，然后再悬浮于2μl 10X NcoⅠ缓冲液(1.5M NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.8;60mM MgCl2;1mg/ml BSA)和16μl H2O。向该DNA溶液中加入约2μl(～10单位)限制酶NcoⅠ，将所得反应液在37℃下保温2小时。
用经过连接而后又经NcoⅠ消化的DNA转化大肠杆菌K12RV308(NRRLB-15624)。基本按实例3的方法使大肠杆菌K12RV308细胞成为感受态并进行转化。将转化混合物涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的L-琼脂上。测试氨苄青霉素抗性转化对卡那霉素的敏感性，因为虽然质粒pRC赋予卡那霉素抗性，但质粒pTPA103不然。然后用氨苄青霉素抗性、卡那霉素敏感性转化体制备质粒DNA，利用限制酶分析检查该质粒DNA，鉴定出大肠杆菌K12RV308/pTPA103转化体。质粒pTPA103的限制位点和功能图谱示于附图9。基本按实例1的方法，从大肠杆菌K12RV308/pTPA103细胞中分离质粒pTPA103DNA。
B.中间质粒pBW25的构建将1μl TE缓冲液中的约1μg质粒pTPA103 DNA加到2μl 10X BglⅡ缓冲液和16μl H2O中。在质粒pTPA103 DNA溶液中加入约1μl(～5单位)限制酶BglⅡ，将所得反应液于37℃下保温2小时。用乙醇沉淀BglⅡ消化的质粒pTPA103 DNA并再悬浮于5μl 10X Klenow酶缓冲液和44μl H2O中。向BglⅡ消化的质粒pTPA103 DNA溶液中加入约1μl Klenow酶(～1单位)，将所得反应液于16℃下保温2小时。用乙醇沉淀经Klenow酶处理、BglⅡ消化的质粒pTPA103 DNA，并再悬浮于3μl 10X连接酶缓冲液和22μl H2O中。
在经Klenow酶处理、BglⅡ消化的质粒pTPA103DNA溶液中，加入约2μl(0.2μg)未经激酶处理的NdeⅠ连接子(NewEnglandBiolabs)，这这些连接子具有如下结构
同时加入2μl(～1000单位)T4DNA连接酶和1μl(～2单位)T4RNA连接酶，将所得连接反应液于4℃下保温过夜。连接后的DNA就构成了质粒pTPA103derNdeⅠ，它基本类似于质粒pTPA103，只是质粒pTPA103derNdeⅠ具有一个NdeⅠ识别顺序，而质粒pTPA103具有一个BglⅡ识别顺序。
基本按实例3所述方法，用连接后的DNA转化大肠杆菌K12RV308感受态细胞。将转化细胞涂布在含氨苄青霉素的L-琼脂上，利用质粒DNA的限制酶分析鉴定出大肠杆菌K12RV308/pTPA103derNdeⅠ转化体。基本按实例1的方法，从这些转化体中分离出质粒pTPA103derNdeⅠDNA并用于后续的构建中。
将10μl TE缓冲液中的约10μg质粒pTPA103derNdeⅠDNA加到2μl 10X AvaⅡ缓冲液(0.6M NaCl;60mM Tris-HCl;pH＝8.0;0.1M MgCl2;60mM 2-巯基乙醇;1mg/ml BSA)和6μl H2O中。向该DNA中加入约2μl(～10单位)限制酶AvaⅡ，将所得反应液于37℃下保温2小时。将AvaⅡ消化的DNA加到琼脂糖凝胶上进行电泳，直到～1.4kb限制片段与其它消化产物分离。从凝胶中分离出质粒pTPA103derNdeⅠ的～1.4kb AvaⅡ限制片段，得到约2μg所需片段并悬浮于5μl TE缓冲液中。
在～1.4kb AvaⅡ限制片段溶液中加入约5μl 10X Klenow酶缓冲液、35μl H2O和5μl(～5单位)Klenow酶，将所得反应液于16℃下保温30分钟。用乙醇沉淀经Klenow酶处理的DNA并再悬浮于3μl 10X连接酶缓冲液和14μl H2O中。
基本按实例2的方法，用激酶处理约2μg具有如下顺序的HpaⅠ连接子
将约10μl经激酶处理的连接子加到经Klenow酶处理的质粒pTPA103derNdeⅠ的～1.4kb AvaⅡ限制片段的溶液中，同时加入2μl(～1000单位)T4DNA连接酶和1μl(～1单位)T4RNA连接酶，将所得反应液于16℃下保温过夜。
将连接后的DNA用苯酚萃取一次，用氯仿萃取两次，用乙醇沉淀，并再悬浮于2μl 10X EcoRⅠ缓冲液和16μl H2O中。在该DNA溶液中加入约2μl(～10单位)限制酶EcoRⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。将EcoRⅠ消化的DNA用苯酚萃取一次，用氯仿萃取两次，用乙醇沉淀，并再悬浮于3μl 10X连接酶缓冲液和20μl H2O中。这样制备出的大小约为770bp并编码trpPO和TPA氨基末端的片段，具有一个可与EcoRⅠ相容的末端和一个平末端，将该片段连入EcoRⅠ-SmaⅠ消化的质粒pUC19中就形成质粒pUC19 TPAFE。
将约2μl质粒pUC19(可从Bethesda Research Laboratories得到)溶于2μl 10X SmaⅠ缓冲液(0.2M KCl;60mM Tris-HCl，pH＝8.0;60mM MgCl2;60mM 2-巯基乙醇;1mg/ml BSA)和16μl H2O中。在该DNA溶液中加入约2μl(～10单位)限制酶SmaⅠ，将所得反应液于25℃下保温2小时。用乙醇沉淀SmaⅠ消化的质粒pUC19 DNA，离心收集，再悬浮于2μl 10X EcRⅠ缓冲液和16μl H2O中。在SmaⅠ消化的质粒pUC19 DNA溶液中加入约2μl(～10单位)限制酶EcoRⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。将EcoRⅠ-SmaⅠ消化的质粒pUC19DNA用苯酚萃取一次，用氯仿萃取两次，再悬浮于5μlTE缓冲液中。
将EcoRⅠ-SmaⅠ消化的质粒pUC19 DNA加到含有～770bp EcoRⅠ平末端限制片段的溶液中，此片段得自质粒pTPA103derNdeⅠ。在该DNA混合物中加入约2μl(～1000单位)T4DNA连接酶，将所得反应液于16℃下保温过夜。连接后的DNA就构成了所需的质粒pUC19TPAFE。质粒pUC19TPAFE的限制位点和功能图谱示于附图9。
质粒pUC19的多克隆位点含有在质粒pUC19TPAFE的构建中所利用的EcoRⅠ和SmaⅠ识别顺序，这个多克隆位点位于lacZα片段编码顺序内。lacZα片段在含有lacZ△M15突变(编码β-半乳糖苷酶膌acZ基因的突变)的细胞中的表达，使这些细胞能表达一种功能性β-半乳糖苷酶分子，因此使这些细胞能将X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，一种无色化合物)水解为靛蓝色水解产物。将DNA插入质粒pUC19的多克隆位点，破坏了lacZα片段的编码顺序，因此，带有lacZ△M15突变但寄留这样一种质粒的细胞不能水解X-Gal。连接后的DNA构成质粒pUC19TPAFE。基本按实例3的方法，使大肠杆菌K12RR1△M15(NRRLB-15440)细胞成为转化感受态，并用连接后的DNA转化这些细胞。
将转化细胞涂布在含100μg/ml氨苄青霉素、40μg/mlX-Gal和1mMIPTG的L-琼脂上。对那些未显示出靛蓝色的菌落进行传代培养，并用来制备质粒DNA。利用质粒DNA的限制酶分析鉴定大肠杆菌K12RR1△M15/pUC19TPAFE转化体。基本按实例1的方法，从大肠杆菌K12RR1△M15/pUC19TPAFE细胞中分离出质粒pUC19TPAFEDNA，用于后续的构建中。
