抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体及其制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫技术领域，具体地说，涉及抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体及其制备与应用。
【背景技术】
[0002]中国大鲷(Andrias davidianus)，俗称娃娃鱼，是世界上现存最大的濒?危珍稀两栖动物，为我国所特有、被列为国家二级保护野生动物，具有重要的科研价值及药用和营养价值。由于人为捕猎和自然环境的改变等原因，野生大鲵数量急剧下降。基于保护和开发利用的目的，近年来大鲵的人工繁育与养殖在陕西、浙江、湖南、湖北、贵州等省份发展迅速，已经形成具有重大经济价值的产业。随着养殖规模的不断扩大，病害发生日渐严重，成为大鲵升级养殖的瓶颈。2010年，在陕西汉中、四川绵阳等地发生了大面积的大鲵感染死亡事件，给大鲵养殖业造成了巨大的经济损失。该病可在各种规格的养殖大鲵中发生，其死亡率可达90%以上。本实验室研宄人员从主要患病症状为四肢末端及背部皮肤溃疡、坏死的大鲵体内分离到病毒，并对该病毒的理化及生物学特性进行了研宄，基于感染试验、细胞培养和分子生物学检测等方法确定该病原为蛙病毒属成员，故根据分离对象将其暂时命名为大鱼兒虹彩病毒(Andrias davidianus ranavirus, ADRV)，定为ADRV 2010SX，并对该病毒株进行了全基因组测序，已经将测得的ADRV全基因序列提交到GenBank，登录号为KF033124。
[0003]大鲵虹彩病毒对大鲵幼体和成体都具有较强的感染性和致死性。成鲵除了冬眠期夕卜，在其它季节均可发病，幼鲵的死亡率高达100%，成鲵的死亡率达80%以上。幼鲵和成鲵的临床症状有所不同，成鲵主要表现为吻端溃疡、腹部和尾部两侧皮下出血、四肢肿胀且末端溃烂，内脏组织有出血点；幼鲵则主要表现为全身肿胀、腹部和内脏组织有出血点。
[0004]近年来，我国科研人员陆续从不同地区发病的大鲵体内分离到大鲵虹彩病毒，并对病毒的生物学特性、感染的病理学特征等进行了分析，同时建立了 PCR、环介导等温扩增(LAMP)、Taqman荧光PCR等分子生物学检测方法，可检测组织样品中的大鲵虹彩病毒。然而，尚未开展基于大鲵虹彩病毒抗原或抗体的免疫学检测方法。免疫学检测方法的建立对于大鲵虹彩病毒感染的流行病学调查、诊断及生态保护具有重要意义。因此，从维持我国大鲵养殖业持续健康发展、保护珍稀物种以及保障生态多样性出发，开展该病的免疫学检测技术研宄势在必行。
[0005]众所周知，抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称为多克隆抗体，简称多抗。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体，简称单抗。
[0006]与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单克隆抗体技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得及广泛的应用，促进了众多学科的发展。
[0007]由于大鲵虹彩病毒是大鲵疾病中首次分离到的病毒病原，也是中国有尾两栖类动物中首次分离到的虹彩病毒，目前国内针对该病原尚无任何免疫学检测技术。因此，本发明拟在大量增殖并纯化大鲵虹彩病毒的基础上制备其单克隆抗体，以期为该病酶联免疫吸附实验(ELISA)等检测方法的建立提供生物材料。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题是提供一种抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体、其制备方法及应用。
[0009]为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案:
[0010]本发明所提供的抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCCN0.9709的杂交瘤细胞株ADRV McAb 4C3分泌产生的。
[0011]本发明还提供了一种制备抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体的方法，包括以下步骤:利用蔗糖密度梯度离心纯化ADRV ;将纯化病毒粒子作为抗原免疫动物(如小鼠)，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(如SP2/0细胞)融合制备杂交瘤细胞，经筛选(例如采用间接ELISA对融合细胞进行筛选)获得可稳定分泌抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，然后通过体内或体外的方法制备单抗。例如，将杂交瘤细胞腹腔注射动物(如小鼠)，采集腹水，分离纯化单抗，或通过体外培养该杂交瘤细胞，收集分泌产生的单克隆抗体。
