癌的检测方法及识别胰脏特异性的核糖核酸酶1的抗体的制作方法

癌的检测方法及识别胰脏特异性的核糖核酸酶1的抗体的制作方法
【专利摘要】制备在胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位没有结合糖链的情况下与该部位结合、在结合有N型糖链的情况下与该部位的结合被阻碍的单克隆抗体；另外，制备能够与该抗体同时地与相同胰脏特异性的RNase 1结合的单克隆抗体，使用它们，求出A与B的比，由此检测胰腺癌。A＝胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量。B＝胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位的量。
【专利说明】癌的检测方法及识别胰脏特异性的核糖核酸酶1的抗体

【技术领域】
[0001] 本发明涉及癌的检测方法及识别胰脏特异性的核糖核酸酶1的抗体。更详细而言 涉及，通过测定糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位是否结合糖链而进行癌的检测的方 法。

【背景技术】
[0002] 作为诊断初期阶段的癌的检测方法，优选将非侵入的来源于生物的试样例如血 液、尿等比较容易采集的体液作为被检体。作为现在的胰腺癌的诊断时所使用的血清标记 物，有：CA19-9、DUPAN-2等。然而，存在如下缺点：这些标记物的脏器特异性低、从遗传的理 由出发有该标记物不反应的情况等、不能成为决定性的确定诊断。
[0003] 作为核糖核酸酶家族之一的胰脏特异性的核糖核酸酶1 (以下，将核糖核酸酶1称 为"RNase 1"）为胰脏特异性地表达、并且被分泌至细胞外的体液中的糖蛋白。该蛋白质是 被翻译成包含156个氨基酸的肽（序列号1)，在分泌信号的去除、接受糖链修饰之后，成为 具有128个氨基酸的肽序列（序列号2)的成熟糖蛋白，从而被分泌至细胞外。能够进行N 型糖链修饰的部位、即有可能接受N型糖链修饰的氨基酸残基为序列号2中的第34位、第 76位、第88位的天冬酰胺残基。
[0004] 一直以来都在研究胰脏特异性的RNase 1，虽然报告了癌的表达、活性的变化等， 但没有实际临床应用的例子。1980年Doran等人报告了胰腺癌患者血清中的核糖核酸酶活 性增加（非专利文献1)，只有活性的记载，对于核糖核酸酶的分子种类没有限定。关于胰脏 特异性的RNase 1的糖链修饰，1994年报告了由健康人得到的核糖核酸酶，对于3处能够进 行糖链修饰的部位的各自的糖链附加的程度有所报告，但是对于与胰腺癌的关联性没有报 告（非专利文献2)。2000年，Fernandez-Salas等人报告了由源自胰腺癌的培养细胞分泌 的胰脏特异性的RNase 1的分子量大于由正常的胰脏得到的RNase 1的分子量，作为其理 由之一，指出了糖链修饰量的增加（非专利文献3)。进而，同一研究组在2003年和2007年， 发表了关于胰脏特异性的RNase 1的糖链修饰的报告，其中指出了由胰腺癌（Pancreatic cancer)患者的血清得到的胰脏特异性的RNase 1的N型糖链结构有变化，特别是明确了被 核心岩藻糖化的2条支链复合型糖链增加，胰脏特异性的RNase 1的分子量增加起因于附 加的糖链结构自身的分子量增加（非专利文献4、5)。然而，至今并没有将糖蛋白的能够进 行N型糖链修饰的部位的有无结合糖链与癌关联的报告。
[0005] 现有技术文献
[0006] 非专利文献
[0007] 非专利文献 I J. Clin. Pathol. 33,1212-13 (1980)
[0008] 非专利文献 2 :Biol. Chem. Hoppe Seyler 375, 357-63 (1994)
[0009] 非专利文献 3 :Eur J Biochem. 267,1484-1494(2000)
[0010] 非专利文献 4 :Glycobiology 13,227-244(2003)
[0011] 非专利文献 5 :Glycobiology 17,388-400(2007)


【发明内容】

[0012] 发明要解决的问是页
[0013] 本发明着眼于糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位，目的在于提供癌的检测方 法和识别胰脏特异性的RNase 1的抗体。
[0014] 用于解决问题的方案
