专利名称：截短的vegf相关蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的截短形式的血管内皮生长因子(VEGF)相关蛋白质。特别是本发明涉及基本上不含有其它蛋白质的N-末端截短的VEGF相关蛋白质。这种截短的VEGF相关蛋白质可被用于体内和体外刺激血管生成。
本发明也涉及编码这种新的截短的VEGF相关蛋白质的核苷酸，含有这种核苷酸的细胞，组织和动物；使用这种核苷酸的治疗方法；和与上述所有内容相关的方法。
背景血管内皮生长因子(VEGF)，也被称作血管通透性因子(VPF)，是多种器官中的不同细胞类型产生的一族蛋白质，并以高度选择性的方式(几乎是专门地)刺激血管内皮细胞(Ferrara等，内分泌学评论，1318-32，(1992)的综述；Dvorak等，美国生理学杂志，1461029-39，1995；Thomas，生物化学杂志，271603-6，1996)。这些文献以及本文引用的其它文献全部引入本文作为参考。
当在细胞培养中检测时，VEGF具有强的促细胞分裂作用(Gospodarowicz等，美国科学院院刊，867311-15，1989)和趋化作用(Favard等，生物学细胞(Biol.Cell)731-6，1991)。此外，VEGF诱导纤溶酶原激活剂、纤溶酶原激活剂抑制剂、和纤溶酶原激活剂受体(Mandriota等，生物化学杂志2709709-16，1995；Pepper等，181902-06，1991)，以及胶原酶(Unemori等，细胞生理学杂志153557-62，1992)、调节生长中的毛细血管向组织中侵入的酶系统。VEGF也通过内皮细胞调节管状结构的形成，这是一个体外血管生成的例子(Nicosia等，美国生理学杂志，1451023-29，1994)。
在体内，VEGF诱导血管生成(Leung等，科学2461306-09，1989)和提高血管通透性(Senger等，科学219983-85，1983)。现已知VEGF是重要的毛细血管形成的生理调节剂。在器官生长中，它们参与正常的新的毛细血管的形成，包括胎儿生长(Peters等，美国科学院院刊908915-19，1993)，组织修复(Brown等，实验医学杂志1761375-79，1992)，月经周期，和怀孕(Jackson等，Placenta 15341-53，1994；Cullinanand Koos，内分泌学133829-37，1993；Kamat等，美国生理学杂志146157-65，1995)。在胎儿发育过程中，VEGF好像在血管从血岛的从头生成中起着重要的作用(Risau和Flamme，细胞发育生物学年度评论1173-92，1995)，这是在缺少一个单一的VEGF等位基因的胚胎中异常血管发育和致死性所证实的(Carmeliet等，自然380435-38，1996)。而且，VEGF与许多疾病的病理性血管生长特征相关，包括实体瘤(Potgens等，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 37657-70，1995)，视网膜病(Miller等，美国病理学杂志145574-84，1994Aiello等，N.Engl.J.Med.3311480-87，1994；Adamis等，美国眼科学杂志118445-50，1994)，牛皮癣(Detmar等，实验医学杂志1801141-46，1994)，和类风湿关节炎(Fava等，实验医学杂志180341-46，1994)。
VEGF表达是通过激素(Schweiki等，临床调查杂志912235-43，1993)生长因子(Thomas，生物化学杂志271603-06，1996)，和通过氧过少(Schweiki等，自然359843-45，1992，Levy等，生物化学杂志2712746-53，1996)调节的。氧过少条件下对VEGF的向上调节作为一种补偿机制特别重要，该机制通过诱导额外的毛细血管形成和导致血流增加提高组织的氧化能力。该机制被认为在肿瘤和视网膜病的病理性血管形成中起一份作用。但是，缺氧后VEGF表达的向上调节对组织修复也是必需的，例如，在表皮损伤的愈合中(Frank等，生物化学杂志27012607-613，1995)，冠状缺血(Banai等，心血管研究281176-79，1994；Hashimoto等，美国病理学杂志267H1948-H1954，1994)。
在血管缺血的动物模型中VEGF治疗性地诱导血管生成的能力已在兔慢性肢体局部缺血模型中得到证实，这是通过重复地进行肌肉注射或施用单个动脉内VEGF的剂团可提高旁系血管形成所证实的，这是通过测量局部缺血的后肢中血流量进行的(Pu等，循环88208-15，1993；Bauters等，美国生理学杂志267H1263-71，1994；Takeshita等，循环90[第二部分]，II-228-34，1994；Bauters等，血管外科杂志21314-25，1995；Bauters等，循环912802-09，1995；Takeshita等，临床调查杂志93662-70，1994)。在这一模型中，VEGF也显示出与碱性FGF协同作用改善局部缺血(Asahara等，循环92[增刊2]，II-365-71，1995)。据报道，VEGF也可加速气囊损伤的大鼠颈动脉内皮的修复，从而抑制下面的平滑肌层的病理性加厚，使腔直径和血流保持不变(Asahara等，循环912793-2801，1995)。VEGF也显示出在犬冠状动脉中诱导EDRF(产生于内皮的松弛因子(氧化氮))-依赖性松弛，从而可能通过与血管生成不相关的第二机制提高局部缺血区域的血流(Ku等，美国生理学杂志265H586-H592，1993)。这些数据结合在一起提供了VEGF对伤口愈合，局部缺血疾病和再狭窄具有治疗作用的证据。
