、病毒性出血性败血病毒(VHSV)、草鱼出血病病毒(GCRV)和流行性造血器官坏死病毒(EHNV)包被的ELISA板反应，鉴定单克隆抗体的特异性。结果显示单克隆抗体特异性好，仅与大鲵虹彩病毒发生反应，与其他水生动物病毒以及细胞均不发生反应。
[0097]实施例3抗大舰虹彩病毒单克隆抗体效价测定--ELISA检测
[0098]1、包被:以纯化的ADRV为检测抗原，包被浓度为I yg/ml，100yL/孔，4°C过夜，洗液洗涤3次。
[0099]2、封闭:加200 μ L/孔的封闭液，37 °C 2小时后，洗涤3次，拍干。置4 V冰箱保存备用O
[0100]3、加待测样品:
[0101]I)对于血清/抗体/腹水效价检测，第一个孔1:1000稀释，往下以1:2的梯度倍比稀释，37°C孵育30min，洗板4次，拍干。
[0102]2)对于细胞上清检测，吸取细胞上清lOOyL，加入对应的酶标板中，37°C孵育30min，洗板4次，拍干。
[0103]3)加二抗:取辣根酶标记的羊抗鼠IgG(IgG特异二抗)按1:5000倍稀释后，100 μ L/孔，37°C孵育20-30min，洗涤4次，拍干。
[0104]5、显色:按100 μ L/孔加入TMB底物显色液，37°C显色15_30min。
[0105]6、终止:加入终止液(2M H2SO4) 50 μ L/孔。
[0106]7、读数:以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于
2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。效价测定结果表明，单抗4C3的效价分别为和 1:200000。
[0107]注:a.筛选阳性细胞时，P/N>2.1的判别为阳性细胞；1〈P/N〈2.1的细胞孔加大包被浓度后再次检测，P/N>2.1的仍判为阳性。
[0108]b.单抗效价以P/N>2.1时杂交瘤细胞上清或纯化单抗的最大稀释倍数表示。
[0109]实施例4抗大鲷虹彩病毒单克隆抗体(4C3)的Western blot鉴定
[0110]I试验目的
[0111]验证单克隆抗体4C3能否与ADRV蛋白发生反应。
[0112]2试验材料
[0113]细胞系:BF_2。
[0114]病毒毒株:ADRV2010SX、EHNV。
[0115]HRP-山羊抗鼠IgG(货号A4416):购自美国的Sigma-Aldrich公司。
[0116]3操作步骤
[0117]3.1蛋白样品的制备
[0118]用胰酶将被不同病毒感染的细胞和对照组细胞(约2.0X 16个/瓶)从细胞瓶的瓶壁上消化下来，用吸管将其转移至15mL离心管中，4°C 1200rpm离心6min，轻轻倒掉细胞上清液，用2mL PBS重悬细胞沉淀，置4°C冰箱保存备用。
[0119]3.2 SDS-PAGE
[0120]3.2.1制胶①按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液使其混合均匀，然后将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃板中，再在液面上小心注入一层去离子水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置约30min以使分离胶完全聚合。②按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以避免过多地接触氧气。吸去分离胶上面的去离子水后，将浓缩胶平稳地注入分离胶上层，然后小心插入梳子并防止齿尖留有气泡，静置约30min以保证胶液完全聚合。
[0121]3.2.2煮样按照每40 μ L蛋白样品加入1yL 5Χ蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和5Χ蛋白上样缓冲液；用沸水将样品加热5min，以使蛋白充分变性；冷却至室温后，12000rpm离心5min，保留上清液。
[0122]3.2.3加样预电泳后，各取5 UL蛋白标准(Marker)和10 μ L待分析的蛋白样品(病毒感染细胞的总蛋白)上样至SDS-PAGE胶加样孔内即可(加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应)。
[0123]3.2.4电泳加样完毕，120V电泳约90min，电泳至溴酚蓝染料前沿到达凝胶末端，即可停止电泳。
[0124]3.3 Western blot
[0125]3.3.1转膜采用半干电转印法将蛋白质(病毒感染细胞的总蛋白)从SDS-PAGE凝胶中转移至固相支持物PVDF膜上。连接电极，开通电源，30mA转印2h。
[0126]3.3.2膜的封闭用PBS漂洗转印后的PVDF膜，然后将PVDF膜放入含5%脱脂奶的PBS内，于摇床上室温摇动封闭lh。
[0127]3.3.3 —抗孵育将单克隆抗体4C3用1mL TBST作1:1000倍稀释后，将剪开的PVDF膜放入其中，于摇床上室温摇动孵育lh。
[0128]3.3.4洗膜用PBST洗膜3次，每次5min。