[0015] 本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现：癌患者与健康人相 t匕，在胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位结合有糖链的情况增加，至此 完成了本发明。另外，本发明人等发现了与胰脏特异性的RNase 1特异地结合的抗体，即将 胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位作为抗原识别位点的一部分，在N 型糖链修饰的部位结合有糖链的情况下与胰脏特异性的RNase 1的结合被阻碍的抗体，至 此完成了本发明。
[0016] SP，本发明如下。
[0017] (1) 一种癌的检测方法，其特征在于，测定糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位 的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量。
[0018] (2)根据⑴所述的方法，其中，癌为胰腺癌。
[0019] (3)根据⑴或⑵所述的方法，其中，糖蛋白为胰脏特异性的RNase 1。
[0020] (4)根据⑵或⑶所述的方法，其中，胰腺癌患者与健康人相比，结合有N型糖链 的部位的量增加。
[0021] (5) -种癌的检测方法，其特征在于，求出下述A、B中的A与B的比。
[0022] A =糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合 N型糖链的部位的量
[0023] B =糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的量
[0024] (6)根据（5)所述的方法，其中，癌为胰腺癌。
[0025] (7)根据（5)或（6)所述的方法，其中，糖蛋白为胰脏特异性的RNase 1。
[0026] (8)根据上述（6)或（7)所述的方法，其为A=没有结合N型糖链的部位的量，胰 腺癌患者与健康人相比A/B的值减小的方法。
[0027] (9)根据上述（6)或（7)所述的方法，其为A=结合有N型糖链的部位的量，胰腺 癌患者与健康人相比A/B的值增大的方法。
[0028] (10)根据上述（7)?（9)中的任一项所述的方法，其为求出胰脏特异性的RNase 1的量、换算该值作为B的值的方法。
[0029] (11)根据⑴?（10)中的任一项所述的方法，其中，能够进行N型糖链修饰的部 位为选自序列号2所示的序列的第34位、第76位和第88位的1个以上的天冬酰胺残基。
[0030] (12)根据（11)所述的方法，其中，能够进行N型糖链修饰的部位为序列号2所示 的序列的第88位的天冬酰胺残基。
[0031] (13)根据（11)所述的方法，其中，能够进行N型糖链修饰的部位为序列号2所示 的序列的第76位的天冬酰胺残基。
[0032] (14)根据（11)所述的方法，其中，能够进行N型糖链修饰的部位为序列号2所示 的序列的第34位的天冬酰胺残基。
[0033] (15) -种单克隆抗体或其片段，其将胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链 修饰的部位作为抗原识别位点的一部分。
[0034] (16)根据（15)所述的单克隆抗体或其片段，其中，在胰脏特异性的RNasel的能够 进行N型糖链修饰的部位没有结合糖链的情况下，单克隆抗体或其片段与该部位结合；在 胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位结合有N型糖链的情况下，单克隆 抗体或其片段与该部位的结合被阻碍。
[0035] (17)根据（15)或（16)所述的单克隆抗体或其片段，其中，抗原识别位点为包含序 列号2所示的序列的第88位的天冬酰胺残基的区域。
[0036] (18) -种单克隆抗体或其片段，其特征在于，能够与上述（15)?（17)中的任一项 所述的单克隆抗体或其片段同时地结合于胰脏特异性的RNase 1。
[0037] (19)根据上述⑴?（14)中的任一项所述的方法，其中，使（a)上述的（15)? (17)中的任一项所述的单克隆抗体或其片段与试样接触，测定与（a)的单克隆抗体或其片 段形成了复合体的胰脏特异性的RNase 1。
[0038] (20)根据上述（19)所述的方法，其中，进一步使（b)上述（18)所述的单克隆抗体 或其片段与试样接触，测定与（a)和（b)的两种单克隆抗体或抗体片段形成了复合体的胰 脏特异性的RNase 1。
[0039] (21)根据上述（20)所述的方法，其包括：使试样与（a)或（b)的一者接触的第一 接触工序；和使第一接触工序中得到的物质与（a)或（b)的另一者接触的第二接触工序。
