专利名称：喜树抗旱基因caGRP全长cDNA的克隆的制作方法
所属领域本发明涉及分子生物学、基因工程等领域，是一抗旱基因在新的抗旱物种发现，预知有更强的代谢调整和抗渗透胁迫功能，特别是抗旱功能。
背景技术：
地球上有三分之一以上的土地面积属于干旱和半干旱的地区，我国大约有一亿亩盐碱地，西北地区、东北地区的西部地区均列入干旱或盐碱地带。近年来，由于人口压力增大导致农牧交错带北移，干旱地区逐步扩大，天然林保护工程还难以发挥其生态效益，干旱仍然是我国农林作物产量的首要制约因素。由于干旱将使全球粮食产量降低10～20％，也使树木，特别是树木幼苗的生长受到严重威胁。同时，工业发展和人口的不断增加，人均耕地面积越来越少。因此，迫切需要在确保提高生态效益的前提下开发利用盐碱地和干旱地。由于常规育种速度较慢，研究植物的抗旱机理，应用分子生物学的方法克隆抗旱基因，运用基因工程技术培育耐旱植物新品种是利用盐碱地和干旱地、节约农林业用水的一条经济、快速、有效的途径。
抗旱途径多种多样。目前学术界一般认为，植物能够通过信号传递、渗透胁迫、代谢调整、脱水保护等多种机制来适应干旱胁迫。在植物受到轻度或中度干旱胁迫时，或受到短期的严重干旱胁迫时，低分子量渗透调节物如糖醇、亲水氨基酸、甜菜碱等，是增强植物对渗透胁迫的适应和耐受的主要机制。富甘氨酸RNA结合蛋白基因广泛存在于高等植物中，并可被干旱、冷冻、盐碱等多种渗透胁迫所诱导表达。该蛋白的抗旱能力主要体现在两个方面一是与RNA结合，调节其它代谢蛋白的表达，从而在渗透胁迫发生时通过代谢调整，特别是调节糖醇、脯氨酸、甜菜碱等渗透调节物质的合成，从而使植物在生理上适应干旱；二是其含有大量亲水的甘氨酸残基，有与晚期胚胎发生丰富蛋白(Late Embryogenesis Abundant Protein，LEA)相似的氨基酸组成特性，其形成亲水的α螺旋结构，扩大了与离子结合的表面积从而缓冲了因脱水使离子强度提高造成的细胞伤害。因此，caGRP具有较强的抗旱能力。
经检索未发现任何公开或报道过喜树caGRP cDNA片段或其基因及蛋白质序列。
发明内容
本发明的第一目的就是提供一种新抗旱基因-喜树caGRP基因cDNA的全长片段，该基因完整编码抗旱蛋白。
本发明的第二目的就是提供生产上述喜树caGRP基因cDNA全长片段的方法。
为了达到上述目的，本发明是一种分离出的喜树caGRP基因全长cDNA片段分子，其特征在于，它包括编码具有富甘氨酸RNA结合蛋白的功能区序列，其编码的氨基酸序列与基因库中另一典型抗旱植物长春花GRP(crGRP)的同源性为71.34％。
本发明的优点是1 抗旱基因的选择该基因在抗旱过程中具有以下优点所编码的富甘氨酸RNA结合蛋白作为抗旱蛋白，其与RNA结合，调节其它代谢蛋白的表达，从而在渗透胁迫发生时通过代谢调整，特别是调节糖醇、脯氨酸、甜菜碱等渗透调节物质的合成，从而使植物在生理上适应干旱；同时其含有大量亲水的甘氨酸残基，形成亲水的α螺旋结构，扩大了与离子结合的表面积从而缓冲了因脱水使离子强度提高造成的细胞伤害。因而，富甘氨酸RNA结合蛋白具有较强的抗旱能力，区别于其它基因单一调节的抗旱机制。
2 本cDNA片段的发现该cDNA片段是在构建喜树幼苗干旱胁迫cDNA文库时发现的全长表达序列，由于构建cDNA文库时采用了PCR方法，只有表达量较高的cDNA片段才能够容易地筛选到，这说明，在喜树幼苗干旱胁迫时该基因大量表达并通过其翻译产物发挥其抗旱功能。
3 本发明的另一优点在于，由于已经将该目的片段连接至pMD18-T载体上，其生产不需要再重复其繁杂的发现过程。
图1不同物种GRP蛋白的同源性比较图
具体实施例方式
下面结合附图对本发明的实施例作进一步详细描述。
由附图1可知，本发明包括编码具有富甘氨酸RNA结合蛋白的cDNA功能区序列，所述的核苷酸序列与基因库中长春花GRP(crGRP)的同源性为71.34％。所述的cDNA序列有384bp，其中无内含子序列，要求保护序列如下ATGGCCGCCGGGGTTGAATACAGATGCTTCGTCGGTGGGCTTGCCTGGGCCACCGATGATCAGTCACTCGAGAAGGCCTTCTCTCAGTTTGGTGAAATCCTCGAATCGAAGATCATCAATGATCGTGAAACTGGCAGATCGAGAGGGTTCGGATTCGTGACTTTCAAAGATGAGCAGTCCATGAGGGATGCCATCGAGGGTATGAACGGGCAGGATCTCGACGGTCGCAACATCACCGTCAACGAGGCCCAGTCCCGCGGCGGTGGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGCTTCCGCAGTGGCGGTGGACGTGACCGTGGGTATGACGGTGGATCGCGCTACTCGAGGGGAGGTGGTGCTTCTGATGGAAACTGGAGGAACTAG该cDNA片段可编码127个氨基酸。载体包含权利要求1所述的cDNA片段。所述的载体转化的宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli xl-blue菌株。
实施例1一种产生新cDNA片段-喜树caGRP cDNA片段的方法(1)采用水饱和酚法提取喜树幼苗叶片总RNA。
(2)采用Oligotex mRNA Kits(QIAGEN)法分离mRNA。
(3)Superscipt II-RT合成第一链，采用Promega试剂合成第二链并对双链cDNA末端补平，加接EcoRI adaptor，并对双链cDNA末端磷酸化及XhoI酶切，采用QIAEXII GEL Extraction Kit回收试剂盒回收cDNA。
