专利名称：调节淋巴细胞活性的抗体杂合物的制作方法
本申请是1988年4月4日提交的176，825号美国专利申请的后续部分，该申请作为本文的参考文献。
本发明涉及新的抗体杂合物，及其调节淋巴细胞活性(例如T细胞和B细胞)的应用。更具体地说，本发明涉及至少包含两种抗体的杂合物，它们相互偶联，每种抗体都能与不同的淋巴细胞表面抗原反应。这些杂合物似乎是这样起作用的首先与淋巴细胞结合，从而使它们与之反应的各种细胞表面抗原在空间上相互接近，因此提高或降低淋巴细胞的信号转导和增殖。根据本发明的优选方案，使一种能与T细胞受体或与其结合的CD3复合物反应的抗体与另一种抗体交联，后者能与第二种T细胞表面抗原反应，例如CD2、CD4、CD6或CD8，从而增强T细胞的活化作用和功能。根据另一优选方案，使一种能与T细胞表面抗原CD5反应的抗体与一种能与第二种T细胞表面抗原(例如CD4、CD6或CD8)反应的抗体交联，以增强淋巴细胞的活化作用和功能。在另一个优选方案中，使一种能与CD45抗原族反应的抗体与另一种抗体交联，后者能与第二种T细胞表面抗原反应，例如CD2、CD3、CD5或CD28，以抑制淋巴细胞的活化作用和功能。在另一个优选的具体方案中，使一种能与CD4抗原反应的抗体与一种能与CD45抗原反应的抗体交联，以增强淋巴细胞的活化作用和功能。本发明的抗体杂合物、方法及组合物可用于调节淋巴细胞的作用，以改善治疗某些疾病时的细胞免疫应答，这些疾病有例如传染病、癌症、艾兹病和自身免疫疾病。
T淋巴细胞在本领域内也称为T细胞，已知它至少能以两种不同途径介导免疫应答作用。细胞毒性T细胞涉及特异靶细胞的溶解，而辅助T细胞则协助B细胞的增殖和分化，导致抗原特异性抗体的生成(参见J.W.Kimball编《免疫学导论》第2版11-13章，MacmillanPublishingCo.，1986)。任一种T细胞都可在活化后行使其功能，T细胞受体(Ti)或T细胞表面与其结合的CD3复合物(也称为CD3/Ti受体复合物)与具抗原细胞上的抗原作用便可使T细胞活化(参见E.L.Reinherz等人，“人T淋巴细胞的克隆型表面结构抗原受体复合物的功能及生化分析”，Immuno.Rev.8195-129，1984)。
然而，已经发现，T细胞对抗原的应答只在这样的情况下发生即该抗原与具抗原细胞的由特异MHC(主要组织相容性复合物)编码的抗原相结合。因此，认为T细胞对抗原的识别局限于与抗原结合的MHC编码产物的类别。这种MHC限制作用的结果是，细胞毒性T细胞通过与Ⅰ类MHC抗原结合的抗原活化，而辅助T细胞通过与Ⅱ类MHC抗原结合的抗原活化(J.W.Kimball编，《免疫学导论》286-89和348-58页)。
进一步还知道，由Ⅱ类MHC限制的T细胞除了表达CD3/Ti受体复合物外，还表达一种称为CD4的细胞表面抗原，而Ⅰ类MHC限制的T细胞则表达细胞表面抗原CD8。MHC限制作用和CD抗原表达间的这种联系导致这样的假设在T细胞的活化过程中，不同的MHC抗原是CD抗原的天然配体，即辅助T细胞上的CD4抗原与具抗原细胞(如巨噬细胞)上的Ⅱ类MHC分子相作用，而细胞毒性T细胞上的CD8抗原与特异靶细胞(如病毒感染细胞)上的Ⅰ类MHC分子相作用(F.Emmrich等人，“T细胞受体复合物与亚类特异性分化抗原的交联促进人CD4和CD8T细胞中的白细胞介素2受体表达”，Eur.J.Immunol.17529-34，1987)。此外，还有人认为，T细胞对抗原的识别可通过四级复合物进行，其中，与CD抗原(例如CD4或CD8)结合的T细胞表面的CD3/Ti受体复合物，“看见”与合适的MHC编码抗原相结合的抗原(P.Anderson等人，“T3(CD3)与T4(CD4)的交联增强休止T淋巴细胞的增殖”，J.Immunol.139678-82，1987)。
本申请中的CD抗原是指天然产生的细胞表面分化抗原，由单克隆抗体与细胞表面的反应性定义，它们由国际讨论会(InternationalWorkshop)所命名，该组织的作用是为这些抗原提供一种统一的命名(A.J.McMichael编《白细胞分类Ⅲ》，牛津大学出版社，1987)。大量CD抗原已进行了分子克隆，并因此确定了所有特征(同上)。著名的CD抗原包括广泛的T抗原CD3、CD2、CD5、CD6和CD7，一种对于辅助T细胞亚类特异性的CD抗原CD4，以及一种对于抑制型T细胞亚类特异性的CD抗原CD8(J.A.Ledbetter等人，《免疫遗传学及组织相容性展望》第6卷，E.Heise编，淋巴细胞表面抗原1984，325-40页，美国组织相容性及免疫遗传学学会，纽约1984)。CD28是一种大多数T细胞上具有的抗原(Yamada等人，Eur.J.Immunol.151164-1169，1985)。虽然由上述可以看出，这些分化抗原被认为是作为受体起作用并与T细胞的信号转导相联系，但仍不了解它们在T细胞活化中的具体功能，而这正是需进行广泛研究的课题。
例如，已在分子水平上进行了研究，以确定CD抗原在T细胞活化中的作用。已知CD3/Ti受体复合物与单克隆抗体或抗原的反应在T细胞中导致跨膜“信号”的产生。此信号通常通过肌醇磷酸(1、2和3)的生成以及胞质游离钙浓度(〔Ca2+〕i)的上升而测定(J.B.Imboden等人，“T细胞抗原受体的跨膜信号”，J.Exp.Med.161446-56，1985;J.B.Imboden等人，“人T细胞克隆对抗原的识别导致肌醇三磷酸的上升”，J.Immunol.1381322-24，1987)。
但是，此信号的产生可能并不足以刺激T细胞增殖(同上，873页)。在实验条件下发现，如果T细胞表面的CD3抗原通过与带有交联抗体的细胞反应而交联，则会导致T细胞的增殖。所述交联抗体是通过副卫细胞的存在(例如，通过单核细胞Fc受体与针对CD3的抗体上的Fc部分相互作用)，或通过将抗体固定在固相基质上而进行交联的。
因此，偶联于固相基质上的针对CD3/Ti受体复合物的单克隆抗体能够刺激T细胞增殖(P.Anderson等人，同上;C.Walker等人，“通过抗CD3抗体与第二抗T细胞抗体的交联活化T细胞机理及亚类特异性活化作用”，Eur.J.Immunol.17873-80，1987)，这一部分是由于CD3抗原的交联，一部分是由于阻止了CD3/Ti受体复合物的内化，此内化作用将抑制T细胞的活化(J.A.Ledbetter等人，“CD3的结合效价及CD3细胞表面复合物的内化控制T细胞对第二信号的应答”，J.Immunol.1363945-52，1986)。但是，对于活体中的治疗应用来说，用一种固定在固相基质上的抗CD3抗体来增强T细胞的活化存在相当的困难。这样一种应用将涉及固相基质(通常是小珠)的注射，但接受注射的病人将承受某种危险，例如动脉的阻断或阻隔。
另外还有人认为，在生理条件下，即使这种通过CD3抗原交联的CD3/Ti刺激作用也只能产生很弱的信号，它需要通过T细胞表面上的CD3/Ti和其他CD抗原之间的相互作用而增强(P.Anderson等人，同上，678页)。
此外，还不清楚T细胞活化中CD抗原相互作用的确切效应。例如，对自发的CD4缺失变异进行的分析(P.Marrack等人，“T细胞上MHC限制的抗原受体Ⅱ，L3T4产物的作用”，J.Exp.Med.1581077-91，1983)，以及基团转移实验(D.Gay等人，“人T细胞蛋白CD4和MHCHLA-DR抗原间的功能性相互作用”，Nature328626-29，1987)都表明，CD4的表达增强了T细胞对特异抗原的应答，并且，如果抗原浓度在最适以下，或者T细胞对于抗原/MHC编码抗原的亲和力很低，则CD4所起的作用非常重要(A.Regnier-Bigouroux等人，“辅助分子及T细胞活化Ⅰ。抗原受体亲合力不等地影响T细胞对于针对LFA-1和L3T4的单克隆抗体抑制作用的敏感性”，Eur.J.Immunol.161385-90，1986;S.Shaw等人，“细胞毒性T淋巴细胞克隆对于抗T3和抗T4(但不抗LFA-1)单克隆抗体抑制作用的敏感性随着细胞毒性T淋巴细胞与靶子间相互作用的“亲和力”而不同”，J.Immunol.1343019-26，1985)。此外，如果将与CD3和CD4反应的单克隆抗体固定在同样的固相基质上，则将增强与此固化抗体接触的T细胞的增殖。同样，如果针对CD3和CD8的单克隆抗体偶联在固相基质上，则T细胞增殖的提高超过仅使用针对CD3一种抗体的情况(P.Anderson等人，同上)。
然而，对可溶性CD4单克隆抗体的研究表明，可溶性抗体抑制T细胞应答，这似乎表明CD4可能传递一种抑制T细胞活化的负信号(J.P.Bank等人，J.Exp.Med.1631294，1985;J.P.Tite等人，“L3T4在T细胞活化中的作用L3T4可能既是Ia结合蛋白又是传递负信号的受体”，J.Cell.Mol.Immunol.2179-90，1986;P.M.Rosoff等人，“L3T4分子在分裂素和抗原活化的信号转导中的作用”，Cell49845-53，1987)。
B淋巴细胞也称为B细胞，它是抗体生成(浆)细胞的前体。如果B细胞受到抗原的刺激(这需要辅助T细胞和巨噬细胞的协同作用)，B细胞则开始增殖，并分化成浆细胞和记忆B细胞。在B细胞上鉴别到的CD抗原包括CD19、CD20、CDw45、CD45、CD45R和Bgp95(此抗原目前还没有CD命名)(McMichael，《白细胞分类Ⅲ》，同上)。
另一种感兴趣的CD抗原是白细胞都有的抗原CD45(L-CA，也称为T200或Ly-5)。CD45包括一类主要的糖蛋白，其分子量范围是180-220KDa，它只存在于造血谱系的细胞上(Trowbridge等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72157-161，1975;Komuro等人，Immunogenetics1452-456，1975;Schied等人，Immunogenetics9423-433，1979;Dalchau等人，Eur.J.Immunol.10737-744，1980;Omary等人，J.Exp.Med.152842-852，1980)。mRNA的不同剪接产生CD45的各种同形体。这些同形体由T和B淋巴细胞亚群不等地表达。针对人CD45抗原的某些单克隆抗体识别所有CD45同形体都具有的决定簇，即分子量为220、205、190和180KDa的同形体(Cobold等人，《白细胞分类Ⅲ》同上，第15章788-803页)。然而，其他单克隆抗体只识别CD45的220KDa同形体(称为CD45R)，它是通过B淋巴细胞和T细胞亚群的选择表达产生的(Cobold，同上;Dalchau等人，J.Exp.Med.153753-765，1981;Morimoto等人，J.Immunol.1341508-1515，1985;Ledbetter等人，J.Immunol.1351819-1825，1985)。另一种单克隆抗体UCHL-1选择性地与180KDa分子结合，此分子只存在于皮质胸腺细胞和一个活化的或记忆T细胞亚类上(Smith等人，Immunology5863-70，1986)。