VEGF家族由至少4个成员组成，VEGF-121，VEGF-165，VEGF-189，VEGF-206。最初被表征的VEGF是一种34-45kDa的糖基化的蛋白质，它由两个相同的165个氨基酸残基的亚基组成(Tischer等，生物化学生物物理学研究通讯1651198-1206，1989)。VEGF-165 cDNA编码一个191残基的氨基酸序列，它是由一个26残基的分泌信号肽序列和165残基的成熟蛋白亚基组成的，分泌信号肽序列在该蛋白质从细胞中分泌后被切除。VEGF强烈地与肝素结合，在残基115至159之间的强碱性序列被认为与此有关(
图1)(Thomas，生物化学杂志，271603-06(1996))。VEGF家族的其它成员为具有或长或短的同源二聚体，其长度为121，189和206残基(分别为VEGF-121，VEGF-189，和VEGF-206)(Tischer等，生物化学杂志26611947-54，1991；Park等，细胞的分子生物学41317-26(1993))。这4种形式的VEGF产生于VEGF基因的多达8个外显子的不同剪切(VEGF-121，外显子1-5，8；VEGF-165，外显子1-5，7，8；VEGF-189，外显子1-5，6a，7，8；VEGF-206，外显子1-5，6b，7，8(外显子6a和6b是指同一个外显子的两种不同的剪切形式))(Houck等，分子内分泌学，51806-14(1991))。VEGF序列含有8个保守的二硫键形成核心半胱氨酸残基。所有的VEGF基因编码指导蛋白质进入分泌途径的信号肽。但是，仅仅发现VEGF-121和-165可容易地被培养的细胞分泌，而VEGF-189和-206仍然与细胞外基质相关。这些VEGF形式具有一个额外的高碱性序列，相应于VEGF-189和-206中的残基115-139(基质靶击序列)，它赋予对细胞外基质的酸性组分的高度的亲和性(Thomas，生物化学杂志271603-06(1996))。
各种VEGF同种型的促细胞分裂活性根据每一个同种型而有所不同。例如，VEGF-121和VEGF-165对内皮细胞具有相似的促细胞分裂活性。但是，VEGF-189和VEGF-206仅具有微弱的促细胞分裂活性(Ferrara等，内分泌学评论1318-32，1992)。这些同种型活性的降低被归因于它们的强烈的与细胞和基质的亲和性，这是通过缺乏24残基的“基质靶击”序列的VEGF-206突变体的正常的促细胞分裂活性所证实，该“基质靶击”序列在VEGF-189和VEGF-206中均存在(图1中的残基115-139)(Ferrara等，内分泌学评论1318-32，1992)。
由血纤维蛋白溶酶产生的VEGF-165的N-末端片断(VEGF(1-110))与KDR受体的结合与VEGF-165和VEGF-121具有相同的亲和性，而C-末端VEGF片断(111-165)不具有结合活性(Keyt等，生物化学杂志2717788-95，1996)。令人感兴趣的是，在这一研究中，VEGF-121和VEGF-110的促细胞分裂活性与VEGF-165相比降低了约110倍，提示了VEGF-165的C-末端区域在VEGF同种型的生物学效力中的潜在作用。鉴于先前的显示VEGF-121和VEGF-165对内皮细胞生长具有相同效力的结果，这一发现的意义就不太清晰。而且，由于VEGF与KDR受体的功能性相互作用被认为至少部分依赖于细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖(Cohen等，生物化学杂志，27011322-26，1995；Tessler等，生物化学杂志，26912456-61，1994)，可以想象，结果的不同产生于各种实验系统的不同。在这一方面，还不清楚在多大程度上细胞表面硫酸肝素调节VEGF-121(缺乏肝素结合区域)和VEGF-165(具有肝素结合区域)的功能性相互作用(Tessler等，生物化学杂志26912456-61，1994；Cohen等，生物化学杂志，27011322-26，1995；Gitay-Goren等，生物化学杂志，2715519-23(1996))。VEGF与血小板来源的生长因子(PDGF)相关(Andersson等，生长因子12159-64，1995)。VEGF也与来源于胎盘生长因子(PlGF)基因，PlGF-129和PlGF-150，的蛋白质家族相关(Maglione等，美国科学院院刊，889267-71，1991；癌基因8925-31，1993)。最近已鉴定出几种额外的VEGF-相关的基因，并被命名为VEGF-B(也被称作VEGF-相关因子VRF-1)(Grimmond等，基因组研究，6122-29，1996；Olofsson等，美国科学院院刊，932567-81，1996)VRF-2(Grimmond等，基因组研究，6122-29，1996)，和VEGF-C(Joukov等，EMBO J，15290-98，1996；Lee等，美国科学院院刊，931988-92，1996)和VEGF-3(PCT申请第PCT/US95/07283号，1996年12月12日公开，
发明者皮特·波赫恩 申请人:科莱特诺医疗公司