专利名称：抗猪传染性胃肠炎重组n蛋白杂交瘤细胞株的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物材料，具体地说是一种杂交瘤细胞株。
背景技术：
用杂交瘤细胞生产单克隆抗体(Monoclonal Antibody，McAb)是近些年来在免疫学和分子生物学领域中显著成就之一，自1975年Khle等报道了淋巴细胞杂交瘤技术以来，其理论和实用研究取得了惊人的进展。McAb纯度高、专一性强、重复性好且能在动物体外或体内产生同质性抗体，较常规的免疫学方法优越，为标准化提供了机会。单克隆抗体以其严格的识别特异性已渗透到TGE研究的许多领域，在TGEV抗原分析、TGEV结构蛋白功能及其作用机理、TGE诊断的研究等方面得到了广泛的应用。
猪群在产仔期间，仔猪TGE发病症状明显，损失也最大，当该病发生于育成猪、育肥猪和成年猪时，由于临床症状轻微，一般只有几天厌食或腹泻，常常得不到确诊，成为潜在传染源，而且目前没有有效而实用的治疗方法。可买到的商品疫苗交叉保护力不高(Bohl E.H.et al，1975；Moxley R A et al，1989；Saif L J et al，1990)。目前，包括我国在内的许多国家均有TGE流行的报道，TGEV给养猪业造成了严重的经济损失。
发明内容本发明的目的在于提供一种以生物技术手段纯化重组TGEV N蛋白，制备的抗猪传染性胃肠炎重组N蛋白杂交瘤细胞株。
本发明的目的是这样实现的以纯化的重组TGEV N蛋白免疫BALB/c小鼠制备诊断用单克隆抗体；取免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA方法进行筛选，经过3次克隆筛选，最终获得一株分泌抗重组TGEV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为E10F10D5，其染色体平均计数为87±10对，间接ELISA检测制备的腹水抗体效价达1∶12800。
本发明为能更好地对TGE进行疾病监测、及时做出准确诊断，尽可能减少经济损失，以生物技术手段纯化重组TGEV N蛋白，制备诊断抗原，建立检测抗体的Dot-ELISA检测方法，制备快诊膜，缩短检测时间；建立间接ELISA检测方法，检测TGEV感染和抗体效价测定，为建立标准化诊断试剂盒奠定基础；研制诊断抗体，制备抗TGEV N蛋白的杂交瘤细胞系，为建立快速检测病毒抗原的诊断方法奠定物质基础。并从整体上为检测我国是否存在PRCV奠定物质基础。
以全病毒为抗原对杂交瘤细胞(E10F10D5)产生的腹水进行Western-Blot及间接ELISA检测分析，结果均为阳性。证明制备的单克隆抗体可以识别天然TGEV N蛋白上的某一抗原位点。为建立诊断TGEV抗原的检测方法奠定了物质基础。
图1是SP/20细胞染色体记数；图2是E10F10D5细胞染色体记数；图3、4是杂交瘤细胞上清液与TGEV N蛋白进行的SDS-PAGE、Western-blot的结果；图3中1是纯化的重组N蛋白；2是TGE病毒；3是蛋白质标准分子量；图4中1是纯化的重组N蛋白；2是TGEV病毒。
(五)具体实施方案下面举例对本发明做更详细的描述本发明的猪传染性胃肠炎重组N蛋白是采用这样的方法纯化1融合蛋白的大量表达(1)接种已表达融合蛋白的大肠杆菌DH5α菌株于10ml LB/氨苄青霉素液体培养基，于37℃摇荡培养过夜；(2)转接10ml过夜培养物于500ml LB/氨苄青霉素液体培养基，于37℃摇荡培养至OD590值达0.5左右，取出1ml样品供电泳分析；(3)加入0.5ml 1mol/L IPTG至终浓度为0.6mmol/L，于37℃继续培养至OD值达1.0，终止培养，取出1ml样品供电泳分析。
2融合蛋白的纯化(1)向1.5cm×7.5cm层析柱中加入1mlNi2+-NTA凝胶介质，20ml去离子水洗柱后，再用20ml Buffer A溶液洗柱；(2)将菌液经10000g/min离心20min，去上清，沉淀的菌体用BufferA溶液10ml进行裂解菌体，溶解沉淀，室温搅拌1h后，4℃继续搅拌过夜；(3)将溶解物移至30ml离心管中，4℃条件下，以20000g/min离心40min，取上清留待上柱用；(4)将上清以0.5ml/min的流速加入到Ni-NTA柱中；收集流出液，进行SDS-PAGE分析；(5)依次使用20ml Buffer A、20ml Buffer B以0.5ml/min的流速洗涤，并收集流出液，SDS-PAGE分析；(6)用含有80mmol/L咪唑的Buffer C 10ml进行洗涤，收集洗脱液，在280nm的紫外线波长下，检测蛋白的吸收峰值，保存含有重组蛋白的洗脱液，短期保存的保存温度为4℃，长期保存的保存温度为-20℃。
以纯化的重组TGEV N蛋白免疫BALB/c小鼠制备诊断用单克隆抗体。取免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA方法进行筛选，经过3次克隆筛选，最终获得一株分泌抗重组TGEV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为E10F10D5，其染色体平均计数为87±10对，间接ELISA检测制备的腹水抗体效价达1∶12800。