最近，已经由cDNA核苷酸顺序推导出了大鼠(Thomas等人，Cell4183-93，1985;Barclay等人，EMBOJ.61259-1264，1987)、小鼠(Saga等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA836940-6944，1986;W.C.Raschke，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84161-165，1987;Thomas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA845360-5363，1987;Saga等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA845364-5368，1987)和人(Ralph等人，EMBOJ.61251-1257，1987;Streuli等人，J.Exp.Med.1661548-1566，1987)CD45(L-CA)的一级结构。CD45是一种膜结合蛋白，它有一个705-707氨基酸的大片段伸入胞质中，一个22氨基酸的跨膜片段，及一个范围在400-550氨基酸的胞外结构域。CD45的各种同形体是通过单一基因初始转录后对mRNA进行不同剪接产生的，它们具有不同的胞外结构域，但具有相同的跨膜片段和胞质片段(Barclay，同上;Ralph，同上;Streuli，同上)。胞质片段有两个同源的高度保守的结构域，大约有300个残基。
企图确定CD45的功能的研究工作产生了有冲突的结果(Cobold，同上)。据报道，针对人和小鼠抗原的单克隆抗体抑制T和B细胞增殖(Harp等人，J.Immunol.13310-15，1984;Bernabeu等人，Eur.J.Immunol.171461-1466，1987;Mittler等人，J.Immunol.1383159-3166，1987)、抗体形成细胞的生成(Yakura，J.Exp.Med.1571077-1088，1983)、天然杀伤(NK)细胞和细胞毒性T细胞活性(Seaman等人，J.Immunol.127982-986，1981;W.Newman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA793858-3862;Nakayama等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA761977-1981，1979;Lefrancois等人，Nature(London)314449-452，1985)。Thomas(同上)提出，此分子中具有两个保守的同源区的80KDa的胞质部分可能对CD45的功能起关键作用。最近发现这些结构域与一种主要的低分子量蛋白酪氨酸磷酸酶同源，此酶是从人胎盘的可溶组分和颗粒组分中分离出(Tonks等人，J.Biol.Chem.2636722-6730，1988;Charbonneau等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA857182-7186，1988)。这表明CD45是一种膜结合的蛋白酪氨酸磷酸酶，它可能通过与其他膜结合分子的相互作用而发挥其功能。
本发明澄清了上述的某些不确定的观点，并提供了至少包括两种抗体的抗体杂合物，这两种抗体能与淋巴细胞(例如T细胞)上表达的不同的表面抗原反应，并且抗体间相互交联。这些杂合物中有一些在T细胞活化过程中能增强信号转导作用，这是通过它们能够提高T细胞中的〔Ca2+〕i而确定的，即它们在比仅用针对CD3抗原的抗体时低大约两个数量级的蛋白浓度下就能够提高T细胞中的钙离子浓度。
此外，本发明的杂合物包括那些能够抑制淋巴细胞的活化和功能的杂合物。
荼痉⒚鞯挠叛》桨福鼓苡隒D3/Ti受体复合物或其组分反应的单克隆抗体与另一种单克隆抗体交联，后者能与T细胞表面的第二种抗原反应，例如CD2、CD4、CD6或CD8抗原，从而形成能在T细胞活化过程中增强信号转导的杂合物。根据本发明的另一优选方案，使一种能与T细胞表面抗原CD5反应的单克隆抗体与另一种单克隆抗体交联，后者能与T细胞表面的第二种抗原反应，例如CD4、CD6或CD8抗原。一个特别优选的方案涉及这样一种杂合物，它包括相互交联的针对CD3的抗体和针对CD4的抗体。
根据本发明的另一优选方案，使一种能与CD45T细胞表面抗原反应的单克隆抗体与另一种单克隆抗体交联，后者能与T细胞表面的第二种抗原反应，例如CD2、CD3、CD5或CD28抗原，从而形成抑制淋巴细胞活化和增殖的杂合物。一个特别优选的方案涉及这样一种杂合物，它包含相互交联的CD3抗体和能与CD45抗原或其同形体反应的抗体。
本发明还包括用本发明杂合物处理淋巴细胞的方法，以在产生细胞免疫应答的过程中增强或抑制淋巴细胞的活化作用。因此，本发明的杂合物可用于药物组合物中，例如那些包括治疗有效量的至少一种本发明杂合物和一种药物上可接受的载体的组合物。因此，本发明的杂合物、方法和组合物能用于免疫治疗中以增强或调节免疫应答，例如，可用于治疗传染病、癌症、艾兹病和自身免疫疾病。
图1给出了用不同浓度的不同抗体刺激外周血淋巴细胞后，胞质中游离钙浓度(〔Ca2+〕i)上升的比较图形;(A)使用本发明的CD3/CD4杂合物G19-4/G17-2，(B)使用抗CD3的单克隆抗体G19-4。
图2给出了外周血淋巴细胞(PBL)或具有本发明CD3/CD4杂合物(即G19-4/G17-2)的CD4+T细胞在刺激后的〔Ca2+〕i应答及应答细胞百分比的比较图形。还给出了用CD4单克隆抗体G17-2预处理细胞，然后用杂合物刺激的抑制效应。
图3给出了在5mMEGTA存在下，本发明的G19-4/G17-2杂合物( )或CD3单克隆抗体G19-4(□)对于CD4+T细胞的〔Ca2+〕i活性的滴度比较。
图4给出了用CD3抗体G19-4(·)或本发明的CD3/CD4杂合物G19-4/G17-2(△)以1μg/ml刺激CD4+T细胞后的肌醇磷酸上升的比较图形。还给出了零时和10分钟时未处理对照(O)的肌醇磷酸水平。A图描绘了肌醇磷酸1(InsP1)的上升，B图描绘了肌醇磷酸2(InsP2)的上升，C图描绘了肌醇磷酸3(InsP3)的上升。
图5描绘了两个独立实验的结果，其中，用生物素结合的CD4抗体(G17-2)预处理CD4+T细胞，然后用CD3抗体(G19-4)、G17-2、CD3/CD4杂合物(G19-4/G17-2)或抗生物素蛋白中任一种和其结合物刺激CD4+T细胞，然后测定InsP1的上升。
图6描绘了CD3单克隆抗体(CD3Mono)、CD3/CD3同合物(CD3Homo)、CD4/CD4同合物(CD4Homo)及本发明的CD3/CD4杂合物(CD3+4Hetero)对于T细胞增殖的效应，此效应是通过CD4+T细胞对〔3H〕-胸苷的掺入而标明的，条件是有或没有PMA(佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯)或CD28抗体。
图7描绘了CD4+T细胞对各种处理的增殖应答的比较图形，纵座标是3H-胸苷的掺入，横座标是G19-4(CD3Mono)+PMA(
)、G19-4+CD28抗体(α-CD28)(
)、CD3/CD4杂合物(CD3+4Hetero)+PMA(
)、CD3/CD4杂合物+α-CD28(
)、CD3/CD3同合物(CD3 Homo)+PMA(
)或CD3/CD3同合物+α-CD28(
)中任一种的浓度。
图8描绘了用PHA(植物凝血素)、本发明的CD3/CD4杂合物G19-4/G17-2、CD3/CD3同合物G19-4/G19-4、作为对照的CD3/CD8杂合物G19-4/G10-1和CD4/CD4同合物G17-2/G17-2中任一种刺激T细胞3天后，经过第一、第二或第三细胞周期的CD4+T细胞的百分比。
图9描绘了由固定化CD3单克隆抗体G19-4诱导的对于T细胞增殖应答的抑制作用的比较图形，此结果是仅由〔3H〕-胸苷的掺入(·)或相对于CD45单克隆抗体9.4(□)或p97单克隆抗体96.5(□)中任一种的浓度而得到的，没有(A)或有(B)PMA(还给出了在溶液中用CD45单克隆抗体9.4的增殖结果作为比较(△);给出的是平均值;校准误差＜15%)。
图10描绘了通过〔Ca2+〕i的上升测定的CD45受体对T细胞信号转导的调节作用;测定是如后面的实例4所述，单独或与CD45单克隆抗体9.4或CD45R单克隆抗体3AC5一起使T细胞上的受体交联后进行的(左边给出了每个实验中〔Ca2+〕i的平均值，右边则给出了应答细胞的百分比;箭头标明加入单克隆抗体或抗生物素蛋白的时间)。
为了使本发明得到更好的理解，下面给出更详细的说明。
本发明涉及一种新的抗体杂合物，以及它们在增强或抑制淋巴细胞活化和功能中的应用。更具体地说，本发明涉及至少包含两种互相交联的抗体的杂合物，每种抗体能与不同的淋巴细胞表面抗原反应。为了增强活性，偶合物中的一种抗体最好能与T细胞受体(Ti)或与其结合的CD3抗原复合物反应，而另一抗体则能与第二种T细胞表面抗原反应，例如CD抗原(如CD2、CD4、CD6或CD8)。另一种选择是，偶合物中的一种抗体能与CD5抗原反应，而另一抗体能与第二种T细胞表面抗原反应，例如CD4、CD6或CD8。杂合物CD4/CD5也导致T细胞活性的增强。为了进行抑制，杂合物中的一种抗体最好能与CD45抗原族(同形体)反应，而另一抗体能与T细胞表面抗原如CD2、CD3、CD5或CD28反应。
本文所述的杂合物并不受现有理论的束缚，当它们与淋巴细胞反应时，通过与细胞表面不同抗原的结合，一定能使这些抗原在空间上相互密切接近，这一步可能模仿了发生于T细胞受体和CD4之间的共聚作用，即在T细胞活化过程中使辅助T细胞与具抗原的细胞接触后发生的共聚作用(A.Kupfer等人，“CD4(L3T4)分子与T细胞受体的共聚作用是通过辅助T细胞和具抗原细胞的辅助作用的特异直接作用诱导的”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA845888-5892，1987)。细胞表面的T细胞抗原之间的这种相互作用似乎可增强CD3/Ti介导的跨膜信号传递，并因此促进T细胞的活化作用。
虽然并不了解CD45抗原对淋巴细胞产生效应的机理，但本文所述的CD45杂合物可能在空间上与淋巴细胞密切相近时，通过从功能上修饰其他的淋巴细胞受体而起作用，例如在某些CD受体(如CD3抗原)聚集后导致抑制作用。最近提出CD45的胞质结构域与人胎盘主要蛋白质酪氨酸磷酯酶之间具有同源性，这提示前者实际上是一种膜结合的蛋白质酪氨酸磷酯酶，其功能是在白细胞中使其他膜结合分子(如CD3的Z链上)上的关键的酪氨酰残基去磷酸化，从而调节信号转导作用(Klausner等人，J.Biol.Chem.26212654-12659，1987)。CD45还能够调节与CD4结合的蛋白质酪氨酸激酶活性，而CD4的功能通常是调节抗原驱动的信号转导(Rudd等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA855190-5194，1988)。另外，CD4结合的酪氨酸激酯可使CD45抗原在其酪氨酰残基上磷酸化，从而改变其活性。这一点能够解释下面实例所示的由于CD4和CD45受体交联而产生的独特的增强活性。由此模式可以预测，关键酪氨酰残基的磷酸化在钙动员之前发生，并且为后者所必需。膜结合形式的酶如果只有与其他膜结合蛋白密切相近时才能起作用，则它能用来将蛋白质酪氨酸激酶/磷酯酶调节作用定位于特异的细胞表面分子上。因此，相信本发明的杂合物能够增强或抑制淋巴细胞的活化作用和功能。