[0129]酶标二抗孵育将HRP-山羊抗鼠IgG TBST分别作1:5000稀释后，将膜置于二抗稀释液中并于摇床上室温摇动孵育lh。
[0130]3.3.5洗膜用PBST洗膜3次，每次5min。
[0131]3.3.6底物反应配制化学发光检测液(GE Healthcare, RPN2135)2mL ;用平头镊子将PVDF膜放入其中，室温避光反应2min。将处理过的PVDF膜经X胶片曝光显影，胶片拍照保存。
[0132]4试验结果
[0133]Western blot结果表明，中国检验检疫科学研宄院制备的鼠抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体4C3与大鲵虹彩病毒发生反应，与其他水生动物病毒以及细胞均不发生反应(图3)。
[0134]实施例5抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体(4C3)的间接免疫荧光鉴定
[0135]I试验目的
[0136]进一步验证单克隆抗体4C3能否与ADRV蛋白发生反应。
[0137]2试验材料
[0138]细胞系:BF_2。
[0139]ADRV 毒株:ADRV 2010SX。
[0140]FITC-山羊抗鼠IgG(货号F9006):购自美国的Sigma-Aldrich公司。
[0141]3操作步骤
[0142]3.1铺板选择形态正常、生长良好的BF-2细胞，用胰酶消化后，将单细胞悬液以约15个/mL的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μ L ;于25°C培养箱中过夜培养，形成90%左右的单层细胞。
[0143]3.2接毒小心吸弃上清后，以200TCID5(i/孔的剂量(20 μ L)将ADRV接种于细胞板I和3垂直行各孔内的BF-2细胞中，而2和4垂直行各孔内的BF-2细胞为不接毒阴性对照，于25°C培养箱中继续培养2d。
[0144]3.3固定小心吸弃各孔内的病毒残液，用TBST洗涤I次，每孔加入100 μ L无水乙醇固定15min以使细胞完全固定。
[0145]3.4—抗孵育用TBST将鼠抗ADRV单抗McAb (1:100)稀释后，向相应孔内加入100 μ L抗体稀释液，于室温摇床上孵育lh。
[0146]3.5洗涤用TBST洗涤3次，每次5min。
[0147]3.6 二抗孵育用TBST将FITC标记的山羊抗鼠IgG(l:200)稀释后，向相应孔内加Λ 10yL FITC标记抗体稀释液，于室温摇床上孵育lh。
[0148]3.7洗涤用TBST洗涤3次，每次5min。最后，向各孔加入50 μ L PBS溶液。
[0149]3.8荧光显微镜观察寻找最佳拍照区域，调整对比度及放大倍数后，进行拍照，保存照片。
[0150]4试验结果
[0151]结果表明，单抗4C3能够识别ADRV (图4)。
[0152]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【主权项】
1.一种抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC N0.9709的杂交瘤细胞株ADRV McAb 4C3分泌产生的。
2.分泌产生抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株ADRVMcAb4C3，其保藏编号为CGMCC N0.9709 ο
3.权利要求1所述的抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体在检测大鲵虹彩病毒中的应用。
4.权利要求1所述的抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体或权利要求2所述的杂交瘤细胞株在制备检测大鲵虹彩病毒试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体及其制备与应用。该抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.9709的杂交瘤细胞ADRV McAb 4C3分泌产生的。该杂交瘤细胞的制备方法为：利用蔗糖密度梯度离心纯化大鲵虹彩病毒；将纯化病毒粒子作为抗原免疫动物，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，经筛选获得可稳定分泌抗大鲵虹彩病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。该单克隆抗体为大鲵虹彩病毒ELISA等检测方法的建立提供物质基础。CGMCC No. 970920140929
【IPC分类】G01N33-571, C07K16-08, G01N33-577, C12N5-20, C12R1-93
【公开号】CN104774262
【申请号】CN201510190746
【发明人】王娜, 张旻, 景宏丽, 吴绍强, 林祥梅, 江育林
【申请人】中国检验检疫科学研究院
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月21日