将20μl TE缓冲液中的约7μg质粒pUC19TPAFE加到10μl 10X HpaⅠ缓冲液(0.2M KCl;0.1M Tris-HCl，pH＝7.4;0.1M MgCl2)和70μl H2O中。在质粒pUC19TPAFE DNA溶液中加入约3μl(～6单位)限制酶HpaⅠ，将所得反应液于37℃下保温20分钟，安排较短的反应时间是为了生成HpaⅠ部分消化产物。将反应液调整至150μl 1X BamHⅠ缓冲液(150mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH＝8.0;10mM MgCl;提高盐浓度使HpaⅠ失活)。在经HpaⅠ部分消化的DNA溶液中加入约1μl(～16单位)限制酶BamHⅠ，将所得反应于37℃下保温90分钟。
用乙醇沉淀法浓缩经BamHⅠ-HpaⅠ部分消化的质粒pUC19TPAFEDNA，将其加到1.5%琼脂糖凝胶上，从凝胶中分离出一个～3.42kbHpaⅠ-BamHⅠ限制片段，该片段含有质粒pUCATPAFE的复制子、β-内酰胺酶基因和所有TPA编码DNA。切下含有所需片段的胶条，冰冻该胶条，然后从胶条中挤出液体。用乙醇沉淀法从该液体中沉淀出DNA。得到约1μg所需片段并将其悬浮于20μlTE缓冲液中。
将10μl TE缓冲液中的约10μg质粒pTPA103溶解于10μl 10X ScaⅠ缓冲液(1.0M NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.4;60mM MgCl2;10mM DTT;1mg/ml BSA)和80μl H2O中。在质粒pTPA103 DNA溶液中加入约3μl(～18单位)限制酶ScaⅠ，将所得反应液于37℃下保温90分钟。将反应液的体积调整到150μl 1X BamHⅠ缓冲液，向该混合液中加入约1μl(～16单位)限制酶BamHⅠ，然后于37℃下保温90分钟。用乙醇沉淀DNA，离心收集，并再悬浮以准备用于电泳。将ScaⅠ-BamHⅠ消化的质粒pTPA103DNA加到1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，直到～1.015kbScaⅠ-BamHⅠ限制片段与其它消化产物分离。从凝胶中分离出～1.015ScaⅠ-BamHⅠ限制片段，该片段含有质粒pTPA103的TPA羧基末端编码DNA。得到约0.5μg所需片段并溶解于20μl玻璃蒸馏水中。
在2μl质粒pTPA103的～1.015kb ScaⅠ-BamHⅠ限制片段中加入约2μl质粒pUC19TPAFE的～3.42kb BamHⅠ-HpaⅠ限制片段，同时加入2μl 10X连接酶缓冲液和1μl(～1 Weiss单位;该连接酶得自Promega Biotec，28OOS.Fish Hatchery Road，Madison，WI53711)T4DNA连接酶，将所得反应液于16℃下保温过夜。连接后的DNA构成所需质粒pBW25。质粒pBW25的限制位点和功能图谱示于附图9。
基本按实例3的方法，使大肠杆菌K12 JM105(可从BRL得到)成为转化感受态，并用连接后的DNA进行转化，但在此操作中使用50mM CaCl2。将转化细胞涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的BHI上(Difco Laboratories，Detroit，MI)，利用质粒DNA的限制酶分析鉴定出大肠杆菌K12 JM105/pBW25转化体。用限制酶EcoRⅠ消化质粒pBW25生成～3.38kb和～1.08kb限制片段。基本按实例1的方法制备质粒pBW25用于后续的构建中。
C.TPA编码区的位点特异性诱变和质粒pBW28的构建将10μl玻璃蒸馏水中的约5μg质粒pBW25加到约10μl 10X HindⅢ反应缓冲液和80μl H2O中。在质粒pBW25 DNA溶液中加入约1μl(～20单位)限制酶HindⅢ，将所得反应液于37℃下保温90分钟。在HindⅢ消化的质粒pBW25DNA溶液中加入约3μl(～24单位)限制酶EcoRⅠ和10μl1MTris·HCl，pH＝7.6，将所得反应液于37℃下保温90分钟。用乙醇沉淀法浓缩EcoRⅠ-HindⅢ消化的质粒pBW25DNA，将其加到1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，直到～810bpEcoRⅠ-HindⅢ限制片段与其它消化产物分离。从凝胶中分离出约0.5μg～810bpEcoRⅠ-HindⅢ限制片段，准备用于连接，并再悬浮于20μl玻璃蒸馏水中。
将35μl玻璃蒸馏水中的约4.5μg复制型(RF)M13mp8DNA(可从New England Biolabs得到)加到10μl 10X HindⅢ缓冲液和55μl H2O中。向M13mp8 DNA溶液中加入约1μl(～20单位)限制酶HindⅢ，将所得反应液于37℃下保温1小时。向HindⅢ消化的M13mp8 DNA溶液中加入约3μl(～24单位)限制酶EcoRⅠ和约10μl 1M Tris·HCl，pH＝7.6，将所得反应液于37℃下保温1小时。用乙醇沉淀法收集HindⅢ-EcoRⅠ消化的M13mp8 DNA，再悬浮以准备用于琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶电泳分离大限制片段。得到约1μg M13mp8的大EcoRⅠ-HindⅢ限制片段并悬浮于20μl玻璃蒸馏水中。向3μl质粒pBW25的～810bp EcoRⅠ-HindⅢ限制片段中加入约2μl M13mp8的大EcoRⅠ-HindⅢ限制片段、2μl 10X连接酶缓冲液、12μl H2O和～1μl(～1 Weiss单位)T4DNA连接酶，将所得连接反应液于16℃下保温过夜。
基本按BRLM13Cloning/‘Dideoxy’SeguencingInstructionManual所述方法，使大肠杆菌JM103细胞(可从BRL得到)成为感受态，并用连接混合物转染，但每次转染所用的DNA的量不同。由β-半乳糖苷酶α-片段编码基因的插入失活鉴定出重组噬菌斑，该基因的失活导致将X-gal水解成靛蓝色水解产物的能力丧失。为进行筛选，将6个白色噬菌斑挑入2.5mlL液体培养基，向基中加入0.4ml大肠杆菌K12JM103，在基本培养基原液中进行培养，以确保在对数生长期保留携有proAB的下附加体。将含有噬菌斑的溶液于37℃下在空气摇床中保温8小时。基本按碱性微筛选法(BirnboimandDoly，Nuc.AcidsRes.7∶1513，1979)沉降若干1.5ml等份试样的细胞并分离出RFDNA。每个培养的其余部分贮存于4℃下作为原种。所需的噬菌体定名为pM8BW26它含有与M13mp8的～7.2kbEcoRⅠ-HindⅢ限制片段连接的质粒pBW25的～810bpEcoRⅠ-HindⅢ限制片段。
用pM8BW26感染约50ml对数期大肠杆菌JM103，并于37℃下在空气摇床中培养18小时。用低速离心沉降感染细胞，并利用说明书中所给的方法扩大规模而从培养上清液中制备单链pM8BW26DNA。基本按Adelman等人的方法(DNA2(3)∶183-193，1983)诱变单链pM8BW26，但进行Klenow酶反应时，先在室温下进行30分钟，然后在37℃下60分钟，再在10℃下18小时。此外，S1处理在20℃下进行，缓冲液的盐浓度为厂家推荐的一半，采用了M13测序引物(BRL)。用来缺失天然TPA的87至261位氨基酸残基编码顺序的合成寡脱氧核糖核苷酸引物为5′-GGGAAGTGCTGTGAAATATCCACCTGCGGCCTGAGA-3′.