应当注意到，本发明的T细胞调节作用(即抑制作用)可以是广泛的T细胞调节作用，也可是特定亚类或T细胞克隆的调节作用。广泛的T细胞调节作用是这样产生的使T细胞与能够调节所有T细胞群落的杂合物接触。这些杂合物包含能与所有T淋巴细胞上的T细胞抗原反应的抗体。这种杂合物包含能与所有T淋巴细胞上的T细胞抗原反应的抗体。这种杂合物的实例之一即是本发明的CD3/CD2杂合物，CD3和CD2都是广泛的T细胞抗原(J.A.Ledbetter等人，《免疫遗传学与组织相容性展望》，同上，表1)。
然而，通过使用合适的杂合物，能达到更具专一性的调节作用。例如在这样的情况下，即只需要活化一个特异的T细胞亚群落时，例如辅助细胞或抑制细胞亚类，则可通过构建这样一种杂合物而达到此目的，即该杂合物中的抗体之一能与特异的T细胞亚群落反应，也就是说，一种抗体必须能与特异于该亚群落的抗原反应。偶合物中的另一抗体则最好是特异于广泛的T细胞抗原。那么，根据这一具体方案，本发明的CD3/CD4或CD5/CD4杂合物特异性地增强辅助T细胞的活化(CD4专一于辅助T细胞亚类)，而CD3/CD8或CD5/CD8杂合物则特异性地增强抑制T细胞亚群落的活化(CD8特异于抑制T细胞亚类)。
另一种选择是，本发明的CD3/CD45杂合物特异性抑制具有CD45抗原的T细胞的活化作用。由于T细胞亚类上还表达CD45受体的同形体，本发明中含有能与CD45同形体反应的抗体的杂合物还可用来调节这些T细胞亚类。
最后，如果需要进行克隆型调节，也即调节特异的T细胞克隆，则本发明的杂合物将包含一个抗克隆型(Ti)的抗体组分，也就是说，一个能与待调节的克隆上的T细胞受体可变区反应的抗体。因此，如果某一克隆型T细胞不能完全看见某一特异抗原(如肿瘤或病毒抗原)并发生应答，或其应答受到抑制，则可应用本发明中包括特异于该T细胞的克隆型抗体(Ti/CD4、Ti/CD8、Ti/CD6、Ti/CD2)的杂合物调节这些T细胞克隆。另一种选择是，为了抑制特异的T细胞克隆，可以使用由Ti/CD45组成的杂合物(或Ti/CD45同形体)。根据这一具体方案，杂合物中的Ti组分基本上可看作是取代了调节特异T细胞时抗原的位置。杂合物中的另一抗体可以是广泛的T细胞特异性或亚类特异性的抗体，或是能与CD45或CD45同形体反应的抗体。
因此，组成本发明杂合物的抗体包括所有能与淋巴细胞表面抗原反应的抗体。根据一个优选方案，偶合物中的抗体之一能与Ti或CD3T细胞抗原反应。根据进一步的优选方案，使一种能与CD3T细胞表面抗原反应的抗体与一种能与T细胞表面的CD4抗原反应的抗体相交联。
可能组成本发明杂合物的其他抗体包括但不限于，能与其他CD抗原反应的抗体，例如淋巴细胞上的CD2、CD5、CD6、CD7、CD8、CD28和CD28(A.Bernard等人编《白细胞分类》，SpringerVerlag，Heidelberg，1984;J.A.Ledbetter等人，《免疫遗传学与组织相容性展望》，同上)。因此，根据另一个优选方案，使一种能与CD5T细胞表面抗原反应的抗体与一种能与CD4、CD6或CD8抗原反应的抗体交联，从而形成本发明的杂合物。在另一优选方案中，使一种能与CD3T细胞表面抗原反应的抗体与另一种抗体交联，后者能与淋巴细胞表面的CD45抗原或其同形体反应。
组成本发明杂合物的抗体可以是多克隆的，但优选单克隆的，可以是完整的抗体分子或是含有该抗体活性结合区的片段，例如Fab或F(ab′)2;而且能够利用本领域的公知技术生产(参见下面实例1-3提出的参考文献，即描述如何制备抗CD3、抗CD4、抗CD5和抗CD2单克隆抗体的出版物)。此外，针对许多CD抗原(如CD2、CD3、CD4和CD5抗原)的单克隆抗体可从商业上得到(Becton Dickinson，Mountainview，CA)，或可从国际白细胞分类讨论会得到。如果使用单克隆抗体，抗体可以是来自小鼠或人的抗体，或可以是嵌合抗体(V.T.Oi“嵌合抗体”，Biotechniques4214-221，1986)。进一步，本发明还包括双特异性的或重组单克隆抗体，其中，抗体的一种特异性是能与T细胞抗原反应，另一种特异性则是针对第二种T细胞抗原。这种双特异性抗体可如美国专利4，474，893所述，从四瘤或三瘤细胞中生产，或可通过化学合成生产(Brennan等人，Science22981-83，1985)。
组成本发明杂合物的抗体可通过本领域的公知技术共价结合在一起，例如使用杂双功能交联剂GMBS(马来酰亚胺丁氧基琥珀酰亚胺)或SPDP(N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫)丙酸盐)(R.R.Hardy，“用于流式细胞光度术的荧光蛋白的纯化和偶联”，《实验免疫学手册》第1卷，免疫化学，D.M.Weir等人编，31.4-31.12页，第4版，1986;参见其中关于常规的抗体偶联技术的讨论)。
因此，应当理解，本发明包括任一种至少由两种这样的分子组成的杂合物，即它们能与相同淋巴细胞上不同的淋巴赴乖从Γ迷雍衔锏淖饔檬窃銮炕蛞种屏馨拖赴幕罨饔煤凸δ堋１痉⒚鞯脑雍衔锘褂Φ辈唤鲇隩细胞还有B细胞上的抗原反应。
很明显，除了抗体以外，本发明的杂合物可掺入能与淋巴细胞受体结合的配体。例如，已证实CD4受体能与配体gp120反应(人免疫缺损病毒或“HIV”的一种糖蛋白受体)(Linsley等人，J.Virology623695-3702，1988)。因此，由相互交联的CD3抗体和配体gp120组成的杂合物可通过使CD3和CD4受体交联而增强T细胞活性。还可考虑到其他的配体偶合物，即由相互交联的与T细胞受体反应的配体和与不同的T细胞受体反应的配体组成的偶合物。
在一个优选方案中，例举了本发明的杂合物及其在T细胞活化中的应用，在此方案中，使一种能与T细胞表面的CD3抗原反应的抗体与一种能与CD4抗原反应的抗体结合，以形成本发明新的CD3/CD4杂合物。用此杂合物处理CD4+T细胞，导致辅助T细胞亚类中的信号转导作用增强，这是通过下述现象证实的，即与仅用CD3抗体处理细胞相比较，胞内的〔Ca2+〕i动员显著增强，而且肌醇磷酸1、2和3的形成也大量上升。CD3/CD4杂合物的这种信号增强活性并不是简单地由于寡聚作用所致，因为CD3/CD3和CD4/CD4同合物或其混合物并未表现出这种增强的活性。而且，现有技术在以前还曾证实，CD3/CD4抗体的混合物是降低而不是增高这种活性(P.M.Rosoff等人，同上)。进一步，通过杂合物增强的活性受到用可溶性CD4单克隆抗体预处理T细胞的抑制。
此外，CD3/CD4杂合物还表现出对于T细胞活化的新的功能活性，即在能与CD28反应的单克隆抗体的存在下，此杂合物能诱导CD4+T细胞的增殖，并且在低至100ng/ml的浓度下，也能完全与CD28刺激一起促进有丝分裂。单独用CD3抗体或CD3/CD3或CD4/CD4同合物观察不到这种对有丝分裂的共促作用。进一步发现，本发明的CD3/CD4杂合物与CD28单克隆抗体结合后，能够显著地驱动T细胞通过细胞周期，在刺激后的最初三天内，使相当一部分的细胞进入第二周期。与此相反，单独用CD3抗体或CD3/CD3或CD4/CD4同合物不能诱导显著的细胞周期过渡。
另外还发现，CD3/CD4杂合物可对T细胞表面的CD3和CD4抗原进行调节，使得CD4的表面表达下降。此结果表明，杂合物的作用不是简单地将T细胞受体固定于T细胞表面，而以前的研究表明，使用固定化的CD3抗体时情况正是如此(J.A.Ledbetter等人，J.Immunol.，同上)。
用CD3/CD4杂合物得到的结果证实，T细胞表面的CD4抗原在CD4+辅助T细胞通过CD3/Ti受体复合物和CD4抗原间的物理作用而活化T细胞时，对于信号转导起着积极的阳性作用。
还不十分清楚CD3/CD4杂合物何以能够增大信号转导作用的分子机理。CD4与CD3/Ti相互作用的至少一个效应似乎是提高肌醇磷酸的产生，这提示CD4可能促进CD3/Ti诱导的对膜上磷酸肌醇的水解，从而导致肌醇三磷酸的产生。我们的实验数据支持这一论点，实验结果表明，使细胞与可溶性CD4单克隆抗体反应，能够抑制CD3/CD4杂合物产生肌醇磷酸的活性。此抑制作用可能是抗体诱导CD4和CD3/Ti解离的结果，如果单独的CD3/Ti作为信号转导者效率较低的话。另一种可能是，CD4与其抗体的独立作用可能传递一种抑制肌醇磷酸产生的阴性信号。
由于肌醇三磷酸(InsP3)的产生据信是介导了T细胞中胞质钙的动员，所以CD4与CD3/Ti的相互作用也似乎能促进从胞内储藏物中释放钙。在〔Ca2+〕的动员中，CD3/CD4杂合物与CD3抗体的剂量应答曲线的比较表明，如果CD4和CD3/Ti在邻近同时受到刺激(即通过使用CD3/CD4杂合物)，则T细胞上的受体比单独刺激CD3/Ti时少得多，受体间的相互作用也可产生可测出的〔Ca2+〕应答(见图3)。因此，本发明CD3/CD4杂合物的性质之一是能够在低水平的受体条件下活化T细胞。
由于已知肌醇磷酸生成和钙的动员都是与T细胞活化相关的信号，能导致T细胞增殖，因此，本文给出的数据清楚地证实，无论作用机理如何，本发明的CD3/CD4杂合物可用于增强T细胞的活化和增殖。
本发明还包括其他类似于CD3/CD4杂合物的杂合物，它们具有在T细胞活化中增强信号传递的能力。例如，本发明的CD3/CD2杂合物、CD3/CD6杂合物、CD3/CD7杂合物、CD3/CD8杂合物也都具有提高的钙动员活性。另外，根据本发明，还构建了好几个含有CD5抗体的杂合物(如CD5/CD4杂合物、CD5/CD6杂合物和CD5/CD8杂合物)，它们在T细胞中也都具有提高的〔Ca2+〕动员活性。
在一个优选方案中例举了本发明的杂合物，它们掺入有能与CD45抗原或其同形体反应的抗体，并可用于抑制淋巴细胞的活化和功能，或增强T细胞的活化和功能，在该方案中，使一种能与CD3抗原反应的抗体与一种能与CD45抗原反应的抗体结合，以形成本发明新的CD3/CD45杂合物。用此杂合物处理T细胞，导致取消了CD3介导的T细胞活化作用(跨膜信号)，这是通过胞内钙动员的显著降低表明的。
此外，利用单克隆使淋巴细胞的CD45受体与同一淋巴细胞上的另一CD受体交联，完成了对T细胞表面各种CD受体间相互作用的诱导，例如CD3、CD2、CD5或CD28、以及CD45受体。此交联作用导致消除了胞质游离钙浓度(〔Ca2+〕i)的上升，此上升是由于T细胞抗原共聚物的形成(通过细胞表面共同受体的交联而诱导)而产生的。由固定化CD3单克隆抗体的刺激而启动的T细胞增殖，受到固定于同样表面(但在溶液中不会)的CD45抗体或CD45R抗体的抑制。与此相似，T细胞分别受到CD2和CD28抗体刺激CD2和CD28受体后的增殖作用，受到与CD2抗体或CD28抗体交联的CD45抗体的抑制，但CD45抗体单独与细胞表面结合时不会抑制。这些结果提示，由与CD45或其同形物CD45R反应的抗体及与T细胞的CD抗原反应的抗体组成的杂合物可用于对细胞进行调节。
与此相反，通过T细胞上的CD4受体同聚物形成而诱导的〔Ca2+〕i上升，如果利用单克隆抗体使CD4受体与CD45受体交联，则会使此上升强烈增加。因此，由CD4抗体和能与T细胞上的CD45或同形物CD45R反应的抗体组成的新杂合物，也可用于增强所有CD4+细胞或由CD45同形物表达而限定的CD4细胞亚群落的T细胞功能。
本发明的杂合物可用于调节淋巴细胞，并因此可用于调节疾病状态下的细胞免疫应答，例如传染病、癌症、艾兹病和自身免疫疾病。这些杂合物尤其适用于调节T细胞缺陷或紊乱状况下的细胞免疫应答。