(4)制备及提取pMD18-T载体，并与cDNA双链连接。
(5)制备电转化感受态细胞，连接产物纯化后电转化感受态细胞。
(6)对质粒快速鉴定并对菌落进行PCR反应，对菌落PCR检测合格的文库进行测序。
(7)对测序结果进行相似性分析，从而鉴定出该cDNA片段。
实施例2一种生产喜树caGRP质粒的方法(1)用caGRP质粒电转化感受态细胞。
(2)感受态细胞培养形成菌落以大量培养目的质粒。
(3)质粒纯化以用于转化目标植物。
实施例3喜树caGRP cDNA片段的序列信息及同源性与功能分析以下部分为喜树caGRP的序列ATGGCCGCCGGGGTTGAATACAGATGCTTCGTCGGTGGGCTTGCCTGGGCCACCGATGATCAGTCACTCGAGAAGGCCTTCTCTCAGTTTGGTGAAATCCTCGAATCGAAGATCATCAATGATCGTGAAACTGGCAGATCGAGAGGGTTCGGATTCGTGACTTTCAAAGATGAGCAGTCCATGAGGGATGCCATCGAGGGTATGAACGGGCAGGATCTCGACGGTCGCAACATCACCGTCAACGAGGCCCAGTCCCGCGGCGGTGGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGCTTCCGCAGTGGCGGTGGACGTGACCGTGGGTATGACGGTGGATCGCGCTACTCGAGGGGAGGTGGTGCTTCTGATGGAAACTGGAGGAACTAG对应的翻译区为MAAGVEYRCFVGGLAWATDDQSLEKAFSQFGEILESKIINDRETGRSRGFGFVTFKDEQSMRDAIEGMNGQDLDGRNITVNEAQSRGGGGGGGGGGGFRSGGGRDRGYDGGSRYSRGGGASDGNWRN
喜树caGRP cDNA片段翻译为蛋白质后其氨基酸序列与长春花crGRP序列匹配如附图1所示。该序列与长春花GRP(crGRP)的同源性为71.34％。该序列包含一个富甘酸结构域(第87-123个氨基酸)和一个RNA结合域(第7-85个氨基酸)，其理论等电点为5.17，理论分子量为13358.38Da，氨基酸组成中24.41％为亲水性的甘氨酸。预测其亚细胞定位为细胞核内，且为非跨膜蛋白，并预测其有一个大的α螺旋区。
本发明采取cDNA文库方法从喜树中分离该cDNA片段，即从新的物种中分离该片段，因而具有创新性该片段的获取方法为喜树幼苗进行干旱胁迫后获取其大量表达的cDNA片段，且已有报道证明该基因可被多种渗透逆境所诱导并具有更强的抗旱、耐盐碱功能，有更新的实用价值。
权利要求
1一种分离出的喜树cDNA分子，其特征在于，它包括编码具有富甘氨酸RNA结合蛋白的功能区序列，所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列与基因库中另一典型抗旱植物长春花GRP(crGRP)的同源性为71.34％。
2权利要求1所述的分离出的喜树cDNA分子，其特征在于，所述的cDNA序列有384bp，其中没有内含子序列。要求保护序列如下ATGGCCGCCGGGGTTGAATACAGATGCTTCGTCGGTGGGCTTGCCTGGGCCACCGATGATCAGTCACTCGAGAAGGCCTTCTCTCAGTTTGGTGAAATCCTCGAATCGAAGATCATCAATGATCGTGAAACTGGCAGATCGAGAGGGTTCGGATTCGTGACTTTCAAAGATGAGCAGTCCATGAGGGATGCCATCGAGGGTATGAACGGGCAGGATCTCGACGGTCGCAACATCACCGTCAACGAGGCCCAGTCCCGCGGCGGTGGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGCTTCCGCAGTGGCGGTGGACGTGACCGTGGGTATGACGGTGGATCGCGCTACTCGAGGGGAGGTGGTGCTTCTGATGGAAACTGGAGGAACTAG
3按照权利要求1或2所述的分离出的喜树cDNA分子，其特征在于，其编码127个氨基酸。
4一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的cDNA分子。
5按照权利要求4所述的载体，其特征在于转化的宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli xl-blue菌株。
6生产该cDNA片段及其载体的方法，其特征在于(1)用caGRP质粒电转化感受态细胞。(2)感受态细胞培养形成菌落以大量培养目的质粒。(3)质粒纯化以用于转化目标植物。
全文摘要
本发明提供了一种新的抗旱基因喜树caGRP基因的cDNA全长片段，此cDNA全长片段包括编码具有富甘氨酸RNA结合蛋白(glycin－rich RNA－binding protein，GRP)的功能区序列，所述的核苷酸序列编码的蛋白质序列与基因库中与基因库中另一典型抗旱植物长春花GRP(crGRP)的同源性为71.34％。本发明还提供了该cDNA片段及其质粒的制备方法。该cDNA片段可用于近缘种，特别是喜树在干旱地区培育时的转基因育种需要。
文档编号C12N15/63GK1654655SQ200510009610
公开日2005年8月17日 申请日期2005年1月10日 优先权日2005年1月10日
发明者祖元刚, 于景华, 唐中华, 安志刚, 刘士刚, 王丽娟 申请人:东北林业大学, 祖元刚