3.诊断抗体(McAb)的制备及其免疫活性检测(1)免疫脾细胞取8～12周龄BALB/c小鼠3只用纯化的TGEVN蛋白加等量弗氏完全佐剂进行腹腔免疫，首免每只小鼠10ug；20天后加不完全佐剂免疫，剂量同前；15天后腹腔注射抗原，剂量同前；3天后杀鼠取脾细胞。
(2)细胞融合过程按常规方法融合，取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞以8∶1混合，用50％PEG3500作为融合剂，分别接种于96孔培养板中每孔100ul，置于37℃CO2培养箱中培养，第七天换成HT培养液培养。
(3)单抗筛选建立间接ELISA方法，用方阵滴定法确立最佳抗原包被量。细胞生长杂交瘤培养上清液用间接ELISA方法检测，同时用pPROEXHTb表达载体转化大肠杆菌表达产物做阴性对照。用有限稀释法对杂交瘤细胞进行多次克隆，直至筛选结果100％阳性为止。
(4)McAb免疫扩散试验以生理盐水配成1％琼脂，打孔封底后，中央孔加纯化N蛋白，周边孔分别加兔抗TGEV阳性血清、兔阴性血清及PBS对照，置湿盒孵育24～48h，观察结果。
(5)杂交瘤细胞的染色体检查将传代2-3天杂交瘤细胞和SP2/0细胞分别从培养箱中取出，向细胞瓶内加入20/ug/ml秋水仙素0.05ml使其终浓度为0.1ug/ml，继续培养2.5小时，使染色体停止在分裂中期。收集细胞，用10ml 0.075mol/LKCL溶液悬浮均匀，于37水浴低渗处理30min，加入1ml细胞固定液(3份甲醇+1份冰醋酸)欲固定2-3min，1000r/min离心5min，弃上清。细胞用新鲜固定液在室温固定20min，重复固定一次。加入1ml固定液制成悬液，垂滴1-2滴至洁净冷冻的载玻片上，自然干燥。用Giemsa染色液染色10min，蒸馏水冲洗，晾干。在显微镜下观察染色体的形态，各分别记数10个细胞的染色体数目。
(6)腹水的制备雌性BABL/c小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡/只，7天后腹腔注射2.5×106个杂交瘤细胞/只，观察小鼠状态，7-11天收集腹水，间接ELISA测其效价，-70℃保存。
(6)单克隆抗体部分特性的鉴定western-blot检测单克隆抗体，按常规方法。
4、结果(1)间接ELISA检测方法的建立经方阵试验测得TGEV重组N蛋白抗原包被浓度为5ug/孔，酶标羊抗鼠IgG的工作浓度为1∶2000，培养上清的作用时间为1h，底物显色时间为20min。
(2)细胞融合及筛选情况将骨髓瘤细胞SP2/0与免疫鼠脾细胞融合后，共接种了192孔，8～9d后有84孔有杂交瘤细胞生长，融合率为43.7％。用间接ELISA检测，从中选P/N值最高的杂交瘤细胞进行了3次再克隆，直至阳性率达100％。该细胞命名为E10F10D5。
(3)McAb免疫扩散试验琼扩试验表明，该株杂交瘤细胞E10F10D5分泌的抗体无免疫沉淀特性。
(4)间接ELISA测腹水效价达64000。
(5)杂交瘤细胞染色体记数SP2/0染色体平均记数45对，杂交瘤细胞E10F10D5染色体平均记数89对。见图1、2。
(6)单克隆抗体部分特性的鉴定杂交瘤细胞上清液与TGEV N蛋白进行的Western-blot，结果见图3、4。
本发明申请的杂交瘤细胞株的保藏日期为2005年3月23日，保藏编号CCTCC NOC 200502，分类命名抗猪传染性胃肠炎病毒核蛋白抗原的单克隆抗体细胞株，保藏单位及地址中国典型培养物保藏中心；中国.武汉.武汉大学。
权利要求
1.一种抗猪传染性胃肠炎重组N蛋白杂交瘤细胞株，其特征是以纯化的重组TGEV N蛋白免疫BALB/c小鼠制备诊断用单克隆抗体。取免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA方法进行筛选，经过3次克隆筛选，最终获得一株分泌抗重组TGEV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为E10F10D5，其染色体平均计数为87±10对，间接ELISA检测制备的腹水抗体效价达1∶12800。
全文摘要
本发明提供的是一种抗猪传染性胃肠炎重组N蛋白杂交瘤细胞株。以纯化的重组TGEV N蛋白免疫BALB/c小鼠制备诊断用单克隆抗体。取免疫脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA方法进行筛选，经过3次克隆筛选，最终获得一株分泌抗重组TGEV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为E10F10D5，其染色体平均计数为87±10对，间接ELISA检测制备的腹水抗体效价达1∶12800。本发明以生物技术手段纯化重组TGEV N蛋白，制备诊断抗原，建立检测抗体的Dot－ELISA检测方法，制备快诊膜，缩短检测时间；建立间接ELISA检测方法，检测TGEV感染和抗体效价测定，为建立标准化诊断试剂盒奠定基础；为建立快速检测病毒抗原的诊断方法奠定物质基础。
文档编号C12N5/18GK1740316SQ20051000988
公开日2006年3月1日 申请日期2005年4月8日 优先权日2005年4月8日
发明者李一经, 唐丽杰, 姜骞, 马广鹏, 田志军 申请人:东北农业大学