[0040] (22) -种药品，其特征在于，含有上述（15)?（17)中的任一项所述的单克隆抗体 或其片段。
[0041] (23)根据（1)?（14)中的任一项所述的方法，其中，通过质谱分析法求出糖蛋白 的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的 量。
[0042] (24)根据上述（23)所述的方法，其为通过质谱分析法测定糖蛋白的肽片段和/或 糖肽片段的质量的方法。
[0043] 以下，更详细地说明本发明。本发明为通过测定糖蛋白的能够进行N型糖链修饰 的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量从而检测癌的发明。此 时，测定糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的"部位"的量或没有 结合N型糖链的"部位"的量，而并非测定与能够进行N型糖链修饰的部位结合的"糖链"的 量。作为癌，没有特别的限定，特别是能够检测胰腺癌。
[0044] 对于作为测定对象的糖蛋白，没有特别的限定，优选为胰脏特异性的RNase 1。另 夕卜，其优选为来源于人的生物试样。通过将糖蛋白作为测定对象，能够特异地检测人的胰腺 癌。此时，胰腺癌患者与健康人相比，在能够进行N型糖链修饰的部位结合有N型糖链的情 况多，能够进行N型糖链修饰的部位中，结合有N型糖链的部位增加，因此能够将其作为指 标而检测胰腺癌。
[0045] 另外，本发明为一种癌的检测方法，其特征在于，求出下述A、B中的A与B的比。
[0046] A =糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合 N型糖链的部位的量
[0047] B =糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的量
[0048] 作为癌，没有特别的限定，特别是能够检测胰腺癌。对于作为测定对象的糖蛋白， 没有特别的限定，优选为胰脏特异性的RNase 1。
[0049] 另外，优选为A =没有结合N型糖链的部位的量，胰腺癌患者与健康人相比A/B值 减小的方法。另外，优选为A =结合有N型糖链部位的量，胰腺癌患者与健康人相比A/B值 增大的方法。
[0050] B =胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位的量的情况下，对于 其求出方法没有特别的限定，例如，可以求出胰脏特异性的RNase 1的量，换算该值而作为 B的值。具体而言，胰脏特异性的RNase 1，如前所述，具有3个能够进行N型糖链修饰的部 位（序列号2的第34位，第76位，第88位的天冬酰胺残基），所以测定作为测定对象的其 任一个或2个部位或者所有的部位的量时，与其相应地，B =胰脏特异性的RNase 1的能够 进行N型糖链修饰的部位的量也可以分别换算成胰脏特异性的RNase 1的量的1倍、2倍或 3倍。需要说明的是，胰脏特异性的RNase 1的量例如可以通过使用免疫学的测定法、质谱 分析的方法而求出。
[0051] 需要说明的是，胰脏特异性的RNase 1如前所述具有3个能够进行N型糖链修饰 的部位（序列号2的第34位，第76位，第88位的天冬酰胺残基）。其任一个或两个部位或 者所有的部位中，可以通过测定结合有N型糖链的部位的量或没有结合N型糖链的部位的 量，或者可以通过求出该量与胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位的量 的比而检测癌。特别是，作为能够进行N型糖链修饰的部位，如果对于序列号2的第88位 的天冬酰胺残基测定上述的量，则可见癌患者与健康人的这些值存在显著的差异，所以作 为癌的检测方法而优选。同样地，也优选针对序列号2的第76位或第34位的天冬酰胺残 基测定上述的量。
[0052] 另外，本发明为一种单克隆抗体或其片段，其将胰脏特异性的RNase 1的能够进 行N型糖链修饰的部位作为抗原识别位点的一部分。对于这样的单克隆抗体，例如，可以 将胰脏特异性的RNase 1或包含其能够进行N型糖链修饰的部位的附近的肽序列作为免 疫原，按照常规方法进行制作。另外，抗体的抗原特异性可以使用标准分析例如，ELISA或 FACS分析确定该抗体与抗原决定基的结合。另外，作为单克隆抗体的片段，可列举出：用各 种各样的酶将全部抗体消化而得到的Fab或F(ab'） 2片段等。这样的单克隆抗体或其片段 中，本发明中，特别优选在胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位没有结合 糖链的情况下与该部位结合，在结合有N型糖链的情况下与该部位的结合被阻碍。