例如，已经证实在某些自身免疫疾病中CD45同形体的表达不正常(Rose等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA827389-7393，1985)。因此，本发明中含有至少一种与CD45受体或其同形物反应的分子的杂合物，可用于调节自身免疫疾病中的淋巴细胞功能。
此外，本发明的杂合物可用于增强获得性免疫缺损综合症(艾兹病)患者的免疫应答性。已经知道，CD4抗原是作为引起艾兹病的人免疫缺损病毒(HIV)的受体起作用的。在病毒对T细胞感染的过程中，相信CD4即是HIV的gp120被膜糖蛋白结合的受体(L.A.Lasky等人，Cell50975，1987;M.Kowalski等人，Science2371351，1987)。在HIV感染以后，细胞表面的CD4表达被降低，CD4mRNA的含量减少(J.A.Hoxie等人，“HIV感染细胞中T4(CD4)蛋白及mRNA合成的变化”，Science2341123-1127，1986)。这一点也是十分清楚的，即艾兹病患者对可溶性抗原的免疫应答性降低(H.C.Lane等人，“艾兹病患者免疫功能的定量分析”，NewEng.J.Med.31379-84，1985)。体外研究已经证实，纯化的HIVgp120能够抑制T细胞对促有丝分裂刺激的应答，此结果类似于我们用可溶性CD4单克隆抗体所见到的效应(D.L.Mann等人，J.Immunol.1382640-2644，1987，“HTLV-Ⅲ大被膜蛋白(gp120)抑制PHA诱导的淋巴细胞芽生”)。
因此可以认为，艾兹病患者的免疫抑制状况可能涉及HIV感染对CD4抗原表达的效应，即HIV感染后T细胞上的CD4被降低，这可能通过降低细胞的信号传递能力而影响免疫应答性，从而导致T细胞对抗原应答的活化作用降低。我们提到的结果支持这一模式，我们发现，CD3刺激的游离钙浓度的上升在HIV感染细胞中受到影响(G.P.Linette等人，“HIV-1感染的T细胞表现出通过CD3/抗原受体途径的选择性跨膜信号传递缺陷”，Science241573-576，1988)。这些观察提示，本发明的杂合物，尤其是CD3/CD4杂合物，可用于研究或治疗由HIV感染导致的T细胞功能缺损。
本发明还包括在离体或活体条件下，用本文公开的杂合物处理淋巴细胞的方法，以调节病理状态下的细胞免疫应答。
根据本发明的一个具体方案，杂合物能用于T细胞的离体活化中。此活饔每赏ü估醋曰颊叩腡淋巴细胞与至少一种本发明的杂合物接触而进行，从而使T细胞被活化，然后再重新输入原来的供体中(S.A.Rosenberg等人，“通过系统施用类淋巴细胞及白介素2对癌症进行免疫治疗”，J.Biol.Resp.Modif.35501-5511，1984)。此治疗法还可包括使T细胞与其他免疫调节剂进行离体的共保温或先保温。
根据可供选择的具体方案，杂合物可用来在活体中活化T细胞，即将杂合物注射给患者，也可以与其他试剂结合注射，例如白介素2(IL-2)、生长因子或刺激性抗体如CD5(E.A.Clark等人，“刺激性抗体对免疫应答的扩增”，Immunology Today 7267-270，1986)和CD28(见下面的实例1)。不论用何种治疗方法，都可使用含有抗体片段(如Fab或F(ab′)2)、嵌合抗体或双特异性抗体的杂合物。
本发明的杂合物还能利用常规方式进行活体施用，这些方式包括但不限于，静脉内、口服、皮下、腹腔内或淋巴内施用。优选静脉内施用。
本发明含有杂合物的药物组合物可以有多种剂量形式，它们包括但不限于，固体、半固体和液体剂量形式，例如片剂、丸剂、粉剂、溶液或悬浮液、栓剂、聚合物微胶囊或微载体、脂质体，以及可注射或可输注的溶液。优选形式根据施用方式和治疗应用而定。
含有杂合物的组合物中可包含本领域内公知的常规的药物上可接受的载体，例如血清蛋白如人血清清蛋白，缓冲物质如磷酸盐、水或盐或电解质。
对于本发明的含有杂合物的组合物来说，最有效的施用方式和剂量根据疾病的程度和阶段、患者的健康状况及对治疗的反应和主治医生的判断而定。因此，对于个别病人来说，杂合物的剂量应当滴定。然而，本发明杂合物的有效剂量范围可以是从大约1至大约100mg/m2。对于T细胞的离体处理来说，可以使用从大约200μg-2mg杂合物/109细胞的剂量。
此外，本发明的杂合物可用于涉及T细胞缺损或紊乱的患者中，以对给定T细胞表面抗原(如CD抗原)的受体功能进行诊断测定。利用本文给出的测量信号转导(见实例1)的钙检测法和合适的对照，通过使用本发明的特异杂合物，能够通过比较正常人和患者供体T细胞的活化作用，而测定CD功能的缺损。例如，本发明的CD3/CD4杂合物提高〔Ca2+〕i的动员，所用蛋白浓度却低于单独用可溶性CD3抗体观察到的。因此，在这些低剂量下，实际上是在测量CD4受体的功能。可溶性CD4抗体在这些剂量下阻断CD3/CD4杂合物的活性的能力即反映了这一点(见图2)。与此相似，以低剂量使用CD3/CD8杂合物，能够测量CD8受体的功能。因此在这些剂量下，杂合物能用来在各种病理状态下(例如癌症和自身免疫疾病)检测特异CD受体功能的缺损。另一可选择的方法是，可用本发明的任何杂合物以任何剂量进行钙检测法，只要同时进行合适的信号抗体对照检测就行，也就是说，必须使杂合物的活性与组成该杂合物的未结合抗体的活性进行比较(E.L.Reinherz等人的欧洲专利申请221，768号，1987年5月13日出版)。
为了使本文描述的发明得到更完整的理解，给出下述实例。应当理解，这些实例的唯一目的是进行解释，而不是为了用它们以任何方式限制本发明的范围。
实例1下述实例描述了本发明新的杂合物的制备和特征。根据本方案，使一种与CD3反应的抗体与一种与CD4反应的抗体相交联，以形成新的CD3/CD4杂合物，它在用此杂合物处理的CD4+(即辅助)T细胞的活化过程中，增强跨膜的信号传递。
本发明CD3/CD4杂合物的制备用以形成本方案杂合物的CD3和CD4抗体分别是G19-4(Balb/c，IgG1)和G17-2(Balb/c，IgG1)。这些抗体根据现有技术制备(J.A.Ledbetter和E.Clark，“扁桃体生发中心和套区B细胞亚类的表面表型及功能”，HumanImmunology1530-43，1986;J.A.Ledbetter等人，“一种具有CD4抗原特异性的免疫球蛋白轻链二聚体”，MolecularImmunology241255-1261，1987)。此外，从商业途径可得可用于构建本方案杂合物的其他CD3和CD4单克隆抗体(例如，T3，CoulterCo.，FL和Leu-3，BectonDickinson，CA)。G19-4和G17-2抗体从腹水中通过盐沉淀和DEAE层析纯化，然后透析，使用前通过0.45μ滤器过滤。
两种单克隆抗体以1∶1的摩尔比例用杂双功能交联剂GMBS(Calbiochem，LaJolla，CA)和5-亚氨基硫烷(5-iminothiolane)盐酸(PierceChemicalCo.，Rockford，IL)结合，所用方法如R.R.Hardy(同上)为了藻红素偶联所述。产生的杂合物通过Superose6(pharmacia，Uppsala，Sweden)FPLC大小排阻层析从游离抗体中分离出来，并测定它与CD3和CD4的反应性，即测定它阻断荧光素结合的CD3和CD4单克隆抗体的结合的能力。这种CD3/CD4杂合物命名为G19-4/G17-2。本发明的CD3/CD4杂合物对钙动员的增强然后测定G19-4/G17-2杂合物增强细胞中胞质钙动员的能力，并与单独用G19-4(CD3抗体)的活性比较。所用细胞是人外周血淋巴细胞，通过在Ficoll-Hypaque上离心从外周血中纯化，然后使其粘附于塑料上以除去大部分单核细胞。
根据以前由P.S.Rabinovitch等人所述的方法(“用PHA或CD3抗体促有丝分裂后T细胞之间的胞内游离钙应答的不均一性。同时应用Indo-1和用流式细胞光度术法的免疫荧光”，J.Immunol.137952-961，1986;此文作为本申请的参考文献)，利用indo-1(Molecular Probes，Eugene，OR)和50HH/2150型流式细胞光度仪(Ortho Diagnostic Systems，Inc.，Westwood，MA)测量细胞中的〔Ca2+〕i上升。简单地说，首先使细胞(5×107/ml)装上indo-1，即使细胞与其能透过细胞膜的乙酰氧基甲基酯(Molecular Probes，Junction City，OR)保温，它在细胞内被水解成不能透膜的形式。保温于37℃进行45分钟，所用基质中含有所标明的indo-1浓度。然后洗涤细胞，再以2.5×106/ml悬浮于新鲜基质中，分析前于室温下保存在暗中。对于每一个检测，用基质将装有indo-1的细胞稀释至1×106/ml，并在37℃下平衡。根据Rabinovitch所述(同上)，利用荧光分光光度法和流式细胞光度术进行测量。通过计算indo-1紫/蓝荧光比例对时间的均值而分析柱形图。此外，还分析应答细胞对时间的百分比，即首先确定indo-1比例的数值，此数值两倍于对照细胞比例的标准误差，然后用此阈值之上的细胞百分比对时间作图。在所有的流式细胞光度术数据中，在X(时间)轴上有100个数据点。
如图1所示，提高Ca2+浓度(〔Ca2+〕i)所需的G19-4/G17-2的浓度，比单用G19-4所需的浓度低1.5-2个数量级。进一步，G19-4/G17-2杂合物的活性限制于CD4+T细胞，因为通过免疫荧光对CD4+细胞的富集导致相应的〔Ca2+〕i活性和应答细胞百分比的上升。这样，正如图2所证实，如果用G19-4/G17-2杂合物刺激外周血淋巴细胞，细胞的〔Ca2+〕i平均最高应答大约为1300nM，应答细胞大约有60%。然而，如果只分析CD4+细胞亚类，则〔Ca2+〕i平均最高应答大于10，000nM，应答细胞多于95%。进一步，如果在-5分钟时用5μg/mlG17-2(CD4抗体)对细胞进行预处理，然后用0.4μg/ml杂合物处理，则杂合物对于CD4+细胞的活性几乎被完全抑制。
如图2中的插图所示，通过CD8阴性、CD11阴性、CD16阴性和CD20阴性细胞的选通作用对CD4+细胞进行分析。对CD4+细胞的这种阴性选择通过用下列物质对外周血淋巴细胞染色进行即藻红素(PE)结合的ZH7，一种能与CD20反应的单克隆抗体(E.A.Clark等人，“BP35细胞表面多肽在人B细胞活化中的作用”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 821766-1770，1985)、FC-2，一种针对CD16的单克隆抗体(C.Anasetti等人，“通过绵羊红细胞结合蛋白(CD2)和Fc-受体(CD16)的交联诱导天然杀伤细胞的钙流量和溶胞活性的增强”，J.Immunol.1391772-1779，1987)、G10-1，一种针对CD8的单克隆抗体(J.A.Ledbetter等人，“人胸腺类白血病抗原和CD8分子间的共价结合”，J.Immunol.1344250-4254，1985)、60.1，一种能与CD11反应的单克隆抗体(J.P.Bunyon等人，“LFA族α和β链上的决定簇在中性白细胞聚集(如讨论会所定义的单克隆抗体)中的不同参与”，《白细胞分类Ⅲ》，同前，844-47页)，并通过未染色细胞选通，该细胞的CD4阳性大于95%。