[0012]经筛选，本发明最终获得可分泌抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞ADRVMcAb 4C3(单克隆抗体命名为4C3)，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中科院微生物研宄所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC N0.9709，分类命名为“杂交瘤细胞”，保藏日期2014年9月29日。
[0013]该杂交瘤细胞可用体内或体外的方法大量制备抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体4C3。用亲和层析法纯化单克隆抗体4C3，使用Protein G-Sepharose亲和层析柱对单克隆抗体进行纯化。
[0014]本发明利用Western blot和间接免疫荧光试验对单克隆抗体4C3进行了免疫学鉴定。结果表明，制备的单克隆抗体4C3能够特异性识别ADRV。抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体4C3的成功制备，为大鲵虹彩病毒ELISA等检测方法的建立奠定了物质基础。
[0015]本发明采用了间接ELISA对制备的单克隆抗体进行了筛选。用纯化的病毒粒子包被ELISA板，5%脱脂奶封闭，PBS洗涤，然后加入含有ADRV单克隆抗体的上清液；经过一定时间反应后，洗去未结合的抗体；再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG ;以TMB为底物进行显色。用2M H2SO4终止反应后，通过酶标仪来检测结果。
[0016]本发明的优点在于:
[0017](一 )本发明提供的抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体4C3能够特异性识别大鲵虹彩病毒。
[0018](二)本发明提供的抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体4C3纯度高，专一性强，重复性好，且能保证大量供应。
[0019](三)本发明制备了大鲵虹彩病毒单克隆抗体4C3，为大鲵虹彩病毒ELISA等检测方法的建立提供了优选的生物材料。
【附图说明】
[0020]图1为本发明实施例1中纯化的大鲵虹彩病毒粒子电镜负染观察结果，图中标尺为 10nm0
[0021]图2为本发明实施例1中纯化的大鲵虹彩病毒SDS-PAGE分析结果；其中，I为蛋白质相对分子质量标准；2为纯化的大鲷虹彩病毒。
[0022]图3为本发明实施例4中单克隆抗体4C3与ADRV反应的Western blot分析结果；其中，I为蛋白质相对分子质量标准；2为纯化的大鲵虹彩病毒；3为ADRV 2010SX感染的BF-2细胞；4为EHNV感染的BF-2细胞；5为未感染的BF-2细胞。
[0023]图4为本发明实施例5中抗ADRV单克隆抗体4C3的间接免疫荧光分析结果；其中，A为ADRV 2010SX感染的BF-2细胞为未感染的BF-2细胞。
【具体实施方式】
[0024]为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0025]实施例1大鲵虹彩病毒的纯化
[0026]I病毒的增殖
[0027]本发明所使用的大鲷虹彩病毒(Andrias davidianus ranavirus, ADRV)，是由本实验室成员从患病大鲵体内分离到的，定为ADRV 2010SX，并对该病毒株进行了全基因组测序，已经将测得的ADRV全基因序列提交到GenBank，登录号为KF033124。
[0028]将BF-2细胞接种于底面积为75cm2细胞培养瓶中，待形成汇合的单层细胞后接毒，接毒量为0.2mL (病毒效价为16TCID5tl)，按常规方法培养病毒，约90%以上的BF-2细胞形成完全的CPE后，收集细胞及上清，_80°C冻存备用。
[0029]2病毒的超速离心
[0030]将上述感染ADRV的细胞混合液取出，反复冻融几次使细胞完全破裂。4°C，8000rpm离心30min，去细胞碎片，收集上清与36% (w/v)蔗糖垫底(4:1)，24000rpm，4°C离心 2h (Beckman, JS-24)，病毒沉淀用适量 TNE 缓冲液(50mM Tris - HCl, 150mM NaCl, ImMdisodium EDTA, pH 7.4)重悬，即为初步纯化病毒。悬液加到事先配好的30%、40%、50%和60% (w/v)的鹿糖梯度上。4°C，28000rpm离心2h (Beckman，SW41)。离心后，可见40%和50%蔗糖层之间出现乳白色的病毒条带。将病毒条带轻轻吸出，TNE缓冲液稀释。4°C，24000rpm离心2h。最后收集病毒，TN缓冲液重悬病毒，_80°C保存。利用Bradford法测定纯化病毒的浓度。
[0031]3电镜观察
[0032]吸取上述处理病毒液，滴加于覆盖有Formvar膜的铜网上，吸附5_10m