[0053] 进而，这样的单克隆抗体或其片段中，本发明中，抗原识别位点优选为包含序列号 2所示的序列的第88位的天冬酰胺残基的区域。特别优选为将胰脏特异性的RNase 1的能 够进行糖链修饰的部位中位于羧基最末端侧的部位的氨基酸序列（序列号3)包含于识别 位点的一部分的单克隆抗体或其片段。作为这样的单克隆抗体，可列举出：本发明中制作的 抗人胰脏特异性的RNase 1单克隆抗体RrhRN0723。该单克隆抗体RrhRN0723的胰脏特异 性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位中，序列号2的第88位的天冬酰胺残基结合 有N型糖链的情况下，与胰脏特异性的RNase 1的结合被阻碍。
[0054] 另外，本发明为一种单克隆抗体或其片段，其特征在于，能够与将胰脏特异性的 RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位作为抗原识别位点的一部分的单克隆抗体或其片 段同时地结合于胰脏特异性的RNase 1。这样的单克隆抗体例如筛选如下的单克隆抗体即 可：将胰脏特异性的RNase 1作为免疫原、按照常规方法制作的、能够与识别上述的胰脏特 异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位的单克隆抗体或其片段同时地结合于胰脏 特异性的RNase。另外，单克隆抗体的片段，可列举出例如，用各种各样的酶将全部抗体消化 而得到的Fab或F(ab'） 2片段等。作为这样的单克隆抗体，可列举出：本发明中制作的抗人 胰脏特异性的RNase 1单克隆抗体MrhRN0614。该单克隆抗体MrhRN0614能够与前述的单 克隆抗体RrhRN0723同时地结合于胰脏特异性的RNase 1。
[0055] 本发明中，这样的单克隆抗体或其片段可以用碱性磷酸酶、过氧化物酶、生物素、 异硫氰酸荧光素等标记。
[0056] 另外，本发明为一种癌的检测方法，使（a)将胰脏特异性的RNase 1的能够进行N 型糖链修饰的部位作为抗原识别位点的一部分的单克隆抗体或其片段与试样接触，测定与 (a)的单克隆抗体或其片段形成复合体的胰脏特异性的RNase 1。作为这样的方法，可列举 出例如：竞争法、抗体芯片法（antibody array method)。
[0057] 另外，本发明为一种癌的检测方法，在上述（a)的单克隆抗体或其片段的基础上， 使作为（b)的能够与（a)同时地结合于胰脏特异性的RNase 1的单克隆抗体或其片段与 试样接触，测定与（a)和（b)的2种单克隆抗体或抗体片段形成复合体的、胰脏特异性的 RNase 1的能够进行糖链修饰的、结合有N型糖链的部位或没有结合的部位的量。此时，（a) 和（b)的单克隆抗体或其片段可以同时地与试样接触，但优选依次使之接触。依次使之接 触的情况下，包括：使试样与（a)或（b)的一者接触的第一接触工序；和，接着使第一接触 工序中得到的物质与（a)或（b)的另一者接触的第二接触工序。此时，优选在第一接触工序 中使试样与（b)接触，接着在第二接触工序中使其与（a)接触。作为（a)、(b)，可以使用前 述的本发明的单克隆抗体或其片段；特别是，作为（a)进而优选使用单克隆抗体RrhRN0723 或其片段，作为（b)进而优选使用单克隆抗体MrhRN0614或其片段。作为这样的方法，例如， 除了 ELISA法、EIA法之外，还可以通过液相色谱法、高效液相色谱法、免疫层析法等，分离 并测定形成的免疫复合体。
[0058] 这样，将胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位作为抗原识别位 点的一部分的单克隆抗体或其片段可以作为诊断药物等药品使用。
[0059] 本发明中，作为求出糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的、结合有N型糖链的部位或 没有结合N型糖链的部位的量的方法，没有特别的限定，可以为使用了如上述的免疫分析 的方法，也可以通过质谱分析法而求出。通过质谱分析法求出的情况下，例如用酶等分解 糖蛋白，用质谱分析器等测定得到的肽片段和/或糖肽片段的质量，由此能够求出糖蛋白 的能够进行N型糖链修饰的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量。使 用质谱分析器的方法中，作为由糖蛋白得到肽片段的方法，可列举出例如：如J. Pr〇teome Res. 3, 556-566 (2004)所报告那样，利用糖苷酶的一系列去除糖链的处理和利用内切型肽 酶的蛋白质的肽骨架的片段化。