基本按上述感染方法，用所得的诱变混合物转染大肠杆菌K12JM103。利用RFDNA的限制酶分析和Maxam和GilbertDNA测序法鉴定所需的突变体。所需的突变体定名为pM8BW27，它缺失了天然TPA的87至261位氨基酸残基的编码顺序。
为了构建质粒pBW28，需要多种不同的DNA片段。获得其中的第一个片段的方法是将20μl玻璃蒸馏水中的～20μg RF pM8BW27 DNA加到10μl 10X NdeⅠ缓冲液和60μl H2O中。在质粒pM8BW27 DNA的混合物中加入约10μl(～50单位)限制酶NdeⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。用乙醇沉淀NdeⅠ消化的质粒pM8BW27 DNA，离心收集，并再悬浮于10μl 10X EcoRⅠ缓冲液和90μl H2O中。在NdeⅠ消化的质粒pM8BW27 DNA溶液中加入约10μl(～50单位)限制酶EcoRⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。将EcoRⅠ-NdeⅠ消化的质粒pM8BW27 DNA在琼脂糖凝胶上进行电泳，直到～560bp NdeⅠ-EcoRⅠ限制片段与其它消化产物分离。此～560bp片段含有TPA编码顺序中跨越缺失位点的部分。从凝胶中分离出～560bp NdeⅠ-EcoRⅠ限制片段，得到约0.5μg所需片段并悬浮于20μl玻璃蒸馏水中。
构建质粒pBW28所需的第二个片段的合成方法是在DNA自动合成仪上一次合成一条链。基本按实例2的方法，用激酶处理两条互补链，并使其退火而杂交，形成带有XbaⅠ和NdeⅠ重叠的双链DNA片段。该连接子具有下列结构
构建质粒pBW28所需的第三个片段的制备方法是将20μlTE缓冲液中的～20μg质粒pTPA103加到10μl 10X BamHⅠ缓冲液和60μl H2O中。向质粒pTPA103 DNA溶液中加入约10μl(～50单位)限制酶BamHⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。用乙醇沉淀BamHⅠ消化的质粒pTPA103 DNA，离心收集，再悬浮于10μl 10X EcoRⅠ缓冲液和80μl H2O中。向BamHⅠ消化的质粒pTPA103 DNA溶液中加入约10μl(～50单位)限制酶EcoRⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。将BamHⅠ-EcoRⅠ消化的质粒pTPA103 DNA加到琼脂糖凝胶上进行电泳，直到含TPA羧基末端编码顺序的～689bp EcoRⅠ-BamHⅠ限制片段与其它消化产物分离。从凝胶中分离出约0.5μg～689bp片段，然后再悬浮于10μl玻璃蒸馏水中。
构建质粒pBW28所需的最后一个片段从质粒pL110中分离，其构建公开于实例9。将25μl TE缓冲液中的约25μg质粒pL110加到10μl 10X XbaⅠ缓冲液(0.5M NaCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.9;60mM MgCl2;1mg/ml BSA)和55μl H2O中。在质粒pL110 DNA溶液中加入约10μl(～50单位)限制酶XbaⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。用乙醇沉淀经XbaⅠ消化的质粒pL110 DNA，离心收集，再悬浮于10μl 10X BamHⅠ缓冲液和89μl H2O中。在XbaⅠ消化的质粒pL110 DNA溶液中加入约1μl(～5单位)限制酶BamHⅠ，将所得反应液于37℃下保温30分钟，得到BamHⅠ部分消化产物。将经XbaⅠ消化、BamHⅠ部分消化的质粒pL110 DNA加到琼脂糖凝胶上进行电泳，直到～6.0kb XbaⅠ-BamHⅠ片段明显与其它消化产物分离。从凝胶中分离出～6.0kb限制片段，得到约0.5μg～6.0kb XbaⅠ-BamHⅠ限制片段并悬浮于约40μl玻璃蒸馏水中。此～6.0kbXbaⅠ-BamHⅠ限制片段含有除EK-BGH以外的所有质粒pL110。
为构建质粒pBW28，将下列片段混合在一起约0.1μg(～8μl)质粒pL110的～6.0kb BamHⅠ-XbaⅠ限制片段;约0.05μg(～2μl)质粒pM8BW27的～560bp NdeⅠ-EcoRⅠ限制片段;约0.1μg(～2μl)质粒pTPA103的～689bp EcoRⅠ-BamHⅠ限制片段;约0.02μg(～1μl)～45bp XbaⅠ-NdeⅠ合成连接子。在该DNA混合物中加入约2μl 10X连接酶缓冲液和1μl(～1 Weiss单位)T4DNA连接酶，将所得的连接反应液于4℃下保温过夜。连接后的DNA构成所需质粒pBW28。质粒pBW28的限制位点和功能图谱示于附图10。
基本按实例3的方法，用连接后的DNA来转化已成为感受态的大肠杆菌K12 MM294(NRRL B-15625)，但在操作中使用50mM CaCl2。由于质粒pBW28上有λpL启动子和编码温度敏感性λpL阻遏物的基因，所以转化方法和转化体的培养有所不同。在转化和后续的培养过程中，没有将细胞置于高于32℃的温度下。利用四环素抗性、氨苄青霉素敏感性表型及质粒DNA的限制酶分析，鉴定出所需的大肠杆菌K12 MM294/pBW28转化体。
D.质粒pBW32的最后构建将约10μl质粒pSV2-β-球蛋白DNA(NRRL B-15928)溶解于10μl 10X HindⅢ反应缓冲液、5μl(～50单位)限制酶HindⅢ和85μl H2O中，将该反应液于37℃下放置2小时。然后在该反应混合液中加入LiC1至浓度为0.15M，加入2.5倍体积乙醇并在干冰-乙醇浴中保温后，离心沉降DNA。
将DNA沉淀溶解于10μl 10X BglⅡ缓冲液、5μl(～50单位)限制酶BglⅡ和85μl H2O中，将该反应液于37℃下放置2小时。BglⅡ消化后，将反应混合液加到0.85%琼脂糖凝胶上，电泳分离各片段。如前所述，利用溴化乙锭和紫外光观察凝胶，从凝胶上切下含所需～4.2kb HindⅢ-BglⅡ片段的条带。将沉淀再悬浮于10μl H2O中，就构成了～5μg所需的质粒pSV2-β-球蛋白的～4.2kb HindⅢ-BglⅡ限制片段。基本按前述方法，从质粒pTPA103中分离出编码TPA的质粒pTPA103的～2.0kb HindⅢ-BamHⅠ限制片段。得到约5μg质粒pTPA103的～2.0kb HindⅢ-BamHⅠ限制片段，悬浮于10μl H2O中，于-20℃下贮存。
将2μl质粒pSV2-β-球蛋白的～4.2kb BglⅡ-HindⅢ限制片段和4μl质粒pTPA103的～2.0kb HindⅢ-BamHⅠ片段混合在一起，然后加2μl 10X连接酶缓冲液、11μl H2O和1μl T4DNA连接酶(～500单位)于4℃下保温过夜。连接后的DNA构成了所需质粒pTPA301。基本按实例3的方法，用连接后的DNA转化已成为转化感受态的大肠杆菌K12 RR1细胞(NRRL B-15210)。基本按实例1的方法，从大肠杆菌K12 RR1/pTPA301转化体中得到质粒DNA。质粒pTPA301的限制位点和功能图谱示于附图10。
质粒pSV2-dhfr含有一个二氢叶酸还原酶(dhfr)基因，该基因可用于真核转化细胞的选择和与dhfr基因共价相连的DNA的扩增。将10μg质粒pSV2-dhfr(分离自大肠杆菌K12 HB101/pSV2-dhfr，ATCC 37146)与10μl 10X PvuⅡ缓冲液、2μl(～20单位)PvuⅡ限制酶和88μl H2O混合，将所得反应液于37℃下保温2小时。利用苯酚和氯仿萃取终止反应，然后沉淀并离心收集PvuⅡ消化的质粒pSV2-dhfrDNA。
利用下列方法用激酶处理BamHⅠ连接子(5′-CGGATCCCG-3′)并准备用于连接。向5μl H2O中的1μg连接子中加入10μl 5X激酶盐溶液(300mM Tris-HCl，pH＝7.8;50mM MgCl2;25mM DTT)、5μl 5mM ATP、5μl BSA(1mg/ml)、5μl 10mM亚精胺、19μl H2O、1μl多核苷酸激酶(10单位/μl)。然后将此反应液于37℃下保温60分钟，于-20℃下贮存。将5μl(～5μg)PvuⅡ消化的质粒pSV2-dhfr和12μl(～0.25μg)经激酶处理的BamHⅠ连接子混合，加11μl H2O、2μl 10X连接酶缓冲液和1μl(～1000单位)T4DNA连接酶于16℃下保温过夜。
向连接反应混合液中加入10μl 10X BamHⅠ反应缓冲液、10μl(～50单位)BamHⅠ限制酶和48μl H2O，然后在37℃下保温3小时。将反应液加到1%琼脂糖凝胶上，从凝胶中分离出含dhfr基因的所需～1.9kb片段。这些实例中加入的所有连接子都在琼脂糖凝胶上进行常规纯化以减少在最终载体中有多个连接子顺序的可能性。将得到的～3μg片段悬浮于10μl TE缓冲液中。
接着，如上所述用BamHⅠ限制片段消化约15μl(～1μg)质粒pTPA301。因为质粒pTPA301中有一个独特的BamHⅠ位点，所以这一步BamHⅠ消化产生线性的质粒pTPA301 DNA。用乙醇沉淀BamHⅠ消化的质粒pTPA301，再悬浮于94μl H2O中，于65℃下用1μl小牛肠碱性磷酸酯酶(Collaborative Research，Inc.，128 Spring Street，Lexington，MA 02173)和5μl 1M Tris-HCl，pH＝9.0处理45分钟。将DNA用苯酚∶氯仿萃取，然后用氯仿∶异戊醇萃取，用乙醇沉淀，再悬浮于20μl限制片段和约5μl经Eco