在5mMEGTA〔乙二醇双乙胺醚-N，N′四乙酸〕存在下，还对G19-4和G19-4和G17-2杂合物进行冉系味ǎ珽GTA能螯合并因此除去胞外钙，以观察受到杂合物影响的是否是来自胞质的钙动员。图3表明，在EGTA的存在下，G19-4/G17-2杂合物动员钙的能力上升了大约两个数量级。在胞外钙的存在下，终点滴定表明其活性大约也上升了两个数量级(数据未出示)。
为了排除负责CD3/CD4杂合物的〔Ca2+〕i效应的的CD3或CD4抗原结合效价，我们构建了CD3/CD3和CD4/CD4同合物与CD3/CD4杂合物比较。同合物根据上述CD3/CD4杂合物的方法构建，并分别命名为G19-4/G19-4和G17-2/G17-2。如下面的表1所示，CD3/CD3同合物或CD3/CD3与CD4/CD4同合物的混合物都不具有类似于CD3/CD4杂合物的〔Ca2+〕i增加效应。此结果提示，CD3/CD4杂合物的增强活性并不是杂合物的效价功能所致，因此，它有可能是从CD3和CD4分子的物理接近而导致的，这些抗原和杂合物相互作用时便会发生这种接近。进一步，在利用间接染色和流式细胞光度术进行的结合检测中，杂合物和同合物的活性略低于游离抗体(数据未出示)。因此，CD3/CD4杂合物的独特活性不大可能是由对于杂合物的第二特异性贡献的CD3结合亲和性的效应所致。
〔Ca2+〕i应答的检测如上所述，利用装有indo-1的外周血淋巴细胞，并用PE结合的抗CD20、抗CD8和抗CD16抗体染色。对未染色的细胞进行分析，其中包括大于95%的CD4+细胞。在刺激后的最初五分钟内即发生峰均值应答。
表1CD4+T细胞对于CD3/CD4杂合物及对CD3/CD3和CD4/CD4同合物的〔Ca2+〕应答刺激浓度峰均值基值上的升高ug/ml [Ca2+]i(nM)无-1301.0CD3/CD4杂合物1015，600120210，900830.44，140320.088106.2CD3/CD3同合物502，36018105594.323012.3CD4/CD4同合物1001301.0501301.0CD3/CD3同合物25+255904.5+5+52722.1CD4/CD4同合物1+12511.93本发明的CD3/CD4杂合物的肌醇磷酸合成效应因为T细胞中胞质钙的动员被认为是由肌醇三磷酸(InsP3)的产生介导的，我们用单独的CD3单克隆抗体或CD3/CD4杂合物刺激纯化的CD4+T细胞后，测量肌醇磷酸的上升。
根据C.H.June等人所述的方法(“涉及CD28途径的T细胞增殖与具环孢素抗性陌捉樗 基因表达相联系”，Mol，Cell Biol.74472-4481，1987)纯化CD4+T细胞。简而言之，通过实验室工作人员的白细胞分离(leukophoresis)而得到外周血淋巴细胞，然后通过Ficoll/Hypaque密度梯度离心。然后，用磁性小球的免疫吸附作用通过阴性选择分离T细胞中的CD4+亚类，在这之前首先用饱和量的合适的单克隆抗体包裹CD8+、CD11+、CD16+、CD14+和CD20+细胞(大部分抗体都已在前面提及，只是除了CD14单克隆抗体20.3以外，它是通过M.Kamoun等人的方法制备的“由单克隆抗体鉴别的人单核细胞-巨噬细胞分化抗原”，Clin.Immunology and Immunopathology 29181-195，1983)。此战略利用了外周血液中休止T淋巴细胞上CD4和CD8表面抗原的相互不重迭分布这一性质。细胞洗涤3次以除去未结合的抗体，然后与山羊抗小鼠免疫球蛋白包裹的磁性颗粒(Advanced Magnetics Institute，Cambridge，MA)保温，通过磁性分离除去小球包裹的细胞。一般说来，回收到大约500×106 CD4+T细胞，通过流式细胞光度术测定其中有多于98%的CD4+，通过非特异性酯酶染色测定含有少于0.1%的单核细胞。
然后使纯化的CD4+T细胞再以2-4×106细胞/ml悬浮于RPMI 1640中，其中补充有10%热失活的小牛血清(“基质”)，此血清中补充有4μg/ml PHA和40μCi/ml2〔3H〕-肌醇(37MBq/ml;Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)，于37℃下在含有5%CO2的空气中保温。72小时后，细胞洗涤3次，并以5×106细胞/ml再悬浮于补充有10mM LiCl的“基质”中。保温20分钟后，在0时加入最终浓度为1μg/ml的G19-4或G19-4/G17-2杂合物。然后，在不同的时间点，取出5×106细胞的样品，在Eppendorf 5414离心机中沉淀10秒钟。吸出基质以后，向细胞沉淀加入1ml冰冷的10%TCA(W/V)。通过900×g离心5分钟除去不溶物，然后用6倍体积的二乙醚萃取上清液，然后使之中和。利用甲酸盐形式的Dowex1-×8离子交换层析(100-200目)(Bio-Rad，Richmond，CA)分离〔3H〕-肌醇磷酸，在Bio-Safe 2(Research Products，Int.Mt.Prospect，IL)中通过液闪分光光度法进行定量。这种测量氚化肌醇磷酸的方法J.B.Imboden等人已有过记载(“T细胞抗原受体的跨膜信号传递”，同上;J.B.Imboden等人，“人T细胞克隆的抗原识别导致肌醇三磷酸的上升”，同上)。
如图4所证实，浓度为1μg/ml时，杂合物刺激肌醇磷酸1、2和3形成的显著上升，而单独的G19-4只导致肌醇磷酸1的少量上升。还给出了实验开始(t＝0)和结束(t＝10分钟)时，未刺激细胞中的氚化肌醇磷酸水平。
在另外的实验中(描绘于图5中)我们观察到，游离的针对CD4的单克隆抗体G17-2抑制由杂合物导致的肌醇磷酸应答。G17-2不抑制对于游离的CD3单克隆抗体G19-4的肌醇磷酸应答。根据这些实验，使CD4+T细胞在含有〔3H〕-肌醇(40μCi/ml)和PHA(4μg/ml)的基质中保温72小时，充分洗涤，然后再悬浮于加有10mM LiCl的基质中，于37℃保温20分钟。然后向选择的样品中加入G17-2(如J.W.Goding所述与生物素结合《单克隆抗体的原理及实践》230页，Academic Press，1983)。5分钟后，如标明的那样加入G19-4、G17-2、G19-4/G17-2杂合物和抗生物素蛋白，保温过程再继续10分钟。细胞样品(107细胞/样品)在10%TCA中溶解后，萃取〔3H〕-肌醇磷酸，如上述通过离子交换层析分离并进行定量。图5中描绘了两个独立的实验。图中显示了3份细胞样品均值的+/-幅度(标准误差)，并给出了以μg/ml单克隆抗体表示的最终浓度。
因此，这些实验数据不仅证实了本发明杂合物对肌醇磷酸生成的增强效应，还证实了针对CD4的可溶性抗体抑制此T细胞应答。这些结果因此提出，CD4抗原在刺激T细胞应答中起着重要作用。CD3/CD4杂合物在T细胞活化中的新活性已经发现，本发明的CD3/CD4杂合物在T细胞活化中具有新的功能活性，利用CD3/CD3和CD4/CD4同合物作为对照的增殖检测证实了这一点。在这些检测中，CD4+T细胞以4份重复的样品培养在平底96孔微量滴定板中，每孔5×104细胞，所用基质为含有5%热失活的小牛血清(Hyclone，Logan，UT)的RPMI 1640。CD4+细胞与G19-4(抗CD3)、G19-4/G19-4(CD3/CD3同合物)、G19-4/G17-2(CD3/CD4杂合物)或G17-2/G17-2(CD4/CD4同合物)一起培养3天，有或没有PMA(1μg/ml)或单克隆抗体9.3，一种能与T细胞表面CD28抗原反应的抗体〔(Balb/c×C57BL/6)FI，IgG2a〕(J.A.Hansen等人，“鉴别一种新的T细胞抗原和人淋巴细胞Ia抗原的单克隆抗体”，Immunogenetics 10247-52，1980)。所有抗体和结合物都以1μg/ml使用。在第3天用液闪计数器测定胸苷的掺入(平均cpm±标准误差)，在这之前，在3天培养的最后8小时用1μCi/孔的3H-胸苷(New England Nuclear Corp.，Boston，MA)刺激细胞。
如图6所示，纯化的CD4+T细胞单独与抗CD3试剂或单独与PMA培养时，没有观察到增殖。在PMA的存在下，所有含有针对CD3的单克隆抗体的抗体制剂都诱导出水平相当的〔3H〕-胸苷掺入，而CD4同合物不具有促有丝分裂的作用。然而，测定各种试剂与针对CD28的单克隆抗体9.3的协同作用时观察到有显著差别。只有CD3/CD4杂合物诱导出对于CD28抗体的应答性。以前的研究已经证明，虽然针对CD28的单克隆抗体使95%以上的T细胞在PMA存在下通过细胞周期，但CD28刺激对于纯化的T细胞并没有促有丝分裂的作用(C.H.June等人，Mol.Cell.Biol.，同上)。本发明所发现的纯化T细胞的CD28刺激与液相CD3抗体不具有共促有丝分裂的作用证实了以前的研究结果(A.Weiss等人，“在人T细胞活化中T3/抗原受体复合物和Tp44之间的协同作用”，J.Immunol.137819-825，1986)。
为了测定CD3/CD4杂合物和CD3/CD3同合物之间对于CD28刺激的差别究竟是定性的还是定量的，使CD4+T细胞与G19-4、G19-4/G17-2杂合物或G19-4/G19-4同合物以各种浓度一起保温，并加以PMA(1μg/ml)或抗CD28的单克隆抗体9.3(1μg/ml)。如图7所示，发现G19-4/G17-2杂合物即使在低至100μg/ml的浓度也与CD28刺激有完全的共促有丝分裂的作用，而CD3/CD3同合物在10μg/ml也没有促有丝分裂的作用。与此相反，细胞对PMA和CD3刺激的共促有丝分裂应答在所有测试的浓度都与CD3抗体结合物相似。进一步，动力学实验揭示，CD3/CD3同合物与CD3/CD4杂合物对于CD28刺激的差别并不是由于增殖的时间进程的漂移(数据未出示)。
因此，在增殖方面对可溶性CD3抗体似乎没有应答的CD4+T细胞，确实在针对CD28抗体的存在下通过增殖对本发明的CD3/CD4杂合物具有应答。
为了进一步检查CD3/CD4杂合物对T细胞增殖的效应，通过某种技术测定细胞周期的动力学，该技术能够区别受到刺激后的3个连续细胞周期中每一周期的细胞。用PE结合的CD 8、CD16和CD20抗体(参见前面)使细胞染色后，在Cytofluorograph 50HH型细胞分类仪(Ortho Diagnostic Systems，Inc.，Westwood，MA)上通过流式细胞光度术对CD4+T细胞分类。分选出阴性细胞，对分选的群落进行再分析发现它们有97%是CD4阳性。除了免疫荧光参数外，还测定进向分散和直角分散数据，并用于进行淋巴细胞群落的选通及排除单核细胞、碎片和死细胞。以2000细胞/秒的流速于20℃下对细胞进行分选。