如果列举利用糖苷酶的一系列去除糖链的处理的一例，则 有如下方法：使用选自作为外切型糖苷酶的唾液酸酶、半乳糖苷酶、氨基己糖苷酶、甘露糖 苷酶、岩藻糖苷酶中的一种以上的酶、以及对于N型糖链的主干结构部分的壳二糖结构起 作用的内切型糖苷酶例如内切糖苷酶H等，使N-乙酰基葡萄糖胺的单糖结构残留于能够进 行N型糖链修饰的部位的天冬酰胺残基上。该方法中，由于N-乙酰基葡萄糖胺的单糖结构 残留于蛋白质的肽骨架上，所以通过任意的内切型肽酶处理而得到的片段中，由氨基酸序 列通过计算求出的推定分子量检测与N-乙酰基葡萄糖胺的分子量相应地质量增加了的糖 肽片段，由此能够判断特定的能够进行N型糖链修饰的部位中的糖链的附加状态。通过以 上所列举的方法分析胰脏特异性的RNase 1，由此能够通过质谱分析法确认糖链附加状态 的有无。
[0060] 发明的效果
[0061] 通过本发明，能够进行癌的检测、特别是胰腺癌的检测。另外，通过本发明，能够提 供将胰脏特异性的RNase 1的能够进行N型糖链修饰的部位作为抗原识别位点的一部分的 单克隆抗体、及能够与该单克隆抗体同时地结合于胰脏特异性的RNase 1的单克隆抗体。 使用这2种抗体，能够进行前述的癌的检测。

【专利附图】

【附图说明】
[0062] 图1为表示实施例2中测定抗人胰脏特异性的RNase 1抗体对于导入糖链修饰缺 失突变的抗原的结合性的结果的图。
[0063] 图2为表不实施例2中测定抗人胰脏特异性的RNase 1抗体对于导入氨基酸置换 突变的抗原的结合性的结果的图。
[0064] 图3为表不实施例2中对于导入糖链修饰缺失突变的抗原mOOl的糖链结合状态 进行分析的结果的图。
[0065] 图4为表示实施例2中对于各组分中的α -甲基甘露糖苷的浓度、与抗人胰脏特 异性的RNase 1抗体的结合性进行测定的结果的图。
[0066] 图5为表示实施例3中测定被检体中的糖链修饰胰脏特异性的RNase 1的结果的 图。
[0067] 图6为表示实施例3中胰腺癌与非胰腺癌的测定值的分布和2组间的显著性差异 的图。
[0068] 图7为表不实施例3中胰腺癌与非胰腺癌的ROC统计分析的结果的图。
[0069] 图8为表示实施例4中，用免疫印迹法（Western blot)研究抗人胰脏特异性的 RNase 1肽抗体的抗原识别性能的结果的图。
[0070] 图9为表示实施例4中，通过使用了抗人胰脏特异性的RNase 1肽抗体的免疫印 迹法，考察定健康人血清和胰腺癌患者血清中的胰脏特异性的RNasel的Asn88中有无糖链 结合的结果的图。
[0071] 图10为表示实施例5中，抗人胰脏特异性的RNase 1抗体RrhRNllll对于导入糖 链修饰缺失突变的抗原的结合性的结果的图。
[0072] 图11为表示实施例5中，由健康人和胰腺癌的RNase 1的测定值求出F3/t值和 G3/t值的结果的图。
[0073] 图12为表示实施例6中，通过使用了 RrhRN0723抗体的抗原固相竞争法测定竞争 抗原的稀释系列的结果的图。

【具体实施方式】
[0074] 实施例1
[0075] 实施例1抗体的制备
[0076] 免疫原的调制
[0077] 为了取得包含人胰脏特异性的RNase 1全长的多肽，在昆虫细胞中能够表达的 质粒载体中插入编码成熟型人胰脏特异性的RNase 1(序列号2)的基因序列，从而制 备表达质粒。详细地说，在昆虫细胞重组蛋白质表达用质粒即pIZ/V5His vector(Life Technologies Japan Ltd.)的多克隆位点从5'上游侧起依序插入编码人免疫球蛋白κ 链（kappa chain)的基因序列、编码His标记的基因序列、编码FLAG标记的基因序列、编 码人胰脏特异性的RNase 1的基因序列（序列号1)中去除了相当于作为信号肽的氨基 酸第1位至第28为止的84个核酸残基的基因的区域（序列号2)。对于所制备的表达 质粒pIZ-KFH-hRNase 1确认到重组体人胰脏特异性的RNase 1被分泌至培养基中，所 述重组体人胰脏特异性的RNase 1是通过对昆虫细胞株Sf9使用Cellfectin II (Life Technologies Japan Ltd.)实施基因导入而在N末端侧附加有人免疫球蛋白κ链而成的。 从培养上清中将被分泌至培养基中的蛋白质通过使用了抗人免疫球蛋白κ轻链抗体的亲 和纯化进行浓缩纯化，制成为免疫原。
[0078] 对免疫动物的免疫