Ⅰ单切割的质粒pLPChyg1 DNA混合在一起，向该DNA混合物中加入1μl 10X连接酶缓冲液、5μl H2O、1μl(～500单位)T4DNA连接酶、1μl(～2单位)T4DNA连接酶，将所得反应液于16℃下保温过夜。连接后的DNA构成所需的质粒pLPChd1和pLPChd2，它们的区别仅在于含dhfr基因的～1.9kb片段的取向不同。
基本按实例3的方法，用连接后的DNA转化已成为转化感受态的大肠杆菌K12HB101细胞。将转化细胞涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的L琼脂上，通过质粒DNA的限制酶分析来分析氨苄青霉素抗性转化体，从而鉴定出大肠杆菌K12HB101/pLPChd1和大肠杆菌K12HB101/pLPChd2转化体。为本公开的目的，将质粒pLPChd1定名为质粒pLPChd。质粒pLPChd的限制位点和功能图谱示于附图11。基本按实例1的方法，从适当的转化体中分离出质粒pLPChd1和质粒pLPChd2DNA。
实例18质粒phd的构建为了构建质粒phd，需要从缺乏腺嘌呤甲基化酶的大肠杆菌宿主细胞中制备质粒pLPChd1DNA，而将其用作构建质粒phd的原料。上述甲基化酶的例子有由dam基因编码的腺嘌呤甲基化酶，该基因的产物使顺序5′-GATC-3渲械南汆堰什谢谆４蟪Ω司鶮12GM48(NRRLB-15725)缺乏功能性dam甲基化酶，因而是用于制备质粒pLPChd1DNA目的合适宿主，所制备出的DNA可用作构建质粒phd的原料。
基本按实例3的方法培养大肠杆菌K12GM48细胞并使其成为分离出～1.7kb片段并准备用于连接。
质粒pBW28的～680bp XhoⅡ(可与BglⅡ重叠顺序连接)-SstⅠ限制片段含有修饰的TPA的氨基末端编码区。为分离此片段，用XhoⅡ酶在1X XhoⅡ缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH＝8.0;0.1M MgCl2;0.1%曲拉通X-100;1mg/ml BSA)中将约10μg质粒pBW28消化至完全。用乙醇沉淀法回收XhoⅡ消化的DNA，随后用SstⅠ酶消化至完全。将XhoⅡ-SstⅠ消化的DNA加到聚丙烯酰胺凝胶上，从凝胶中分离出所需片段并准备用于连接。
将各约0.1μg的上述片段连接在一起形成质粒pBW32，这些片段为质粒pTPA301的～2.7kb EcoRⅠ-BglⅡ限制片段;质粒pTPA303的～2.34kb EcoRⅠ-HindⅢ限制片段;质粒pTPA303的～1.7kb SstⅠ-HindⅢ限制片段;质粒pBW28的～0.68kb SstⅠ-XhoⅡ限制片段。如实例3所述，用连接混合物转化大肠杆菌K12 MM294，但在操作中使用50mM CaCl2。利用氨苄青霉素抗性表型和质粒DNA的限制分析鉴定转化体。基本按实例1的方法，从大肠杆菌K12 MM294/pBW32转化体中得到质粒pBW32 DNA。质粒pBW32的限制位点和功能图谱示于附图10。
实例17质粒pLPChd1和pLPChd2的构建将20μl TE缓冲液中的约20μg质粒pBW32加到10μl 10X BamHⅠ缓冲液和60μl H2O中。向质粒pBW32 DNA溶液中加入约10μl(～50单位)限制酶BamHⅠ，将所得反应液于37℃下保温2小时。用乙醇沉淀BamHⅠ消化的质粒pBW32 DNA，离心收集，H2O中。将10μl(～0.25μg)经磷酸酯酶处理的质粒pTPA301加到5μl含dhfr基因的BamHⅠ限制片段(～1.5μg)、3μl 10X连接酶缓冲液、3μl(～1500单位)T4DNA连接酶、9μl H2O中。将此连接反应液于15℃下保温过夜。连接后的DNA构成所需的质粒pTPA303 DNA。
用质粒pTPA303转化大肠杆菌K12RR1(NRRLB-15210)，利用氨苄青霉素抗性表型和质粒DNA的限制酶分析鉴定出所得到的大肠杆菌K12RR1/pTPA303转化体。基本按实例1的方法，从这些转化体中分离出质粒pTPA303。质粒pTPA303的限制位点和功能图谱示于附图10。
为从质粒pTPA301中分离出编码pBR322复制子和β-内酰胺酶基因的～2.7kbEcoRⅠ-BglⅡ限制片段，在37℃下用20单位BglⅡ限制酶在1XBglⅡ缓冲液中将约10μg质粒pTPA301消化至完全，反应液总体积为400μl。BglⅡ消化后，将Tris-HCl浓度调整到110mM，向BglⅡ消化的DNA中加入20单位EcoRⅠ限制酶。使该反应液在37℃下保温2小时。将EcoRⅠ-BglⅡ消化的DNA加到琼脂糖凝胶上进行电泳，直到～2.7kbEcoRⅠ-BglⅡ限制片段与其它消化产物分离，然后分离出～2.7kb片段并准备用于连接。
为了分离含dhfr基因的限制片段，用HindⅢ和EcoRⅠ限制酶双重消化质粒pTPA303，分离并回收含dhfr基因的～2340bpEcoRⅠ-HindⅢ限制片段。
质粒pTPA303的～2kbHindⅢ-SstⅠ限制片段含有TPA羧基末端编码区和SV40启动子。为分离此片段，用HindⅢ和SstⅠ限制酶在1XHindⅢ缓冲液中双重消化质粒pTPA303。从凝胶中再悬浮于5μl 10X Klenow酶缓冲液、45μl H2O和2μl(～100单位)Klenow酶中。将该反应液于16℃下保温30分钟，然后将反应混合液加到琼脂糖凝胶上进行电泳，直到各消化产物明显分离开。基本按实例12A的方法从凝胶中分离出～1.9kb Klenow酶处理的BamHⅠ限制片段并准备用于连接。此～1.9kb片段为质粒pBW32的含dhfr基因的片段。得到约4μg所需片段并悬浮于5μl TE缓冲液中。
将100μl TE缓冲液中的约200μg质粒pLPChyg1加到15μl 10X EcoRⅠ缓冲液和30μl H2O中。在质粒pLPChyg1 DNA溶液中加入约5μl(～50单位)限制酶EcoRⅠ，将所得反应液于37℃下保温10分钟。安排较短的反应时间是为了产生EcoRⅠ部分消化。质粒pLPChyg1有两个EcoRⅠ限制位点，其中之一位于潮霉素抗性(HmR)基因编码顺序内，因此需要将含dhfr基因的限制片段插入到质粒pLPChyg1的不在HmR基因内的EcoRⅠ位点中。将EcoRⅠ部分消化的质粒pLPChyg1 DNA加到琼脂糖凝胶上进行电泳，直到单切割的质粒pLPChyg1 DNA与未切割的质粒DNA和其它消化产物分离。基本按实例12A的方法，从凝胶中分离出被单切割的DNA，并准备用于连接。得到约2μg EcoRⅠ单切割的质粒pLPChyg1，并悬浮于25μl TE缓冲液中。向此样品中加入约5μl(～25单位)Klenow酶、5μl 10X Klenow酶缓冲液和40μl H2O，将所得反应液于16℃下保温60分钟。将Klenow酶处理的、EcoRⅠ部分消化的DNA用苯酚萃取两次，然后用氯仿萃取一次，用乙醇沉淀，再悬浮于25μl TE缓冲液中。
将约5μl质粒pBW32的～1.9kbKlenow酶处理的BamHⅠ转化感受态，用质粒pLPChyg1转化大肠杆菌K12GM48细胞。基本按实例1的方法，将转化细胞涂布在含氨苄青霉素的L琼脂上，待氨苄青霉素抗性大肠杆菌K12GM48/pLPChd1转化体形成菌落后，用一个这样的菌落来制备质粒pLPChd1DNA。得到约1mg质粒pLPChd1DNA并悬浮于约1mlTE缓冲液中。
将2μl TE缓冲液中的约2μg质粒pLPChd1 DNA加到2μl 10X BclⅠ缓冲液(750mM KCl;60mM Tris-HCl，pH＝7.4;100mM MgCl2;10mM DTT;1mg/ml BSA)和14μl H2O中。在质粒pLPChd1 DNA溶液中加入约2μl(～10单位)限制酶BclⅠ，将所得反应液于50℃下保温2小时。将该混合液用苯酚萃取一次，用氯仿萃取两次，从而停止反应。
将约1μl BclⅠ消化的质粒pLPChd1 DNA加到1μl 10X连接酶缓冲液、8μl H2O和1μl(～500单位)T4DNA连接酶中。将连接反应液于16℃下保温过夜，连接后的DNA构成所需质粒phd。质粒phd是由质粒pLPChd1的缺失而产生的，所缺失的是在质粒pLPcat构建过程中连上的多余BclⅠ连接子和两个相邻的大小共约1.45kb的BclⅠ限制片段。质粒phd的限制位点和功能图谱示于附图11。质粒phd可促进来自本发明的BK病毒增强子-腺病毒晚期启动子的任何DNA顺序的表达，因为所要表达的DNA易于以正确的位置插插入质粒phd的单一BclⅠ位点而进行表达。
基本按实例3的方法，用连接后的DNA转化大肠杆菌K12GM48。将转化细胞涂布在含氨苄青霉素的L琼脂上，利用其质粒DNA的限制酶分析鉴定出氨苄青霉素抗性的大肠杆菌K12GM48/phd转化体。
实例19质粒pL-KSL的构建质粒pGKC2310含有编码鼠类单克隆抗体KS1/4轻链的完整全长cDNA。可从NRRL得到大肠杆菌K12MM294/pGKC2310，登记号为NRRLB-18356。质粒pGKC2310的限制位点和功能图谱示于附图12。基本按实例1的方法，从培养物中萃取质粒DNA，但保温温度为37℃。
基本按实例8的方法，用限制酶EcoRⅠ消化约5μg质粒pGKC2310，然后基本按实例5的方法用Klenow酶处理。接着，基本按实例2的方法，向这些DNA片段中加入BamHⅠ连接子(购自NewEnglandBiolabs)。最后，基本按实例12的方法，将该DNA用琼脂糖凝胶进行电泳并进行纯化。用乙醇沉淀出所需的～1.1kb片段并再悬浮于5μlTE中。