分选的细胞以5×104细胞/孔和4份重复培养在圆底96孔微量滴板(Nunc，Kampstrip，Denmark)中。在培养物中加入5μg/ml的G19-4/G17-2杂合物或CD3或CD4的同合物，或加入10μg/ml的PHA。使细胞在补充有10FBS的RPMI 1640中生长，其中还存在有0.6μg/mlCD28单克隆抗体9.3，1.5×10-4M BrdU，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，以及5×10-5M2-巯基乙醇。37℃下(5%CO2)保温3天后，从孔中轻轻吸出培养基，并置换以0.2ml染色液，其中含有0.1M Tris pH7.4，0.9%NaCl，1mM CaCl2，1.0mM MgCl2，0.2%BSA，0.1%NP40和1μg/ml Hoechst 33258(Sigma)以及5μg/ml溴化乙锭EB(Calbiochem)。细胞于4℃保温30分钟，再悬浮，根据以前P.S.Rabinovitch所述的方法(“牛内皮细胞产生的异常稳定的纤维蛋白溶解抑制剂的检测”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802956-60，1983)，在连接有PDP11/03计算机(Digital Equipment，Maynard，MA)的ICP-22(Ortho Diagnostic Systems，Inc.)上进行流式细胞光度术。使用紫外光激发(UG1滤镜)，用Hoechst 33258在425-500nm处检测，在600nm以上检测荧光。分析大约3-4×103细胞的荧光，并作出Hoechst对EB荧光的二元变量柱图。根据P.S.Rabinovitch所报道的方法(同上)，通过分析和曲线配合确定单个细胞周期的分隔大小。
图8出示了通过第一、第二或第三细胞周期的细胞百分比。正如此图所证实，只有CD3/CD4杂合物能够显著驱动细胞通过细胞周期，因为用此杂合物刺激3天后，45%的细胞进入了S期或更后，39%的细胞进入了第二增殖周期。因此，在对于CD3/CD4杂合物及CD28抗体刺激的应答中，纯化CD4+细胞对3H-胸苷的掺入(如图6和图7所示)代表了明显的增殖应答，并继续进入第二和第三代中。与此相反，其他抗体制剂没有一种能够诱导显著的细胞周期转移(见图8)。图8还表明，与PHA加CD28抗体的对照相比较，CD3/CD4杂合物的刺激使45%的细胞作出应答，而对照中有70%的分选细胞在培养3天后进入S期。这表明用CD3/CD4杂合物刺激后，有大量的CD4+细胞继续其细胞周期。
CD3/CD4杂合物共同调节CD3和CD4T细胞抗原测量CD3/CD4杂合物、CD3或CD4同合物或单独的CD4或CD3抗体对T细胞表面CD3和CD4抗原的调节作用，即在有10μg/ml抗体或抗体结合物的存在下于37℃保温18小时后，测定CD4+T细胞表面的抗体或抗体结合物密度，使用具有抗小鼠Ig第二步的免疫荧光，在FACS Ⅳ型流式细胞光度仪上测量。结果示于下面的表2中，其中，密度表达为在线性标度上测定的超过背景的平均荧光强度的单位。
表2结合物的调节作用调节前的调节后的特异性表面密度表面密度调节百分比CD41504868CD4/CD4同合物2267567CD31779.095CD3/CD3同合物3401099CD3/CD4杂合物3691995如表中所指出，与针对CD3或CD3/CD3同合物的抗体保温过夜后产生的CD3表面表达几乎测不出，而与CD4或CD4/CD4同合物抗体作类似保温后，仍然保留有大量的表面CD4。然而，CD3/CD4杂合物导致CD3和CD4二者的调节作用，并似乎降低CD4的表面表达。这些检测中使用的所有抗体和结合物都是过量的，因为利用CD3或CD4单克隆抗体的直接荧光结合物时，在调节后检测不到细胞表面有游离的CD3或CD4抗原(即未被抗体结合)(数据未示出)。因此，本发明的CD3/CD4杂合物调节T细胞表面的CD3和CD4抗原，这表明杂合物不是象以前认为的与固定化的CD3抗体一样(J.A.Ledbetter等人，J.Immunol.，同上)，只是简单地将T细胞受体固定在细胞表面。进一步，用可溶性CD3抗体作的研究表明，如果CD3在细胞表面受到调节，则CD3/Ti受体被内化(O.W.Press等人，“针对人T细胞的蓖麻蛋白A链免疫毒素的评价”，CellularImmunol.10210-20，1986;O.W.Press等人，“正常和恶性T淋巴细胞对鼠抗人CD3单克隆抗体的内吞和降解”，CancerResearch482249-2257，1988)，这导致T细胞活化的抑制。本发明的杂合物也导致受体的内化，但T细胞活化仍被增强。
如本实例所证实，本发明的CD3/CD4杂合物在CD4+T细胞的活化中增高Ca2+动员和肌醇磷酸的产生。此外，在针对CD28的抗体存在下，杂合物还具有CD4+T细胞增殖中的新功能活性，从而在刺激后的最初3天内，驱动大量的细胞进入第二细胞周期。进一步，杂合物对于它与之反应的抗原似乎有共调节作用，因此支持了这一假设，它在T细胞活化中使这些抗原密切接近。
实例2本实例描述本发明其他杂合物的构建和特征，它们包括相互交联的能与CD3抗原反应的抗体和能与CDT细胞抗原反应的其他抗体中的任一种。
如实例1所述构建的抗体杂合物有a)CD3/CD2杂合物，包含单克隆抗体G19-4(抗CD3)(参考前面)和9.6(抗CD2)(P.J.Martin等人，“人T细胞表面蛋白Tp50上的两种不同抗原决定基的鉴别和功能特征”，J.Immunol.131180，1983);b)CD3/CD5杂合物，含有单克隆抗体G19-4和10.2(抗CD5)(P.J.Martin等人，“一种新的人T细胞分化抗原慢性淋巴白血病细胞上的意外表达”，Immunogenetics11429，1980;P.J.Martin等人，“识别正常人T淋巴细胞和恶性B淋巴细胞的单克隆抗体的比较研究”，J.Immunol.121920，1981);c)CD3/CD6杂合物，含有单克隆抗体G19-4和G3-6(抗CD6)，G3-6是IgG1同型的CD6单克隆抗体，用T白血病细胞系HSB2免疫Balb/c小鼠而产生。杂交瘤通过使小鼠脾细胞与NSI骨髓瘤系融合产生，通过与正常T细胞的结合和与CD6参考抗体12.1的交联筛选(P.J.Martin等人，J.Immunol，127，同上);d)CD3/CD7杂合物，含有单克隆抗体G19-4和G3-7(抗CD7)。G3-7是IgG1同型的CD7单克隆抗体，通过用T白血病细胞系HSB2免疫Balb/c小鼠生成。杂交瘤通过使小鼠脾细胞与NSI骨髓瘤系融合产生，并通过与正常T细胞的结合和与CD7参考抗体3A1的交联进行筛选，它可从美国典型培养物收集中心得到。此外，CD7单克隆抗体还可由商业上得到(BectonDickinson，Mountainview，CA)(E.L.Reinherz等人编《白细胞分类Ⅱ》第1卷3-30页，1986);e)CD3/CD8杂合物，含有单克隆抗体G19-4和G10-1(抗CD8)(参考前面);f)CD3/CD28杂合物，含有单克隆抗体G19-4和9.3(参见前面)。
如实例1所述，测定这些杂合物提高T细胞中胞质Ca2+动员的能力。每种杂合物以1μg/ml测试，在此浓度下单用CD3抗体的活性低于最佳值，但可检测到结合物的增强活性。用杂合物刺激细胞后的最初5分钟内，装有indo-1的外周血淋巴细胞发生〔Ca2+〕i的峰应答。未刺激的细胞具有130nM的〔Ca2+〕i。在使用CD3/CD4和CD3/CD8杂合物的实验中，分别对CD4+和CD8+T细胞亚类测量结合物的活性。下面的表3给出了这些杂合物在钙动员中的活性。
表3抗CD3杂合物在钙动员中的活性结合物峰[Ca2+](nM)CD3/CD3(G19-4/G19-4)186CD3/CD2(G19-4/9.6)2722CD3/CD4(G19-4/G17-2)3349CD3/CD5(G19-4/10.2)155CD3/CD6(G19-4/G3-6)836CD3/CD7(G19-4/G3-7)276CD3/CD8(G19-4/G10-1)2690CD3/CD28(G19-4/9.3)204如表3所指出，CD3/CD2、CD3/CD6、CD3/CD7和CD3/CD8杂合物(以及CD3/CD4杂合物)与未刺激或CD3/CD3刺激的细胞的活性相比较，在用这些杂合物处理的T细胞内钙动员显著上升。相信这些杂合物与实例1所述的CD3/CD4杂合物一样，通过使它们与之反应的不同抗原密切接近而起作用，导致增强的跨膜信号传递及T细胞活化。
实例3本实例描述本发明其他杂合物的构建和特征，它们含有相互交联的能与CD5T细胞表面抗原反应的抗体和其他CDT细胞抗原中的任何一种。
如实例1构建的这些抗体杂合物包括下列a)CD5/CD2杂合物，含有单克隆抗体10.2和9.6;b)CD5/CD28杂合物，含有单克隆抗体10.2和9.3;c)CD5/CD4杂合物，含有单克隆抗体10.2和G17-2;d)CD5/CD6杂合物，含有单克隆抗体10.2和G3-6;e)CD5/CD7杂合物，含有单克隆抗体10.2和G3-7，以及f)CD5/CD8杂合物，含有单克隆抗体10.2和G10-1。本具体方案中用来构建杂合物的所有单克隆抗体都已在前面论及。
这些杂合物也如实例1一样舛ㄋ窃赥细胞中增加胞质Ca2+动员的能力。这些实验的结果示于下面的表4中。表中指出了这些实验中所用每种杂合物的浓度。在刺激后的最初10分钟内，装有indo-1的外周血淋巴细胞发生〔Ca2+〕i的峰应答。未刺激细胞的〔Ca2+〕i为130nM。如表中所示，CD5/CD5同合物表现出的〔Ca2+〕i为180nM。CD5/CD4和CD5/CD8杂合物分别在CD4+和CD8+T细胞亚类上进行测试。
表4抗CD5杂合物在钙动员中的活性结合物峰[Ca2+]i(nM)CD5/CD5(10.2/10.2，20μg/ml)180CD5/CD2(10.2/9.6，20μg/ml)204CD5/CD28(10.2/9.3，10μg/ml)196CD5/CD4(10.2/G17-2，2μg/ml)640CD5/CD6(10.2/G3-6，2μg/ml)421CD5/CD7(10.2/G3-7，15μg/ml)178CD5/CD8(10.2/GIO-1，2μg/ml)546如表4所示，与未刺激或CD5/CD5刺激的细胞相比较，CD5/CD4、CD5/CD6和CD5/CD8杂合物在钙动员中表现出显著上升。相信这些杂合物与本文所述的其他杂合物一样，可用于增强T细胞的活化。
实例4在本实例中，T细胞表面的CD3和CD45抗原与能与CD3和CD45抗原反应的抗体组成的杂合物之间由单克隆抗体诱导的相互作用被用来研究这些过程对于T细胞活化的效应。
细胞制备如前述(Clark等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA821766-1770，1985;Clark等人，Hum.Immunol.16100-113，1986;两篇都作为本文的参考文献)制备外周血单核细胞和由外周血中制备不附着于尼龙棉的淋巴细胞。简而言之，如下述通过尼龙棉分离得到不附着于尼龙棉的淋巴细胞尼龙柱中(在Oncogen，Seattle，WA制备)装上含有5%小牛血清的RPMI基质，于37℃预保温45分钟后使用。将细胞上到柱中，使其流入柱中，然后于37℃保温45分钟。利用热基质从柱中收集6ml，以1200rpm离心8分钟两次，然后再悬浮于增殖缓冲液中(15%人AB血清)(大约1.5ml)。计数不附着的细胞，根据检测法中的应用调整其体积。