[0079] 使用上述的免疫原对小鼠和大鼠实施免疫。详细而言,为对小鼠进行免疫的情况 下，将IOOyg的免疫原与弗氏完全佐剂（Complete Freund's adjuvant) -起，对6周龄 Balb/c雌小鼠腹腔进行给予,作为初次免疫。之后,在7天后、14天后、21天后、28天后、35 天后将免疫原100 μ g与弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant) -起进行腹腔 给予，作为追加免疫。进而，在42天后,将免疫原100 μ g与生理盐水一起进行腹腔给予,作 为最终免疫。对大鼠进行免疫的情况下，将100 μ g的免疫原与弗氏完全佐剂一起，对6周 龄WHY雌大鼠两后肢足垫进行给予,作为初次免疫。之后,在28天后将免疫原IOOyg与生 理盐水一起对后肢足垫进行给予，作为最终免疫。
[0080] 抗体产生杂交瘤的制备
[0081] 最终免疫3天后，由小鼠摘除脾脏，回收脾脏细胞。由大鼠摘除髂淋巴结（iliac lymph nodes)和鼠腹股沟淋巴结（inguinal lymph nodes),得到淋巴结细胞。使小鼠脾脏 细胞和大鼠淋巴结细胞分别与小鼠骨髓瘤细胞株通过电细胞融合法融合之后，用添加了次 黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的GIT培养基（和光纯药工业株式会社）接种至细胞培 养用96孔板，由此选择融合细胞。
[0082] 小鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体产生融合细胞株的选定
[0083] 小鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体产生融合细胞株如下选择：以融合细胞在培 养基中分泌的抗体对于重组体人胰脏特异性的RNase 1的反应性作为指标，利用ELISA法 进行筛选，从而选择。筛选中所使用的ELISA如下。向96孔微量滴定板（Greiner bio-one 制）的各孔中加入包含25ng的山羊抗人免疫球蛋白κ链抗体（Sigma-Aldrich Japan K.K.制）的磷酸缓冲液（50mM磷酸钠、150mM NaCl、pH7. 4)5(^1，在4°〇下固定16小时。 将这些孔用300μ 1的洗涤液（20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7. 4)洗涤3次之后，加入包 含3%85六的封闭溶液（3%85六，20禮1^8-!1(：1，15〇1111恥(：14!17.4)20(^1，在室温下放 置2小时进行封闭（抗人免疫球蛋白κ链抗体固相化板）。将各孔用300 μ 1的洗涤液洗 涤 3 次之后，加入用稀释液（l%BSA、20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0. 05%Tween-20、pH7. 4) 以0. 5 μ g/ml的方式稀释的重组体人胰脏特异性的RNase 1，在室温下放置I小时。将各 孔用包含30(^1的表面活性剂的洗涤液（20禮1^8-!1(：1，1501111恥(：1、0.05%了￥6611-20、 pH7. 4)洗涤3次之后，加入50 μ 1的融合细胞培养上清，在室温下放置1小时。接着，将各 孔用300 μ 1的包含表面活性剂的洗涤液洗涤3次之后，加入包含0. 01 μ g的用辣根过氧化 物酶（HRP)标记过的抗小鼠 IgG抗体（Rockland公司制）的稀释液50 μ 1，在室温下放置1 小时。最后，将各孔用300 μ 1的包含表面活性剂的洗涤液洗涤3次之后，添加50 μ 1的四 甲基联苯胺（TMB)溶液（KPL公司制），使之显色15分钟之后，添加 IM的磷酸溶液而停止反 应，测定450nm的吸光度。根据筛选的结果，得到产生对胰脏特异性的RNase 1表现出强的 亲和性的抗体的融合细胞。得到的融合细胞通过有限稀释法被单克隆化，得到单克隆抗体 MrhRN0614〇
[0084] 大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体产生融合细胞株的选定