基本按实例18的方法，用限制酶BclⅠ消化约1μg质粒phd，然后基本按实例12的方法进行电泳和纯化。然后基本按实例2的方法，将质粒pGKC2310的～1.1kb经EcoRⅠ消化、Klenow酶处理、连接子修饰的DNA片段连入经BclⅠ消化的质粒phd中。然后基本按实例3的方法，将此连接混合物转化入大肠杆菌细胞中。然后基本按实例1的方法从细胞中分离质粒，含有正确取向的质粒定名为质粒pL-KSL。
实例20质粒pH-KS的构建质粒pG2A52含有编码鼠类单克隆抗体KS1/4重链的完整全长cDNA。可从NRRL得到大肠杆菌K12MM294/pG2A52，登记号为NRRLB-18357。质粒pG2A52的限制位点和功能图谱示于附图12。基本按实例1的方法从培养物中萃取质粒DNA，但保温温度为37℃。
基本按实例8的方法，用限制酶EcoRⅠ消化约5μg质粒pG2A52，然后基本按实例5的方法用Klenow酶处理。接着，基本按实例2的方法，向这些DNA片段中加入BamHⅠ连接子(购自NewEnglandBiolabs)。最后，基本按实例12的方法，将该DNA用琼脂糖凝胶进行电泳并进行纯化。用乙醇沉淀所需的～1.6kb片段并再悬浮于5μlTE中。
基本按实例18的方法，用限制酶BclⅠ消化约1μg质粒phd，然后基本按实例12的方法进行电泳和纯化。然后基本按实例2的方法，将质粒pG2A52的～1.6kb经EcoRⅠ消化、Klenow酶处理、连接子修饰的DNA片段连入BclⅠ消化的质粒phd中。然后基本按实例3的方法，将此连接混合物转化入大肠杆菌细胞。然后基本按实例1的方法，从细胞中分离质粒，含有正确取向的质粒定名为质粒pH-KS。
实例21质粒pL-HD的构建质粒pCHKC2-18含有一个编码鼠类单克隆抗体KS1/4轻链可变区的cDNA片段，该片段与一个编码人轻链恒定区的基因组DNA片段相连。由质粒pCHKC2-18编码的可变区与天然存在的单克隆抗体KS1/4可变区相比含有单个氨基酸的改变。野生型可变区的羧基末端氨基酸为精氨酸残基，而在由质粒pCHKC2-18编码的蛋白中，该残基为甘氨酸残基。可从NRRL得到大肠杆菌K12DH5/pCHK2-18，登记号为NRRLB-18359。质粒pCHKC2-18的限制位点和功能图谱示于附图13。基本按实例1的方法，从培养物中萃取质粒DNA，但保温温度为37℃。
基本按实例8的方法，消化约5mg质粒pCHKC2-18，但使用限制酶FnuDⅡ和10X FnuDⅡ缓冲液(60mM NaCl，60mM Tris-HCl(pH7.4)和60mM MgCl2)。接着，基本按实例12的方法，用限制酶HindⅢ和10X HindⅢ缓冲液(500mM NaCl，500mM Tris-HCl(pH8.0)和100mM MgCl2)消化DNA，然后从琼脂糖凝胶中分离出～1.3kb FnuDⅡ-HindⅢ片段。用乙醇沉淀并再悬浮后，基本按实例5的方法，用Klenow酶填平HindⅢ位点的5′伸出顺序。
此外，基本按实例5的方法，用Klenow酶处理约0.5μgBclⅠ消化的质粒phd(在实例20中分离)。然后基本按实例2的方法，将质粒pCHKC2-18连入质粒phd的经BclⅠ切割并填平的载体片段中。然后基本按实例3的方法，将此连接混合物转化入大肠杆菌细胞中。然后基本按实例1的方法，从细胞中分离质粒，含有正确取向的质粒(由一个～840bpMaeⅡ-StuⅠ片段证实)定名为质粒pL-HD。
实例22质粒pL-HD2的构建质粒pCHKC2-6含有一个编码单克隆抗体KS1/4轻链可变区的cDNA片段，该片段与一个编码人轻链恒定区的基因组DNA片段相连。由质粒pCHKC2-6编码的可变区含有与天然存在的单克隆KS1/4可变区相同的氨基酸残基顺序。但是，在质粒pCHKC2-6中，编码羧基末端精氨酸残基的DNA含有一个CGT密码子，而在天然顺序中是CGG密码子。可从NRRL得到大肠杆菌K12DH5/pCHKC2-6，登记号为NRRLB-18358。质粒pCHKC2-6的限制位点和功能图谱示于附图13。
基本按实例1的方法，从培养物中提取DNA，但保温温度为37℃。然后基本按实例21的方法，用限制酶FnuDⅡ和HindⅢ消化质粒pCHKC2-6，用Klenow酶处理，然后连入经BclⅠ切割并填平的质粒phd中。然后基本按实例21的方法，将所得质粒转化入大肠杆菌，提取质粒DNA并进行限制酶图谱分析。具有正确的～840bpMaeⅡ-StuⅠ片段的质粒定名为质粒pL-HD2。
实例23质粒pH1-HD的构建质粒pCH2A5含有一个编码鼠类单克隆抗体KS1/4重链可变区的cDNA片段，该片段与一个编码人免疫球蛋白IgGl重链恒定区的基因组DNA片段相连。可从NRRL得到大肠杆菌K12MM294/pCH2A5，登记号为NRRLB-18360。质粒pCH2A5的限制位点和功能图谱示于附图14。基本按实例1的方法，从培养物中提取质粒DNA，但保温温度为37℃。
基本按实例5的方法，用限制酶EcoRⅠ切割约10μg质粒pCH2A5。然后基本按实例2的方法，用Klenow酶处理DNA，然后加入BamHⅠ连接子(购自NewEnglandBiolabs)，基本按实例5的方法，用限制酶BamHⅠ消化DNA。然后基本按实例12的方法，从琼脂糖凝胶中分离～7.4kbBamHⅠ-EcoRⅠ/BamHⅠ限制片段。然后基本按实例2的方法，对此片段连入经BclⅠ消化的phd载体(实例20)中。然后将该DNA转化入大肠杆菌中。再分离该DNA，将具有正确取向(由一个～780bpMaeⅢ-StuⅠ片段证实)的质粒定名为质粒pH1-HD。
实例24质粒pH2-HD的构建质粒pCH2A5IG2含有一个编码鼠类单克隆抗体KS1/4重链可变区的cDNA片段，该片段与一个编码人免疫球蛋白IgG2重链恒定区的基因组DNA片段相连。可从NRRL得到大肠杆菌K12DH5/pCH2A5IG2，登记号为NRRLB-18361。质粒pCH2A5IG2的限制位点和功能图谱示于附图14。基本按实例1的方法，从培养物中提取质粒DNA，但保温温度为37℃。
基本按实例5的方法，用限制酶EcoRⅠ切割约10μg质粒pCH2A5IG2。基本按实例2的方法，用Klenow酶处理DNA，然后加入BamHⅠ连接子，基本按实例5的方法，用限制酶BamHⅠ消化DNA。然后基本按实例12的方法，从琼脂糖凝胶中分离出～6.1kbBamHⅠ-EcoRⅠ/BamHⅠ限制片段。然后基本按实例2的方法，将此片段连入BclⅠ消化的phd载体(实例20)。然后将该DNA转化入大肠杆菌中，并再分离DNA，具有正确取向的质粒(由一个～780bpMaeⅢ-StuⅠ片段证实)定名为质粒pH2-HD。
实例25质粒pH3-HD的构建质粒pCH2A5IG3含有一个编码鼠类单克隆抗体KS1/4重链可变区的cDNA片段，该片段与一个编码人免疫球蛋白IgGl重链恒定区的基因组DNA片段相连。可从NRRL得到大肠杆菌K12DH5/pCH2A5IG3，登记号为NRRLB-18362。质粒pCH2A5IG3的限制位点和功能图谱示于附图15。基本按实例1的方法，从培养物中提取质粒DNA，但保温温度为37℃。
基本按实例5的方法，用限制酶EcoRⅠ切割约10μg质粒pCH2A5IG3。基本按实例2的方法，用Klenow酶处理DNA，然后加入BamHⅠ连接子(购自NewEnglandBiolabs)，基本按实例5的方法用限制酶BamHⅠ消化该DNA。然后基本按实例12的方法，从琼脂糖凝胶中分离出～7.4kbBamHⅠ-EcoRⅠ/BamHⅠ限制片段。然后基本按实例2的方法，将此片段连入BclⅠ消化的phd载体(实例20)。然后将此DNA转化入大肠杆菌并再分离，具有正确取向的质粒(由～780bpMaeⅢ-StuⅠ片段证实)定名为质粒pH3-HD。
实例26质粒pH4-HD的构建质粒pCH2A5IG4含有一个编码鼠类单克隆抗体KS1/4重链可变区的cDNA片段，该片段与一个编码人免疫球蛋白IgG4重链恒定区的基因组DNA片段相连。可从NRRL得到大肠杆菌K12DH5/pCH2A5IG4，登记号为NRRLB-18363。质粒pCH2A5IG4的限制位点和功能图谱示于附图15。基本按实例1的方法，从培养物中提取质粒DNA，但保温温度为37℃。
基本按实例5的方法，用限制酶EcoRⅠ切割约10μg质粒pCH2A5IG4。基本按实例2的方法，用Klenow酶处理DNA，然后加入BanHⅠ连接子(购自NewEnglandBiolabs)，基本按实例5的方法用限制酶BamHⅠ消化DNA。然后基本按实例2的方法分离～6.1kbBamHⅠ-EcoRⅠ/BamHⅠ限制片段。然后将该DNA转化入大肠杆菌中并再分离，具有正确取向的质粒(由一个～780bpMaeⅢ-StuⅠ片段证实)定名为质粒pH4-HD。
实例27表达载体的真核宿主细胞转化体的构建本发明的表达载体含有1987年12月4日提交的美国专利申请07/129，028所述的BK增强子，上述申请(代理律师案号为X-6606A)的公开内容列为本文参考文献。BK增强子刺激ElA基因产物存在下的基因表达。因为293细胞组成性地表达ElA基因产物，所以293细胞是本发明真核表达载体的有效宿主。293细胞是用5型腺病毒转化的人胚肾细胞(注意任何特定类型的腺病毒都可用来在本发明方法中供给ElA基因产物)，该细胞可从ATCC得到，登记号为CRL1573。但是，本发明的表达载体即使在不存在ElA基因产物时也能在多种宿主细胞中行使功能。此外，可将ElA基因产物引入不产生ElA的细胞系，引入的方法既可以是用含有ElA基因的载体或经切割的腺病毒DNA进行转化，也可以是用腺病毒感染。