使用下述针对人白细胞标记的Balb/c小鼠单克隆抗体9.4(IgG2a)，CD45抗体(Cobold，同上);G1-15(IgG1)和3AC5(IgG2a)，CD45R抗体(Ledbetter，同上;Ladbetter等人，《免疫遗传学和组织相容性展望》，E.Heise编，ASHI，NewYork，325-340页);96.5(Brown等人，J.Immunol.127(2)639-546，1981)。由P.Beverley博士惠赠的UCHL-1(IgG1)，抗CD45(180形)(Smith，同上);G19-4(IgG1)，抗CD3(Ledbetter，同上);9.6，抗CD2(参见前面);9.3，抗CD28(参见前面)。用大鼠抗小鼠K特异性单克隆抗体187.1(Ware等人，J.Immunol.Meth.7493-104，1984)与小鼠单克隆抗体交联。单克隆抗体杂合物的制备单克隆抗体杂合物如上面实例1所述，以1∶1的摩尔比例用杂双功能交联剂GMBS(Calbiochem，La Jolla，CA)和5-氨基硫烷HCl(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)制备。更具体地说，使抗体(1mg/ml)在偶联缓冲液中透析过夜(0.1M Na2HPO4，7分子水的0.1M NaCl pH7.5)。结合物中的第一抗体通过搅拌加入氨基硫烷HCl盐(2-IT来自Pierce Chemical Co.，Rockford，IL;50μl(0.5mg)2-IT溶液(10mg/ml)在偶联缓冲液中)而巯基化(thiolated)。结合物的第二抗体用GMBS，5μl(14μg GMBS溶液(1mg在360μl二甲基甲酰胺(DMF)中)处理。溶液于室温下保温1小时。使抗体通过分开的用偶联缓冲液预平衡的PD-10柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。在总共排出2.6ml体积后，以双倍的初始体积收集固澹箍固寤旌希谑椅孪卤Ｎ 小时，通过加入1μl25mMβ-巯基乙醇(1μl560μl偶联缓冲液)于室温下保温15分钟而抑制反应。通过加入11μl(11μg)N-乙基马来亚酰胺(Sigma Chemical Co.，St.Louls，MO)(在DMF中配制成1mg/ml)终止此反应。
结合物在磷酸缓冲液(PBS)中透析过夜。如实例1所述，在Superose6FPLC上从游离抗体中分离出产生的CD3/CD45杂合物，它被命名为G19-4/9.4。
如前人所述(R.R.Hardy，《实验免疫学手册》，Weir等人编，BlackwellOxford.31.1-31.2页，1986，此公开作为本文的参考文献)，利用生物素琥珀酰亚胺(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)使单克隆抗体与生物素结合。佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和抗生物素蛋白得自SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO.重组白介素2(rIL2)购自Genzyme(Boston，MA)，用它促进某些检测中的增殖作用。
如实例1所述，利用106细胞/ml在200μl的微量滴定孔中通过〔3H〕胸苷(New England Nuclear;比活为27Ci/mmol;1ci＝37GBq)的掺入测量血液T细胞的增殖。更具体地说，对于增殖检测来说，如Ledbetter等人所述(J.Immunol.1351819-1825，1985;此文作为本申请的参考文献)培养单核细胞，简而言之，在Ficoll-Hypaque上通过密度离心由外周血液中分离出单核细胞，然而通过粘附于塑料以分开大部分单核细胞。细胞以2.5×105/ml用4份样品培养在96孔微量滴定板中(Falcon，Becton-Dickinson，Oxnard，CA)，孔中有含有青霉素、链霉素和15%人AB血清(Pel Freez，Brown Deer，WI)的RPMI基质。用分裂素植物凝血素(PHA;Wellcome Diagnostics，Greenville，NC)或偶联于Sepharose的抗CD3单克隆抗体(G19-4)刺激T细胞。培养3或4天以后，小孔用0.5μCi〔3H〕胸苷/孔(New England Nuclear，Boston，MA;6.7Ci/mmol比活)刺激6小时。然后利用细胞收集器将细胞收集于玻璃纤维滤器上，在液闪计数器中测量放射活性。在某些实验中，以25U/ml使用重组的IL2(rIL-2，Genzyme，Boston，MA)。在3天实验的最后6小时中测定〔3H〕胸苷的摄取，测试前以10μg/ml的单克隆抗体G19-4的对微量滴定板的小孔进行预覆盖。溶液中CD45单克隆抗体9.4的浓度是1μg/μl，将它以10mg/ml固定于微量滴定板上。以4份重复培养细胞并给出平均值。标准误差小于11%。
结果概括于表5中。
表5显示，与CD3抗体一起固化的CD45抗体抑制T细胞增殖超过75%，而溶液中的CD45抗体不抑制。即使在低于最佳浓度的PMA或外来rIL2的存在下，固定化CD45抗体的抑制效应仍是很明显的。
表5CD45在CD3刺激后调节T细胞增殖增殖(〔3H〕胸苷掺入，cpm×10-3)PMA溶液中的固化抗活化(1ng/ml)基质抗CD45CD45基质-0.30.40.3+0.50.50.4固化抗CD3-137.9143.532.3+204.3198.393.2+rIL-2(100单位/ml)-196.3183.967.1用CD3单克隆抗体(G19.4)刺激后，还用固化的CD3单克隆抗体和固化或溶液中的CD45R单克隆抗体(G1-15和3AC5)测量T细胞增殖。增殖测定的方法如上面对CD45抗体所述。所用的CD45R单克隆抗体G1-15和3AC5浓度在溶液中是1μg/ml，固定化时是10μg/ml。用针对黑素瘤抗原p97的IgG2a单克隆抗体96.5对照作为非反应对照，溶液浓度为1μg/ml，固化时为10μg/ml。表6给出了此实验的结果。
表6CD45在CD3刺激后调节T细胞增殖增殖(〔3H〕胸苷掺入，cpm×10-3)PMArIL-2活化基质(lng/ml)100U/ml基质0.10.50.4固定化抗CD3+基质143.6281.5291.8+0.-15抗-CD45R(溶液)137.5261.5309.4+3AC5抗-CD45R(溶液)177.8266.2294.6+96.5(溶液)147.9262.1312.4固定化抗CD3+G1-15抗-CD45R(固定化)0.10.70.6+3ACS抗-CD45R(固定化)10.168.295.5+86.5(固定化)154.4247.1280.4
当CD45R(3AC5)或CD45R(G1-15)单克隆抗体与抗CD3抗体一起固化时，抑制作用很明显，但如果CD45R在溶液中则不。而且，无论PMA或rIL-2都不能克服这种抑制作用。当针对黑素瘤抗原p97的单克隆抗体对照96.5与抗CD3抗体一起在溶液中或被固定时，不抑制作为对固定化CD3抗体的应答的增殖作用。
为了证实用固定化CD45单克隆抗体(9.4)观察到的抑制作用不是简单地由于从塑料表面取代了CD3单克隆抗体(G19-4)所致。用单独的抗CD3抗体、抗CD3加抗CD45抗体或抗CD3加对照单克隆抗体96.5涂复于微量滴定板的小孔上。用固定于微量滴定板孔中的CD3单克隆抗体G19-4刺激外周血单核细胞，即使其于室温下在磷酸缓冲液中保温2小时，所用浓度为4、8、16和32μg/ml，单独或与CD45单克隆抗体9.4一起保温，或与对照单克隆抗体96.5一起保温，它们的浓度都与CD3单克隆抗体相同。加入牛血清清蛋白使蛋白质进一步附着。用溶液中CD45单克隆抗体9.4的增殖作为对照。在有或没有1ng/ml PMA存在的情况下测量增殖作用。细胞以4份重复培养3天，最后6小时内用〔3H〕胸苷刺激。图9给出了这些实验的结果(给出了平均值，每点上平均值的标准误差小于15%)。
图9显示(a)用来涂复小孔的CD3抗体越多，则增殖越多，这与以前的报道是一致的(Geppert等人，J.Immunol.1381660-1666，1987);(b)CD45单克隆抗体9.4在所有浓度都导致大量抑制，但必须是固定化的;(c)用同型对照96.5单克隆抗体同时涂复时，基本上不导致抑制作用，表明CD45抗体的抑制不是取代CD3抗体的结果。在培养物中加入1ng/mlPMA，只有当涂复的单克隆抗体是4μg/ml或更低时才会逆转固定化CD45抗体的抑制作用，但在更高浓度时不行(图9B)。这一结果提示，在有PMA存在时，CD45抗体可能需要一临界浓度才能与塑料表面的CD3抗体密切接近，从而维持抑制作用。
用单克隆抗体9.3和9.6(在溶液中)分别刺激CD28和CD2，随后在第二步中用抗K单克隆抗体187.1进行交联，可以产生导致增殖的T细胞活化(Van Lier等人，Eur.J.Immunol.18167-175，1988;Ledbetter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 841384-1388，1987)。为了研究在此系统中CD45连接的效应，在有或没有交联的单克隆抗体187.1的CD28抗体或CD2抗体溶液中加入CD45抗体(Ware等人，同上)。如上述通过〔3H〕胸苷的摄入测量增殖。以每种1μg/ml的CD28单克隆抗体9.3和CD2单克隆抗体9.6进行活化。所用的CD45单克隆抗体9.4为1μg/ml，用抗K单克隆抗体187.1交联抗体，单克隆抗体187.1与小鼠单克隆抗体的最终比率为4∶1。在有或没有rIL-2的存在下(100单位/ml)测量增殖。表7给出了结果(每点平均值的标准误差小于12%)。
表7CD45在CD2和CD28刺激后调节T细胞增增殖(〔3H〕胸苷掺入，cpm×10-3)抗CD45+rIL-2单克隆抗抗单克隆抗刺激(100U/ml)基质体187.1CD45体187.1基质-0.20.31.60.4+6.84.237.62.5抗CD28-0.24.347.40.4+12.636.172.59.6抗CD2-0.50.212.70.2+4.47.037.34.0很明显，单独加入CD45抗体能够促进由CD2或CD28单克隆抗体(mAb)诱导的细胞增殖，而不需要有外源rIL2(表7)。在所有的情况下，加入rIL2即使在没有其他刺激的情况下也进一步扩大细胞增殖。这些现象也许是由于CD45连接对于IL2的高亲和性受体的表达的效应所致(Ledbetter，同上)。
与此相反，通过加入187.1抗KmAb而使CD45与CD2或CD28交联会逆转单独用CD45的促进效应，并在有或没有rIL2的存在下降低CD2或CD28的刺激作用(表7)。这并不是由于187.1的非特异性抑制活性，因为在没有包括进CD45mAb9.4时，187.1能增强CD28或CD2二者的刺激作用。
如果CD3、CD2和CD28被连接在细胞表面，则这些受体与信号转导途径相偶联，并因此导致〔Ca2+〕i的上升
(Ledbetter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 841384-1388，1987)。在使CD3、CD2或CD28受体在有或没有CD45mAb9.4存在下交联后测量〔Ca2+〕i(图10)。在此实验中，生物素结合的mAb结合于外周血T细胞上，然后通过加入抗生物素蛋白在细胞表面交联。测量装有indo-1(Molecular Probes，Junction City，OR)的外周血液单核T细胞中的〔Ca2+〕i上升，在这之前，先使T细胞上的受体如下述与抗CD45mAb9.4或抗CD45RmAb3AC5一道或一起交联(条件参考图10给出)1.在时间＝1.5分钟时，使CD3受体与生物素结合的抗CD3mAbG19.4(2μg/ml)交联，然后在时间＝5.5分时加入抗生物素蛋白(8μg/ml)(-)。将它与CD3受体在抗CD45mAb9.4(10μg/ml)(-)存在下的同样的交联相比较，或与生物素结合的抗CD45mAb9.4(10μg/ml)然后加入抗生物素蛋白(48μg)的同样的交联相比较(……)。还使用了另外一种对照，即生物素结合的抗CD45mAb9.4(10μg/ml)然后是抗生物素蛋白(40μg/ml)(-)(图10A)。