[0085] 对于大鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗体产生融合细胞株，以融合细胞在培养基 中分泌的抗体对于来源于人胰腺癌细胞（Capanl)的胰脏特异性的RNase 1的反应性作为 指标，通过ELISA法进行筛选，从而选择。筛选中所使用的ELISA如下。向96孔微量滴定 板（Greiner bio-one制）的各孔中加入包含25ng的小鼠抗人胰脏特异性的RNase 1抗 体（MrhRN0614)的磷酸缓冲液（50mM磷酸钠、150mMNaCl、pH7. 4)50μ 1，在4°C下固定16小 时。将这些孔用300μ 1的洗涤液（20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7. 4)洗涤3次之后，力口 入包含 3%BSA 的封闭溶液（3%BSA，20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.4)200yl，在室温 下放置2小时进行封闭（抗人胰脏特异性的RNase 1抗体固相化板）。将各孔用300 μ 1的 洗涤液（20mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7. 4)洗涤 3 次之后，加入用稀释液（1% BSA、20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0. 05 % Tween-20、ρΗ7· 4)稀释至 2 倍的人胰腺癌细胞（Capanl) 的培养上清，在室温下放置1小时。将各孔用300 μ 1的包含表面活性剂的洗涤液（20mM Tris-HCl，150mM NaCl、0. 05% Tween-20、ρΗ7· 4)洗涤 3 次之后，加入 50μ 1 的融合细胞培 养上清，在室温下放置1小时。接着，将各孔用300 μ 1的包含表面活性剂的洗涤液洗涤3次 之后，加入包含0.01 μ g的被HRP标记过的抗大鼠 IgG抗体（American Qualex Antibodies 公司制）的稀释液50 μ 1，在室温下放置1小时。最后，将各孔用300 μ 1的包含表面活性剂 的洗涤液洗涤3次之后，添加50 μ 1的TMB溶液使之显色15分钟之后，添加 IM的磷酸溶液 而停止反应，测定450nm处的吸光度。根据筛选的结果，得到产生对胰脏特异性的RNase 1 表现出强的亲和性的抗体的融合细胞。得到的融合细胞通过有限稀释法被单克隆化，得到 单克隆抗体RrhRN0723。
[0086] 实施例2抗体的特异性测定
[0087] 利用哺乳动物表达系统的重组体人胰脏特异性的RNase 1的调制
[0088] 为了在哺乳动物细胞中取得包含人胰脏特异性的RNase 1全长的多肽，在 pcDNA3.1_mycHis载体（Life Technologies Japan Ltd.)中插入编码人胰脏特异性的 RNase 1的基因序列（序列号2)，制备表达载体。更详细而言，将用于免疫原的调制而制 备的昆虫细胞表达用质粒（pIZ-KFH-hRNase 1)的编码重组体蛋白质的基因序列部分通过 分子生物学的手法插入至pcDNA3. InycHis载体（Life Technologies Japan Ltd.)中， 从而制备pcDNA-KFH-hRNase 1。对于所制备的哺乳动物细胞用表达质粒确认到有重组体 人胰脏特异性的RNasel被分泌至培养基中；所述重组体人胰脏特异性的RNase 1是通过 对来源于中国仓鼠卵巢的培养细胞株（以下、CH0-K1株）使用Lipofectamine 2000 (Life Technologies Japan Ltd.)实施基因导入而在N末端侧附加有人免疫球蛋白κ链而成的。 从培养上清中将被分泌至培养基中的蛋白质通过使用了抗人免疫球蛋白κ轻链抗体的亲 和纯化进行浓缩纯化，得到重组体人胰脏特异性的RNasel。被纯化的重组体人胰脏特异性 的RNase 1供于用于明确抗体的特异性的实验中。
[0089] 糖链修饰缺失突变抗原的调制
[0090] 将前项制备的表达载体（pcDNA-KFH-hRNase 1)作为模板，用PCR突变导入法重复 导入氨基酸置换突变，制备表达导入了糖链修饰缺失突变的抗原的质粒。PCR突变导入法 中，使用 PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit(TAKARA BIO INC.)，按照附加的说明书进行实 施。详细而言，通过将能够进行N型糖链修饰的部位的共有序列（Asn-Xaa-Ser/Thr、Xaa是 指脯氨酸以外的氨基酸残基）的第3位的氨基酸残基置换成丝氨酸残基或苏氨酸残基以外 的氨基酸，从而制备表达糖链修饰缺失突变重组体人胰脏特异性的RNase 1的质粒（表1)。 对于所制备的导入了糖链修饰缺失突变的表达质粒，确认到有糖链修饰缺失突变重组体人 胰脏特异性的RNase 1被分泌至培养基中，所述糖链修饰缺失突变重组体人胰脏特异性的 RNase 1 是通过对 CH0-K1 株使用 Lipofectamine2000 (Life Technologies Japan Ltd.)实 施基因导入而在N末端侧附加有人免疫球蛋白κ链而成的。被分泌至培养基中的糖链修 饰缺失突变重组体人胰脏特异性的RNase 1供于用于明确抗体的特异性的实验中。
