分泌t-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种分泌Τ-2毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，还设及该细胞株分泌 的Τ-2毒素单克隆抗体，包含该抗体的免疫吸附剂、免疫亲和柱、试剂盒，W及利用该免疫 亲和柱提取纯化Τ-2毒素和ΗΤ-2毒素的方法。
【背景技术】
[0002] Τ-2毒素和ΗΤ-2毒素是由多种真菌，主要是Ξ线镶刀菌产生的单端抱霉締族化合 物（trichothecenes，TS)，ΗΤ-2毒素为Τ-2毒素的代谢产物。它们广泛分布于自然界，是常 见的污染田间作物和库存谷物的主要毒素，对人、畜危害较大。Τ-2和ΗΤ-2毒素主要作用 于细胞分裂旺盛的组织器官，如胸腺、骨髓、肝、脾、淋己结、生殖腺及胃肠粘膜等，抑制运些 器官细胞蛋白质和DNA合成。此外，还发现该毒素可引起淋己细胞中DNA单链的断裂。Τ-2 和ΗΤ-2毒素还可作用于氧化憐酸化的多个部位而引起线粒体呼吸抑制。1973年联合国粮 农组织（FA曲和世界卫生组织（W册）在日内瓦召开的联席会议上，把运类毒素同黄曲霉素 一样作为自然存在的最危险的食品污染源。
[0003] 目前，Τ-2毒素、ΗΤ-2毒素的检测方法主要有薄层层析法、酶联免疫法巧LISA)。
[0004] 薄层层析法，要接触大量的标准品，不利于实验者的健康，而且灵敏度很低。酶联 免疫法，只适用于定性检测，很容易出现假阳性和假阴性的现象。而免疫亲和层析-液相色 谱法是通过免疫亲和层析预处理样品分离提取待检物质，再用液相色谱法检测的方法，其 经济、快捷、精确、安全，但是制备得到分离提取待检物质的免疫亲和层析柱却并非易事，最 为关键的地方在于寻找同时有效结合T-2毒素、HT-2毒素的抗体。
[0005] 王雄等人（抗T-2毒素单克隆抗体的制备及鉴定，中国卫生检验杂志，2010年2 月，20 (2) :301-304)报道了一种T-2毒素的单抗。尽管该单抗与黄曲霉素无交叉反应，但 是其与HT-2毒素的交叉反应为65. 9%。因此，用于免疫亲和层析时，该抗体可W有效提取 T-2毒素，但无法有效提取HT-2毒素。同时，该单抗的效价仅为1:12000,与T-2毒素的结 合力不强，容易解离，导致最终的检测结果不准确。
[0006] 因此，目前需要一种与其他毒素不发生交叉反应，效价高，并且可W同时有效提取 T-2毒素与HT-2毒素的抗体。
【发明内容】
[0007] 为解决上述问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株是中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏的编号为CGMCCNO. 11181的杂交瘤细胞株。
[0008] 本发明杂交瘤细胞株，命名为抗T2毒素、HT-2毒素单克隆抗体细胞，于2015年8 月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，其简称为CGMCC，其地址 为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏号为：CGMCCNO. 11181。
[0009] 本发明还提供了一种T-2毒素单克隆抗体，该单克隆抗体是由上述的杂交瘤细胞 株制备得到的。
[0010] 本发明还提供了该免疫吸附剂包括固相载体和抗体，所述抗体包括本发明所述的 单克隆抗体。
[0011] 优选地，所述抗体还包括下述单克隆抗体中的任一种或多种：
[0012] 由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏的编号为CGMCCNO. 5504 的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体；
[0013] 由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏的编号为CGMCCNO. 5505 的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体；
[0014] 由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏的编号为CGMCCNO. 5506 的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体；
[0015] 由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏的编号为CGMCCNO. 9204 的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体。
[0016] 更优选地，所述抗体包括下述单克隆抗体：
[0017] 由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏的编号为CGMCCNO. 5504 的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体；