2.将25μg/ml抗CD3mAbG19.4的效应(-)与50μg/mlCD3/CD45杂合物(由抗CD3mAbG19-4和抗CD45mAb9.4组成)的效应(……)相比较(图10B);
3.CD2受体与时间＝-3分时加入的10μg/ml的生物素结合的抗CD2mAb9.6交联，然后在时间＝1.5分时加入40μg/ml抗生物素蛋白(-)(图10C);
4.使CD28受体与时间＝-3分时加入的10μg/ml生物素结合的抗CD28mAb9.3交联，然后在时间＝-3分时加入40μg/ml抗生物素蛋白(-)，通过在时间＝-3分时加入10μg/ml抗CD28mAb9.3和10μg/ml抗CD45mAb9.4，然后在时间＝1.5分时加入的80μg/ml抗生物素蛋白使CD28和CD45受体同时交联(……)，并将二者作一比较(图10D);
5.使CD4受体与在时间＝-3分时加入的10μg/ml生物素结合的抗CD4mAbG17-2交联，然后在时间＝1.5分时加入40μg/ml抗生物素蛋白(-)。将它与CD4和CD45受体的同时交联作一比较，此交联作用是通过在时间＝-3分时加入10μg/ml生物素结合的抗CD4mAbG17-2和10μg/ml生物素结合的抗CD45mAb9.4，然后在时间＝1.5分时加入80μg/ml抗生物素蛋白而完成的(……)。图中还出示了生物素结合的抗CD4mAbG17-2(10μg/ml)加抗CD45mAb9.4(10μg/ml)(未结合的)然后是时间＝1.5分时的抗生物素蛋白的比较(-·-)(图10E)。
图10A-E给出了这些实验的结果。
明显可见，在CD3、CD2和CD28交联之后观察到的〔Ca2+〕i上升受到生物素结合的9.4存在的抑制。如果9.4没有生物素化，并因此不与抗生物素蛋白交联，则仍可观察到抗CD3抗体诱导的钙动员有少量上升(图10A)。然而，完全的抑制似乎要求使CD45和CD3密切接近。进一步，即使用一种抗小鼠免疫球蛋白进行的免疫荧光检测证实，杂合物能够与细胞表面的两种受体结合(数据未出示)，以及25μg的CD3抗体能诱导很强的钙应答，但CD45和CD3抗体的杂合物仍不能直接提高〔Ca2+〕i(图10B)。CD45R(例如3AC5)mAb如果与能与细胞受体反应的mAb结合，则能够部分抑制〔Ca2+〕i应答，细胞受体有例如图10C说明的CD2。CD45RmAb产生的部分抑制可能反映了某些但并非所有T细胞上CD45R同形体的表达(Ledbetter，同上)。与对于CD3、CD2和CD28的抑制效应相反，CD45与CD4的连接比之CD4与自身交联时产生很强而且可重复的信号传递的增强(图10E)。这一现象的发生没有伴随应答细胞数目的上升，表明同样的CD4+细胞在CD45和CD4连接之后应答性更强。因此，CD45似乎不是向上就是向下调节跨膜的信号传递，这取决于它与之相互作用的受体。
CD45以前的研究提示，它的功能可能是向上或向下调节淋巴细胞活性(Ledbetter，同上;Harp，同上和Martorell，同上)。在增加IL-2的产生、IL-2受体的表达和T细胞增殖中，可溶性的针对CD45或CD45R的mAb与PHA或附着于小球的CD3抗体有共同促进作用。可溶性CD45抗体能与CD2或CD28mAb协同作用(表6)。这些共促效应只局限于CD4+细胞，而不表达CD4的CD8+细胞观察不到。这部分可能是由于这一事实，CD45对于CD4具有一种不同于它对其他细胞表面抗原(例如CD3或CD2)作用的独特效应;当CD45与CD4密切接近时，它加速并提高钙信号通过CD4的传递，但当偶联于CD3或CD2时则抑制信号的转导作用(图10)。
上述的实例4证实，CD45抗体的抑制效应最能在这样的条件下清楚地证实即使CD45置于与信号转导分子(例如T细胞受体CD2、CD3、CD5或CD28)密切接触的地方，这一点通过使用本发明的CD4/CD45杂合物得到了证实。抗CD45抗原的抗体能很早地作用于淋巴细胞的活化，抑制胞内游离钙的动员，通常在30-60秒内就能测出。通过使CD45受体与CD4受体接近也证实了CD45抗体的增强效应。这些结果提示，含有能与淋巴细胞上受体反应的分子的杂合物提供了一种可供选择的方法，以诱导受体间的相互作用，从而增强或抑制淋巴细胞(包括T细胞和B细胞)的活化和功能。
我们在前面已经提供了一些本发明的具体方案，但很显然，通过改变本发明的基本构成能够提供导致淋巴细胞活化作用增强的其他方案，例如，其他的淋巴细胞抗原杂合物结合物，或淋巴细胞功能的抑制。因此，应当认识到，本发明的范围由本申请的权利要求书确定，而不是由用以举例的特异具体方案所限定。
权利要求
1.一种可用于调节淋巴细胞的杂合物，它包括至少两种能与淋巴细胞上的抗原结合的分子，所述分子相互交联，每种分子都能与位于单个淋巴细胞表面的不同抗原反应。
2.一种可用于活化T淋巴细胞的抗体杂合物，它包括至少两种相互交联的抗体分子，每种抗体都能与位于T淋巴细胞表面的不同抗原反应。
3.权利要求1或2的杂合物，其中的抗原是T淋巴细胞表面的CD抗原。
4.权利要求1或2的杂合物，其中的抗原是B淋巴细胞表面的CD抗原。
5.权利要求1或2的杂合物，其中，杂合物的一种分子能与T细胞受体或与其结合的CD3抗原反应。
6.权利要求1或2的杂合物，其中，杂合物的一种分子能与CD5T细胞表面抗原反应。
7.权利要求1的杂合物，其中所述的分子是抗体。
8.一种CD3/CD4抗体杂合物。
9.抗体杂合物G19-4/G17-2。
10.由下列构成的一组中选择出的抗体杂合物CD3/CD2，CD3/CD6，CD3/CD7和CD3/CD8。
11.由下列构成的一组中选择出的抗体杂合物CD5/CD4，CD5/CD6和CD5/CD8。
12.权利要求1或2的杂合物，其中，杂合物的一种分子能与CD45抗原或其同形体反应。
13.抗体杂合物CD3/CD45。
14.抗体杂合物G19-4/9.4。
15.由下列构成的一组中选择出的抗体杂合物CD2/CD45，CD3/CD45和CD28/CD45。
16.由下列构成的一组中选择出的抗体杂合物CD2/CD45R，CD3/CD45R，CD4/CD45R和CD28/CD45R。
17.权利要求2或7的杂合物，其中的抗体由下列组成的一组中选出的抗体片段组成Fab和F(ab′)2片段。
18.权利要求2或7的抗体杂合物，其中的抗体是单克隆抗体。
19.权利要求2或7的杂合物，其中的抗体是嵌合抗体。
20.一种双特异性抗体，它具有与T淋巴细胞表面两种不同抗原结合的亲和性。
21.权利要求1的杂合物，其中所述的分子是能与淋巴细胞表面抗原反应的配体肽。
22.一种活化T淋巴细胞的方法，包括使淋巴细胞与至少一种权利要求2的杂合物接触。
23.一种调节T淋巴细胞和/或B淋巴细胞功能的方法，包括使淋巴细胞与权利要求1或2的杂合物接触。
24.根据权利要求23的调节T淋巴细胞和/或B淋巴细胞功能的方法，包括使淋巴细胞与含有至少一种抗体的杂合物接触，杂合物中至少有一种抗体能与CD45细胞表面抗原或CD45抗原的同形体反应。
25.一种治疗疾病的方法，它包括如下步骤(a)通过使淋巴细胞与至少一种权利要求1的杂合物接触而离体活化T淋巴细胞;b)将活化的淋巴细胞再输注入原来的供体中。
26.一种可用于治疗疾病的药物上可接受的组合物，它包括至少一种有效药物量的权利要求1或2的杂合物。
27.一种治疗疾病的方法，包括给患者施用至少一种药物有效量的权利要求22的组合物。
28.权利要求25或27的方法，其中的疾病是由下列构成的一组中选出的传染病、癌症、艾兹病和自身免疫疾病。
29.一种诊断患者CD受体功能缺损的方法，该患者患有与T细胞紊乱或功能缺失有关的疾病，该方法包括测量权利要求1或2的杂合物对于患者T淋巴细胞的钙动员活性，并将它与构成该杂合物组分的未结合抗体的活性相比较。
30.一种治疗自身免疫疾病的方法，包括施用权利要求8或12的杂合物，以选择性地调节T和B淋巴细胞的亚群落。
31.一种制备用于调节淋巴细胞的杂合物的方法，它包括使至少两种能与淋巴细胞上的抗原结合的分子相互交联，每种分子都能与单个淋巴细胞表面的不同抗原反应。
32.权利要求31的方法，其中能与所述分子反应的所述淋巴细胞为T淋巴细胞。
33.权利要求31的方法，其中的抗原是T淋巴细胞表面的CD抗原。
34.权利要求31的方法，其中的抗原是B淋巴细胞表面的CD抗原。
35.权利要求31的方法，其中，杂合物中的一种分子能与T细胞受体或与其结合的CD3抗原反应。
36.权利要求31的方法，其中，杂合物中的一种分子能与CD5T细胞表面抗原反应。
37.权利要求31的方法，其中所述分子是抗体。
38.权利要求31或32的方法，其中所述分子是能与CD3抗原反应的抗体和能与CD4抗原反应的抗体。
39.权利要求38的方法，其中所述抗体是相互交联的抗体G19-4和抗体G17-2。
40.权利要求31的方法，其中所述分子是能与CD3抗原反应的抗体和能与由下列构成的一组中选出的抗原反应的抗体CD6，CD7和CD8抗原。
41.权利要求31的方法，其中所述抗体是能与CD5抗原反应的抗体和能与由下列构成的一组中选出的抗原反应的抗体CD4，CD6和CD8抗原。
42.权利要求31的方法，其中，一种分子能与CD45抗原或其同形体反应。
43.权利要求31的方法，其中，一种分子为由下列构成的一组中选出的抗体能与CD2、CD3、CD4和CD28抗原反应的抗体，而另一种分子为能与CD45抗原反应的抗体。
44.权利要求31的方法，其中，一种分子为由下列构成的一组中选出的抗体能与CD2、CD3、CD4和CD28抗原反应的抗体，而另一种分子为能与CD45R抗原反应的抗体。
45.前面权利要求的任何一项的方法，其中所述分子为单克隆抗体。
46.权利要求31的方法，其中的分子由下列组成的一组中选出的抗体片段组成Fab和F(ab′)2片段。
47.权利要求31的方法，其中的分子是嵌合抗体。
48.权利要求31的方法，其中的分子是能与淋巴细胞表面抗原反应的配体肽。
49.权利要求31的方法，其中所述的交联为化学交联。
50.权利要求49的方法，其中所述的化学交联是利用选自下列构成的一组中的试剂而进行的
全文摘要
本发明涉及新的抗体杂合物及其在增强或抑制T或B淋巴细胞中的应用。杂合物至少包括两种相互交联的分子，每种抗体能与同一细胞上不同的细胞表面抗原反应。杂合物的作用似乎是通过杂合物抗体与其不同的细胞表面抗原相互作用而与淋巴细胞结合，并使这些抗原在空间上相互接近，导致增强或降低淋巴细胞的活化和功能。本发明的杂合物、方法和组合物因此可用于调节淋巴细胞的功能，导致各种疾病状态下的细胞免疫应答的改善。
文档编号C07K16/00GK1036988SQ8910196
公开日1989年11月8日 申请日期1989年4月3日 优先权日1988年4月4日
发明者杰弗理·A·莱德贝特 申请人:翁科根公司