[0091] [表 1]
[0092]

【权利要求】
1. 一种癌的检测方法，其特征在于，测定糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的、结 合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，癌为胰腺癌。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，糖蛋白为胰脏特异性的核糖核酸酶1。
4. 根据权利要求2或3所述的方法，其中，胰腺癌患者与健康人相比，结合有N型糖链 的部位的量增加。
5. -种癌的检测方法，其特征在于，求出下述A、B中的A与B的比： A =糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型 糖链的部位的量， B =糖蛋白的能够进行N型糖链修饰的部位的量。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中，癌为胰腺癌。
7. 根据权利要求5或6所述的方法，其中，糖蛋白为胰脏特异性的核糖核酸酶1。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其为A =没有结合N型糖链的部位的量，胰腺癌患 者与健康人相比A/B的值减小的方法。
9. 根据权利要求6或7所述的方法，其为A =结合有N型糖链的部位的量，胰腺癌患者 与健康人相比A/B的值增大的方法。
10. 根据权利要求7?9中的任一项所述的方法，其为求出胰脏特异性的核糖核酸酶1 的量、换算该值作为B的值的方法。
11. 根据权利要求1?10中的任一项所述的方法，其中，能够进行N型糖链修饰的部位 为选自序列号2所示的序列的第34位、第76位和第88位的1个以上的天冬酰胺残基。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中，能够进行N型糖链修饰的部位为序列号2所示 的序列的第88位的天冬酰胺残基。
13. 根据权利要求11所述的方法，其中，能够进行N型糖链修饰的部位为序列号2所示 的序列的第76位的天冬酰胺残基。
14. 根据权利要求11所述的方法，其中，能够进行N型糖链修饰的部位为序列号2所示 的序列的第34位的天冬酰胺残基。
15. -种单克隆抗体或其片段，其将胰脏特异性的核糖核酸酶1的能够进行N型糖链修 饰的部位作为抗原识别位点的一部分。
16. 根据权利要求15所述的单克隆抗体或其片段，其中，在胰脏特异性的核糖核酸酶1 的能够进行N型糖链修饰的部位没有结合糖链的情况下，单克隆抗体或其片段与该部位结 合，在胰脏特异性的核糖核酸酶1的能够进行N型糖链修饰的部位结合有N型糖链的情况 下，单克隆抗体或其片段与该部位的结合被阻碍。
17. 根据权利要求15或16所述的单克隆抗体或其片段，其中，抗原识别位点为包含序 列号2所示的序列的第88位的天冬酰胺残基的区域。
18. -种单克隆抗体或其片段，其特征在于，能够与权利要求15?17中的任一项所述 的单克隆抗体或其片段同时地结合于胰脏特异性的核糖核酸酶1。
19. 根据权利要求1?14中的任一项所述的方法，其中，使（a)权利要求15?17中的 任一项所述的单克隆抗体或其片段与试样接触，测定与（a)的单克隆抗体或其片段形成了 复合体的胰脏特异性的核糖核酸酶1。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中，进一步使（b)权利要求18所述的单克隆抗体 或其片段与试样接触，测定与（a)和（b)的两种单克隆抗体或抗体片段形成了复合体的胰 脏特异性的核糖核酸酶1。
21. 根据权利要求20所述的方法，其包括：使试样与（a)或（b)的一者接触的第一接 触工序；和使第一接触工序中得到的物质与（a)或（b)的另一者接触的第二接触工序。
22. -种药品，其特征在于，含有权利要求15?17中的任一项所述的单克隆抗体或其 片段。
23. 根据权利要求1?14中的任一项所述的方法，其中，通过质谱分析法求出糖蛋白的 能够进行N型糖链修饰的部位的、结合有N型糖链的部位或没有结合N型糖链的部位的量。
24. 根据权利要求23所述的方法，其为通过质谱分析法测定糖蛋白的肽片段和/或糖 肽片段的质量的方法。
【文档编号】A61K39/395GK104364374SQ201380030868
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年6月10日 优先权日:2012年6月11日
【发明者】仲田大辅 申请人:东曹株式会社