下述转化方法以293细胞为宿主细胞系，但该方法普遍适用于多数真核细胞系。293细胞得自ATCC，登记号为CRL1573，所得细胞为含有约5.5×106细胞的汇合单层的25mM2培养瓶，培养基为加有10%热失活马血清的基本必需培养基。将该培养瓶在37℃下培养，每周换两次培养基。用下列方法对细胞进行传代培养移去培养基，用Hank氏平衡盐溶液(Gibco)冲洗，加入0.25%胰蛋白酶作用1-2分钟，用新鲜培养基冲洗，吸出细胞，以1∶5或1∶10的转种比分装到若干新培养瓶中。
在转化的前一天，以每培养皿0.7×106个细胞接种细胞。在转化前4小时换培养基。用溶于TE缓冲液中的无菌乙醇沉淀质粒DNA来制备含40μg/ml DNA和250mM CaCl2的2X DNA-CaCl2溶液。制备含280mM NaCl、50mM HePes和1.5mM磷酸钠的2X HBS，调pH至7.05-7.15。将2XDNA-CaCl2溶液滴加到等体积的无菌2X HBS中。将一支带棉花塞的1ml无菌塑料吸管插到含2X HBS的混合管中，在加入DNA时吹入气泡。在室温下静置30-45分钟使之形成磷酸钙-DNA沉淀。
然后用一支塑料吸管小心抽吸混合沉淀，将1ml(每平板)沉淀直接加到10ml覆盖受体细胞的生长培养基中。于37℃下培养4小时后，将培养基换成加有10%胎牛血清的DMEM，使细胞再培养72小时，然后提供选择压。对于不含可在真核细胞中起作用的可选择标记的质粒，转化方法是利用了下列质粒的混合物一个缺乏可选择标记的表达载体;一个含有可在真核细胞中起作用的可选择标记的表达载体。借助此共转化技术，能够鉴定出同时含这两种转化质粒的细胞。
对于用含潮霉素抗性基因的质粒转染的细胞，向生长培养基中加入潮霉素至终浓度为约200至400μg/ml。然后将细胞于37℃下培养2-4周，每隔3-4天换一次培养基。将所得的潮霉素抗性菌落转移到各培养瓶中进行定性。基本按潮霉素抗性细胞选择法进行新霉素(也可用G418代替新霉素)抗性菌落的选择，只是加入新霉素而不是潮霉素至终浓度为400μg/ml。293细胞为dhfr阳性，所以不能仅靠dhfr阳性表型(在缺乏次黄嘌呤和胸腺嘧啶的培养基中生长的能力)来选择含有含dhfr基因质粒的293转化体。缺乏功能性dhfr基因并用含dhfr质粒转化的细胞系，可以根据dhfr+表型来选择。
利用二氢叶酸还原酶(dhfr)基因作可选择标记而将基因或质粒引入dhfr缺陷型细胞，而后利用氨甲蝶呤来扩增质粒的拷贝数，在文献中已有充分阐述。虽然尚未深入研究过用dhfr在dhfr生成细胞中作可选择和可扩增的标记，但文献中的证据似乎表明，可以利用dhfr在dhfr生成细胞中作可选择标记而进行基因扩增。本发明的应用并不受所用的可选择标记的限制。此外，可以利用可扩增标记如金属硫因基因、腺苷脱氨酶基因、或多基因抗性家族的成员例如P-糖蛋白。在293细胞中，最好用一个含可选择标记如潮霉素B抗性基因的载体进行转化，然后利用氨甲蝶呤进行扩增，但氨甲蝶呤不能用来在293细胞中进行鼠类含dhfr质粒的选择。
基本按对293细胞所述的方法转化AV12细胞系(ATCCCRL9595)。AV12细胞也组成性地表达ElA基因产物，因而是本发明真核表达载体的优选宿主。但是，与293细胞不同的是，AV12细胞是在用含鼠类dhfr基因的载体转化后直接用氨甲蝶呤(200-500nM)进行选择的。为了表镏亓矗枰萌魏伪嗦胫亓吹谋泶镌靥謇醋疉V12细胞。但重链不会分泌到上清液中，除非AV12还用编码轻链的载体共转化。用编码轻链的载体转化后，轻链将从宿主细胞中分泌出来。以这种方式，通过AV12细胞的共转化和选择，表达轻链和重链的各种组合。因此，为检测全合成的、分泌的免疫球蛋白的产生，应检测分泌的重链的存在。
实例28免疫球蛋白产生的检测将实例27得到的氨甲蝶呤抗性转化体以每个组织培养皿几百个细胞克隆的密度培养在100mm2组织培养皿上。倒出培养基，将细胞用5ml等份的Hank氏平衡盐溶液(Gibco)洗两次。将1ml 1.8%琼脂与3ml Dulbecco氏修改的Eagle氏(DME)盐(Gibco)(37℃)混合，制备出无菌的0.45%琼脂(Sigma 4型琼脂糖、目录号＃A3643，Sigma Chemical Co.，P.O.Box 14508，St.Louis，MO63178)溶液，取2ml此0.45%琼脂溶液铺在细胞上。
将硝酸纤维素滤膜(SchleicherandSchuell，Inc.，Keene，NH03431)煮沸，然后高压灭菌2小时以除去对细胞有毒的润湿剂。然后把滤膜放在琼脂层上，除去气泡后，将培养皿于37℃下培养1-3小时。然后取下滤膜放在PBS(50mMTris-HCl，pH＝7.2;150mMNaCl)中。滤膜事先做好记号标明滤膜在培养皿上的原始取向，以便于后来的菌落鉴定。
为在滤膜分析过程中保持细胞在培养皿上存活，在细胞上铺8ml的一种混合物，其中含有2ml1.8%琼脂(4.7℃)、2mlDME盐(37℃)和4ml加有20%胎牛血清的DME盐(37℃)。然后把细胞放在37℃培养箱中。
在滤膜上进行的所有洗涤和反应都在滤膜置于摇床上时进行。首先将滤膜置于PBS中的5%牛奶中于室温下保温使之封闭。然后将滤膜用PBS冲洗4次(5分钟/次)。向滤膜上加10μg/ml含2.5%牛血清清蛋白的生物素化羊抗人重链(VectorLaboratories，Inc.，30IngoldRd.，Burlingame，CA94010)多克隆抗体(加入量足以覆盖滤膜)，然后于37℃下保温1小时。
多克隆抗体可以用E.A.Kabat公开的方法来制备(StructuralConcepts in Immunology and Immunochemistry，Holt，Rhinehart，and Winston，1968)。单克隆抗体也适用于进行检测，它可以用Kohler和Milstein(Nature，256∶495，1975)公开的方法或其它文献所公开的方法来制备(美国专利4，696，895;EPO公告205046;Laurell et al.，FEBS 191(1)∶75，1985;Suzuki et al.，J.Biochem.97∶127-138，1985;EPO公告138222)。用于检测的抗生物素蛋白D和生物素化的辣根过氧化物酶(HRP)以VectastainTM药盒(Vector Laboratories，Inc.)得到。生物素也得自Vector Laboratories，Inc。
将滤膜用PBS于4℃下冲洗4次。然后配制抗生物素蛋白D和生物素化的辣根过氧化物酶，并按照VectastainTM药盒中的厂家说明加入。将滤膜与HRP结合的抗生物素蛋白D一起于4℃下保温1小时(如果只分泌出少量蛋白，可以采用较长的保温时间如过夜)，然后将滤膜用PBS于4℃下冲洗4次。
为了在滤膜上显示指示剂颜色，将约30mg HRP显色剂(4-氯-1-萘酚，Sigma)溶于冰冷的100%甲醇中，加到50ml PBS和30μl 30% H2O2中。将此混合液加到硝酸纤维素滤膜上，于室温下保温至显色。分泌本发明多数抗体的菌落将在滤膜上显现出来，它们不仅颜色出现最早，而且在滤膜上的斑点较深。
滤膜显色后，将滤膜与原始的培养皿重新排列起来，确定哪些菌落与滤膜上的斑点相关。然后选择分泌多数抗体的菌落并用来产生抗体。
本领域专业人员应该知道，上述检测法仅仅是鉴定高分泌细胞系的说明性方法。有许多种检测法都能成功地应用于该方法。例如，可以应用双抗体反应，在该反应中，用羊抗人重链(IgG)和生物素化的抗羊IgG抗体代替生物素化的羊抗人重链抗体。
权利要求
1.一种在转化或转染细胞中表达抗体链的方法，所述抗体链能够结合KSA，所述方法包括下列步骤a)构建一个重组DNA载体，该载体含有一个编码轻链的基因，其氨基酸顺序构成基本如下(轻链)Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala SerPro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser ValSer Tyr Met Leu Trp Tyr Gln Lys Pro Gly Ser Pro LysPro Trp Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Phe Pro AlaArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile IleSer Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Tyr Cys His GlnArg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu GluIle Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro ProSer Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys PheLeu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys IleAsp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr AspGln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu ThrLeu Thr Lys Asp Glu Tur Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys GluAla Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe AsnArg Asn Glu Cysb)将所述载体转染或转化入哺乳动物宿主细胞中；c)在适于表达所述轻链基因的条件下培养所述宿主细胞。