[0018] 由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏的编号为CGMCCNO. 5505 的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体；
[0019] 由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏的编号为CGMCCNO. 5506 的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体；
[0020] 由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏的编号为CGMCCNO. 9204 的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体。
[0021] 进一步优选地，所述抗体与固相载体是通过偶联方式结合的。
[0022] 本发明还提供了一种装载有上述免疫吸附剂的免疫亲和柱。
[0023] 本发明还提供了一种检测T-2毒素和HT-2毒素的试剂盒，它包括前述的单克隆抗 体、前述的免疫吸附剂或/和前述的免疫亲和柱。
[0024] 本发明还提供了一种提取T-2毒素和HT-2毒素方法，其特征在于：
[00幼 （1)取样品，通过前述的免疫亲和柱；
[002引 似洗涂，洗脱，得洗脱液，即可；所述洗脱中，优选的洗脱剂为甲醇。
[0027] 优选地，所述液体样品是饲料提取液样品。
[0028] 而本发明的制备得到的T-2毒素单抗，腹水效价比达到1:50000,相比现有的单 抗，具有更高的效价比，与抗原的结合能力强。同时，该单抗与T-2毒素的结合率为100%， 与HT-2毒素的结合率达到92. 8%，与其他多种抗原的交叉反应低于0. 1%。也就是说，本 发明单抗会特异性结合T-2毒素和HT-2毒素，而不会与其他物质结合。因此，W其制备为 免疫吸附剂，可W将T-2毒素和HT-2毒素从样品中准确分离出来。
[0029] 因此，在本发明提供的T-2毒素单抗的基础上，本发明的免疫亲和层析-液相色谱 法可W准确、高效、经济地检测许多商品中的T-2毒素和HT-2毒素。
[0030] 除此之外，在本发明的具体实施方案中，W本发明的单抗和已知的3-乙酷脱氧雪 腐镶刀菌締醇、黄曲霉毒素、髓曲霉毒素、玉米赤霉締酬单抗制备得到的免疫亲和柱，可W 结合液相色谱同时准确地检测样品中T-2毒素、HT-2毒素、3-乙酷脱氧雪腐镶刀菌締醇、黄 曲霉毒素B1、B2、G1、G2、髓曲霉毒素A和玉米赤霉締酬，进一步证明了本发明单抗能与T-2 毒素、HT-2毒素高效、特异结合，而不会结合其他毒素。
[0031] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0032] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0033] 图1为样品中3-乙酷脱氧雪腐镶刀菌締醇的色谱图。
[0034] 图2为样品中黄曲霉毒素B1，B2,化G2的色谱图。
[0035] 图3为样品中髓曲霉毒素A的色谱图。
[0036] 图4为样品中玉米赤霉締酬的色谱图。
[0037] 图5为样品中T-2毒素和HT-2毒素的色谱图。
【具体实施方式】
[0038] 抗3-乙酷脱氧雪腐镶刀菌締醇、黄曲霉毒素、髓曲霉毒素、玉米赤霉締酬单克隆 抗体的分别由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)的编号为CGMCC NO. 9204XGMCCNO. 5506XGMCCNO. 5505 和CGMCCNO. 5504 的杂交瘤细胞制备得到。上述 杂交瘤细胞株均已在专利201510002847. 8中公开，专利CN104707362A中公开。其相应 单抗的制备为本领域常规的制备方法。
[0039] 实施例1制备T-2毒素单克隆抗体
[0040] 1、动物免疫
[00川免疫动物为8周龄左右雌性BALB/c小鼠。分别将抗原T-2-BSA(北京中检维康生 物技术有限公司自制）免疫10只小鼠。取适量免疫原（lOOmg/只）加等量弗氏完全佐剂， 制成乳化剂进行免疫，共免疫4-6次，每次间隔2周。除最后一次免疫为腹腔注射外，其余 均为颈背部皮下多点注射。
[0042] 2、杂交瘤细胞的制备
[0043] ①骨髓瘤细胞的培养
[0044] SP2/0骨髓瘤细胞在含10%胎牛血清的完全培养液中进行培养。当细胞处于对数 生长期时，按1:3-1:10比例稀释，传代，一般每3-4天进行1次传代或扩大培养。处于对数 生长期的细胞应浑圆、透亮、大小均一、排列整齐、呈半致密分布。选取处于生长旺盛、形态 良好的对数生长期细胞供融合用。融合前24h将SP2/0细胞扩大培养。融合当天，选择处 于对数生长期的细胞，用移液管将细胞吹下，收集于50mL离屯、管中，100化pm离屯、lOmin，然 后用DMEM培养液重新悬浮，显微镜下计数并计算细胞成活率，大于90%者，可用于融合。
[0045] ②免疫脾细胞悬液的制备
[0046] 采用ELISA对血清效价和抑制水平测定后，选取效价高、抑制水平好的小鼠于最 后一次免疫后第Ξ天摘除眼球放血，并分离阳性血清作对照。