一种基于膜从水蛭中提取水蛭素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水蛭素的提取方法，具体涉及一种基于膜从水蛭中提取水蛭素的方法，属于生物医药物质分离纯化技术领域。
【背景技术】
[0002]水蛭素(Hirudin)是水蛭及其唾液腺中已提取出的多种活性成分中活性最显著并且研宄得最多的一种成分，它是由65—66个氨基酸组成的小分子多肽，相对分子量为7000道尔顿，C端富含许多酸性氨基酸残基，第63位氨基酸是被硫酸酯化的酪氨酸，分子N端有三个二硫键，水蛭素存多种变异体，主要研宄的是HV1、HV2和HV3。水蛭含有丰富的水蛭素，水蛭素是至今为止发现的最强的凝血酶抑制剂，能与凝血酶1:1结合形成复合物，阻止纤维蛋白形成而具有抗凝血作用，同时也能阻断凝血酶催化的止血和诱导的血小板反应而具有阻止血栓的形成。
[0003]水蛭素与目前临床上华法令、阿司匹林、肝素等药物相比，水蛭素抗栓效果最强，出血副作用最小，且无过敏反应和毒性反应，具有明显的优势。此外，水蛭素可以口服，这给用药带来很大方便。水蛭素比较稳定，胰蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，这就可以解释为何服中药水提取液仍然有疗效的原理。
[0004]水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。研宄还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。自1884年，Haycraft发现水蛭提取物具有抗凝作用。1904年，Jacoby将此提取物命名为水蛭素。1955年，Markward从水蛭头部唾液腺中提取水蛭素纯品，针对凝血酶抑制剂的研宄迅速开展起来
我国到目前为止已经公开了许多水蛭素生产方法，中国专利《一种以吸血水蛭为原料制备水蛭素的方法及应用》，公开号CN 1452986A,该发明是在常温下，将水蛭制成水蛭浆，然后滤取水蛭液，然后再水蛭液中加入淀粉和水溶性填充剂制成水蛭悬浊液，在将悬浊液进行喷雾干燥制成粉末。中国专利《基于阴离子交换柱高效分离出高活性水蛭素的方法》，公开号CN 103509105A，该发明是将水蛭经酸提，丙酮沉淀，DEAE-硅胶柱纯化，透析浓缩，最后冻干成粉末。上述方法中，产品纯度不高，操作不能连续，并使用丙酮等易燃易爆有毒试剂，透析过程时间长，因此增加生产成本，不适用工业化大生产。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种基于膜从水蛭中提取水蛭素的方法，该方法各步骤连续，成本低廉，操作简单，产品收率高损失小，可适合大规模生产。
[0006]本发明采用的技术方案为:
一种基于膜从水蛭中提取水蛭素的方法，包括以下步骤:
O水蛭浆的制备:将水蛭至于猪血中，待其吸血完毕后，将水蛭捣碎成水蛭浆；
2)水蛭浆预处理:将步骤I)的水蛭浆进行超声处理，得到小分子混合液；
3)膜分离:将步骤2)的小分子混合液依次通过陶瓷膜，微滤膜除去大分子蛋白，然后通过超滤膜浓缩；
4)离子交换分离:将步骤3)得到超滤浓缩液通过阴离子交换树脂洗脱、收集有抗凝血活性洗脱液；
5)浓缩干燥:将步骤4)得到的活性成分洗脱液再次经超滤膜浓缩，浓缩液经冷冻干燥得到水蛭素干粉。
[0007]步骤2)所述的超声处理，超声波频率5-20MHZ，超声时间5_30min ;利用超声波使分子剧烈震动，在液体间产生小空洞，小空洞迅速膨胀和闭合，使分子团簇之间发生猛烈的撞击，打碎液体中的大分子团簇，减小乳化现象。所述的超声处理优选超声波频率10~20MHz，超声时间10~20 min ;进一步优选为超声波频率15 MHz，超声时间10 min。
[0008]步骤3)所述的陶瓷膜孔径为50nm，工作压力为0.3-0.5MPa,温度控制在4_8°C ；陶瓷膜工作压力优选为0.4MPa，温度优选控制在4°C。
[0009]步骤3)所述微滤膜规格为截留分子量20000-30000道尔顿，工作压力为0.5-0.7MPa温度控制在4_8°C。优选选择截留分子量20000道尔顿的微滤膜，工作压力为0.6 MPa,温度控制在4°C。或者选择截留分子量30000道尔顿的微滤膜，工作压力为0.7
MPa0
[0010]步骤3)和步骤5)所述的超滤膜规格为截留分子量4000-5000道尔顿，工作压力为1.5-2.5Mpa，温度控制在4_8°C。
[0011]步骤4)所述的阴离子交换树脂为717#强碱性阴离子交换树脂
步骤4)所述的洗脱，其洗脱体系为(0.1-0.5) M NaCl- (0.01-0.04) M HCl ;洗脱体系优选为(0.2-0.4) M NaCl- (0.02-0.04) M HCl。
[0012]步骤5)所述的冷冻干燥，冷冻温度一 30°C?一 50°C，真空度5-10Pa.本发明得到的水蛭素干粉，利用其可与凝血酶按1:1的特异性结合而是凝血酶失去活性的原理，因此采用Markwardt凝血酶直接滴定法测其活性，水蛭素的计量单位用ATU表示，凝血酶活性单位为NIH，因此我们可以认为水蛭素活性IATU相当于中和INIH凝血酶的水蛭素的量
水蛭素含量检测方法:
精密称取水蛭素干粉I克，加入生理盐水5mL，振荡混匀8000rpm离心取上清液10uL,加入0.5%纤维蛋白原(用含0.06M NaCl的0.05M Tris -HCl溶液，调pH7.4) 200uL。振荡混匀，于室温下滴加30NIH的凝血酶5ul，观察五分钟若不凝，继续添加相同量的凝血酶，直至产生凝结现象，记录凝血酶消耗的体积数，按下式计算水蛭素活力(u/g)
A=C1VC2V2
其中:A表示每克样品所含水蛭素活力u/g C1:凝血酶浓度NIH/mL C2:样品浓度g/mL V1:凝血酶消耗的体积uL V2:加入样品的体积uL
上述水蛭素检测方法均适用于含有水蛭素的各种产品的质量检测方法。
[0013]有益效果
本发明采用陶瓷膜，有机膜除杂，超滤膜浓缩工艺，在超滤浓缩前增加了陶瓷膜和微滤膜，它们可以截留悬浮杂质、粘度大的物质以及分子量在百万级的大分子，可以有效减少超滤膜膜面的污染，膜孔堵塞，增加膜通量，提高生产效率；膜分离过程无相变，无需加热能耗低，有效膜面积大，分离效果好，操作条件温和，不破坏有效成分，不必添加任何化学试剂，无污染。在取得邻人满意产品同时，降低了生产过程中对设备的要求，减少了许多工艺环
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采用阴离子交换树脂对水蛭素选择性良好，吸附快，吸附容量大，而且树脂洗脱速度快，容易再生，溶剂可回收重复利用降低了生产成本，缩短生产周期；本发明省去了丙酮、乙醇等有机有毒试剂使用，基本对环境无污染，适合工业化生产；在冷冻干燥前通过超滤膜浓缩去除去多小分子物质，使得冷冻干燥步骤得到的水蛭素干粉纯度高，因此，使得整个工艺连续自动，减少人员投入，操作简单，生产成本低，对以水蛭为原料提取纯化水蛭素奠定了基础。
[0014]本发明解决了传统工艺中的透析、盐析、萃取分离等