2.一种在转化或转染细胞中表达抗体链的方法，所述抗体链能够结合KSA，所述方法包括下列步骤a)构建一个重组DNA载体，该载体含有一个编码重链的基因，其氨基酸顺序构成基本如下(重链)Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu LysLys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly TyrThr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro GlyLys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly GluPro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser LeuGlu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe Leu Gln Ile Gln Gln Pro GlnAsn Met Arg Thr Met Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Phe Ile SerLys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser SerAla Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val CysGly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val LysGly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly SerLeu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser AspLeu Tyr Thr Leu Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr TrpPro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser SerThr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile LysPro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly GlyPro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu MetIle Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val SerGlu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn ValGlu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr AsnSer Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln AspTrp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys AspLeu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly SerVal Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu GluMet Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp PheMet Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys ThrGlu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp GlySer Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn TrpVal Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly LeuHis Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lysb)将所述载体转染或转化入哺乳动物宿主细胞中;c)在适于表达所述重链基因的条件下培养所述宿主细胞。
3.一种在转化或转染细胞中表达抗体链衍生物的方法，所述抗体链衍生物能够结合KSA，所述方法包括下列步骤a)构建一个重组DNA载体，该载体含有一个编码轻链衍生物的基因，该基因是通过使编码权利要求1氨基酸顺序的DNA化合物的突变而形成的;b)将所述载体转染或转化入哺乳动物宿主细胞中;c)在适于表达所述轻链衍生物基因的条件下培养所述宿主细胞。
4.一种在转化或转染细胞中表达抗体链衍生物的方法，所述抗体链衍生物能够结合KSA，所述方法包括下列步骤a)构建一个重组DNA载体，该载体含有一个编码重链衍生物的基因，该基因是通过使编码权利要求2氨基酸顺序的DNA化合物突变而形成的;b)将所述载体转染或转化入哺乳动物宿主细胞中;c)在适合于表达所述重链衍生物基因的条件下培养所述宿主细胞。
5.一种在转染或转化细胞中表达嵌合抗体链的方法，所述抗体链含有能与KSA结合的可变区，所述方法包括下列步骤a)构建一个重组DNA载体，该载体含有一个编码轻链可变区的基因，其氨基酸顺序构成基本如下(轻链可变区)Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala SerPro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser ValSer Tyr Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro LysPro Trp Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Phe Pro AlaArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile IleSer Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His GlnArg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu GluIle Lys Glyb)将所述载体转染或转化入哺乳动物宿主细胞中;c)在适于表达所述轻链基因的条件下培养所述宿主细胞。
6.权利要求5的方法，其特征在于，重组DNA载体为如实例21所述的质粒pL-HD。
7.权利要求6的方法，其特征在于，转染或转化细胞为AV12细胞。
8.一种在转染或转化细胞中表达嵌合抗体的方法，所述抗体链含有能与KSA结合的可变区，所述方法包括下列步骤a)构建一个重组DNA载体，该载体含有一个编码轻链可变区的基因，其氨基酸顺序构成基本如下(轻链可变区)Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala SerPro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser ValSer Tyr Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro LysPro Trp Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Phe Pro AlaArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile IleSer Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His GlnArg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu GluIle Lys Argb)将所述载体转染或转化入哺乳动物宿主细胞中;c)在适于表达所述轻链基因的条件下培养所述宿主细胞。
9.一种在转染或转化细胞中表达嵌合抗体链的方法，所述抗体链含有能与KSA结合的可变区，所述方法包括下列步骤a)构建一个重组DNA载体，该载体含有一个编码重链可变区的基因，其氨基酸顺序构成基本如下(重链可变区)Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu LysLys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly TyrThr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro GlyLys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly GluPro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser LeuGlu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe Leu Gln Ile Gln Gln Pro GlnAsn Met Arg Thr Met Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Phe Ile SerLys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Serb)将所述载体转染或转化入哺乳动物宿主细胞中;c)在适于表达所述重链基因的条件下培养所述宿主细胞。
10.权利要求9的方法，其特征在于，重组DNA载体为如实例23所述的质粒pH1-HD、如实例24所述的质粒pH2-HD、如实例25所述的质粒pH3-HD、或如实例26所述的质粒pH4-HD。
11.权利要求10的方法，其特征在于，转染或转化细胞为AV12细胞。
12.一种在转染或转化细胞中表达嵌合抗体的方法，所述抗体含有能与KSA结合的可变区，所述方法包括下列步骤。a)构建一个重组DNA载体，该载体含有一个编码轻链可变区的基因，其氨基酸顺序构成基本如下(轻链可变区)Gln Ile Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala SerPro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser ValSer Tyr Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro LysPro Trp Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Phe Pro AlaArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile IleSer Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His GlnArg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu GluIle Lys Argb)构建一个重组DNA载体，该载体含有一个编码重链可变区的基因，其氨基酸顺序构成基本如下(重链可变区)Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu LysLys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly TyrThr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro GlyLys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly GluPro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser LeuGlu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe Leu Gln Ile Gln Gln Pro GlnAsn Met Arg Thr Met Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Phe Ile SerLys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser或c)构建一个重组DNA载体，该载体含有所述编码轻链可变区的基因和所述编码重链可变区的基因;d)将所述载体a)和b)或所述载体c)转染或转化入哺乳动物宿主细胞中;e)在适于表达所述可变区基因的条件下培养所述宿主细胞。
13.一种在转染或转化细胞中表达嵌合抗体的方法，所述抗体含有能与KSA结合的可变区，所述方法包括下列步骤a)构建一个重组DNA载体，该载体含有一个编码轻链可变区的基因，其氨基酸顺序构苫救缦拢ㄇ崃纯杀淝 Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala SerPro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser ValSer Tyr Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro LysPro Trp Ile Phe Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Phe Pro AlaArg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile IleSer Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His GlnArg Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu GluIle Lys Glyb)构建一个重组DNA载体，该载体含有一个编码重链可变区的基因，其氨基酸顺序构成基本如下(重链可变区)Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu LysLys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly TyrThr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Thr Pro GlyLys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly GluPro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser LeuGlu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe Leu Gln Ile Gln Gln Pro GlnAsn Met Arg Thr Met Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Phe Ile SerLys Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser或c)构建一个重组DNA载体，该载体含有所述编码轻链可变区的基因和所述编码重链可变区的基因;d)将所述载体a)和b)或所述载体c)转染或转化入哺乳动物宿主细胞中;e)在适于表达所述可变区基因的条件下培养所述宿主细胞。
14.权利要求13的方法，其特征在于，a)中的质粒为质粒pL-HD，b)中的质粒为质粒pH1-HD。
15.权利要求13的方法，其特征在于，a)中的质粒为质粒pL-HD，b)中的质粒为质粒pH2-HD。
16.权利要求13的方法，其特征在于，a)中的质粒为质粒pL-HD，b)中的质粒为质粒pH3-HD。
17.权利要求13的方法，其特征在于，a)中的质粒为质粒pL-HD，b)中的质粒为质粒pH4-HD。
18.权利要求14至17中任一项的方法，其特征在于，转染或转化细胞为AV12细胞。
19.一种在重组非淋巴宿主细胞中表达重组和嵌合抗体链的方法，所述方法包括(1)用一个或若干个重组DNA表达载体转化所述宿主细胞，这些载体含有a)一个能在所述非淋巴宿主细胞中起作用的启动子和翻译激活顺序;b)一个编码一条或若干条重组或嵌合抗体链的DNA顺序，所述DNA顺序的定位适于由所述启动子和激活顺序驱动表达;(2)在适于表达重组或嵌合免疫球蛋白链的条件下，培养步骤(1)中转化的所述宿主细胞。
20.权利要求19的方法，其特征在于，所述重组宿主细胞选自293细胞和AV12细胞。
21.权利要求20的方法，其特征在于，步骤2中所述的重组宿主细胞为AV12细胞。
22.权利要求21的方法，其特征在于，重组DNA表达载体为质粒pL-HD、质粒pH1-HD、质粒pH2-HD、质粒pH3-HD或质粒pH4-HD。
全文摘要
本发明包括编码单克隆抗体KS1/4和单克隆抗体KS1/4嵌合衍生物的新的重组DNA化合物。构建了一些真核表达载体，这些载体含有新的KS1/4编码DNA，并能在转化到适当的宿主细胞中后驱动KS1/4的表达。新的表达载体可用来产生KS1/4的修饰的和嵌合的衍生物。重组产生的KS1/4、KS1/4衍生物和KS1/4嵌合体，可用于包括腺癌在内的疾病的诊断、预测和治疗。
文档编号C07K19/00GK1037174SQ8910239
公开日1989年11月15日 申请日期1989年4月20日 优先权日1988年4月21日
发明者丽莎·塞尔萨姆·比弗斯, 托马斯·弗兰克·布莫尔, 罗伯特·艾伦·加德斯基, 巴巴拉·吉恩·怀格尔 申请人:伊莱利利公司