一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白的高效表达法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药领域，具体涉及新型抗凝溶栓双功能融合蛋白一水蛭素12肽和瑞普替酶融合蛋白(HV12p-rPA)在pET21a-HrP/BL21大肠杆菌工程菌中的高效表达方法。
【背景技术】
[0002]本发明中的高效表达目标为水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p_rPA)，是通过一个(Gly)3柔性肽基团将重组水蛭素HV3的C末端12肽与rPA基因融合而成的一种同时具有抗凝溶栓双功能的全新蛋白(专利号:ZL 2006 I 0022457.8)。该蛋白通过目前最常用的表达系统一大肠杆菌进行表达，其表达水平的高低直接影响后续的研究及其产业化的进展，但该融合蛋白在大肠杆菌中的表达量很低，韦利军等在“抗凝、溶栓双功能水蛭素12肽一瑞替普酶融合蛋白的模拟、构建与表达”([J].药物生物技术，2007，14 (3):168-172)中得到的HV12p-rPA融合蛋白的表达量约占全菌总蛋白的12%。蛋白表达量过低，不仅加大了后续分离纯化等工作的研究难度，且限制了该蛋白在药物研究与开发方面的应用潜力。因此，选用适当的方法筛选优化工程菌发酵条件，建立一套完善的目标蛋白高表达的方案将十分必要。
[0003]目前，已有很多文献针对第三代溶栓药r-PA的表达进行了报道，如，孔扬在“重组组织型纤溶酶原激活剂变异体工程菌的培养与体外复性的研究”([D].山东:山东大学微生物学系，2005.)中，构建了 E.coli PTPA3/BL21，并通过单因素法优化其培养条件，表明40°C、200rpm、20-40ummol/l的IPTG诱导4_5h，可表达得到rPA约占细胞总蛋白的36.2%。赵友春等在“组织型纤溶酶原激活剂重组变异体Reteplase的克隆表达和分离纯化”([J].山东大学学报工学版，2003，33 (2):216-220)中，构建了大肠杆菌工程菌pTPA3/BL21，该菌种在37°C、lmmol/1的IPTG诱导4h，表达的r_PA占菌体蛋白的40%。孙雄华等在“瑞替普酶在大肠杆菌中的表达与活性测定”([J].中国血液流变学杂志，2006，16 (4) =534-536)中，成功在大肠杆菌中表达了带组氨酸标签的r-PA，但其目的在于简化下游分离纯化步骤，而非提闻目标蛋白表达广率，因而于180rpm、lmmol/1的IPTG诱导5h,表达后电泳仅可见目标蛋白条带，表达量未报道。王伟等在“瑞替普酶融合蛋白的表达、纯化及分子伴侣对其复性的影响”([J].安徽医科大学学报，2013,48 (11):1287-1291)中，成功构建了工程菌 PET-32a-r-PA/ BL21，并在 37°C、150_250rpm、0.5umol/l 的 IPTG 诱导 3h 条件下实现了r-PA的表达，表达量未说明。
[0004]本项发明在前期工作中已成功构建了大肠杆菌HV12p_rPA /BL21工程菌。经发酵、诱导后，获得HV12p-rPA融合蛋白。该融合蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌细胞中，经复性及纯化、体外生物学活性检测及动物体内药效研究后，已被证实具有抗凝、溶栓双重功能。因此，该融合蛋白在研发成为兼具抗凝溶栓双重功能的新一代抗血栓药方面具备巨大的潜力。但鉴于HV12p-rPA是一种全新的、兼具抗凝溶栓双功能的融合蛋白，目前还没有文献对其高表达条件进行研究和报道。采用上述文献中的表达条件进行该新型蛋白的表达，均不能获得闻表达结果。
[0005]基因工程菌细胞高密度培养是获得高产量外源蛋白的一种重要策略。大肠杆菌是多种重组蛋白表达时的首选宿主，筛选优化大肠杆菌发酵条件的常用方法有单因素法、正交法、响应面法等。单因素法耗时长，操作中偶然因素影响大，此外，各因素间的交互作用无法考察，致使试验结果的准确度较低；正交法可筛选多水平多因素中的较优条件组合，但由于无法拟合影响因素与响应值间的函数关系，不能对所有因素进行面分析，故一般难以得到最优条件；响应面法则试验次数少，周期短，既可充分考察各因素间的交互作用，也可通过解析回归方程求出最优参数值，大大提高了实验的精确度，可弥补以上优化方法的不足。本发明同时采用上述这些筛选手段对HV12p-rPA这种崭新的蛋白进行高效表达条件的研究，建立了 HV12p-rPA到目前为止表达量达36%的高效方法。
【发明内容】
[0006]本发明提供了一种重组大肠杆菌高效表达新型抗凝溶栓双功能融合蛋白一水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的方法，如下:
以体积比1%的接种量，将15%甘油管保存的、含有HV12p-rPA融合基因的pET21a_HrP/BL21大肠杆菌工程菌菌种接种至含100ug/ml Amp的新鲜LB液体培养基中，于37°C，200rpm条件下，培养12h，使菌种得到活化，然后向培养基中加入0.5-1.5 mmol/L CaCl2*20mmol/L皿8(:12至少一种，再以体积比5%接种量加入活化菌液，于37-39°C，180-220rpm下发酵培养3h，最后加入终浓度为lmmol/L的IPTG作为诱导剂，37_39°C和180_220rpm条件下摇瓶培养4h，结束后，收菌，即4°C下以8000rpm离心3min，所得菌体沉淀以PBS (pH7.4)吹匀洗涤一次后，同条件离心得菌体，超声破菌后获得表达量为20-36%的目标蛋白。
[0007]采用正交法结合响应面法对含有HV12p-rPA融合基因的pET21a_HrP/BL21大肠杆菌工程菌培养条件进行筛选及优化，确立了发酵培养的最佳条件，即温度38.06°C，转速207.84 rpm, Ca2+浓度 1.05 mmol/L,最佳平均表达量为 36.15%。
[0008]上述重组大肠杆菌高效表达水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法，在发酵培养阶段，通过控制转速间接控制通氧量，使培养基中的重组大肠杆菌大量繁殖，缩短了发酵周期。在诱导阶段，适当提高培养温度，既促进菌体生长，又有利于提高工程菌的表达量。该方法的优点在于易于操作、工艺简单，且表达量高、成本相对低，具有良好应用价值。
[0009]【具体实施方式】:
实施例一:
1.重组大肠杆菌工程菌表达水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法:
①摇瓶发酵:用蒸懼水新鲜配制LB液体培养基,加入100ug/ml的Amp溶液,再以1%的接种量，将15%甘油管保存的菌种接种至培养基中，37 °C、200rpm培养12h，使菌种得到活化。再将此活化的菌液按5%的接种量转接至摇瓶中，摇瓶内为蒸馏水配制的LB培养基，其中含 Ampl00ug/ml, Ca2+ lmmol/L、Mg2+20mmol/L,继续培养 3h 后，加 1.Smmol /T, IPTG 作为诱导剂，39°C、200rpm 诱导 4h。
[0010]②收菌:诱导结束后，于4°C条件下，以8000rpm离心3min,所得菌体沉淀以PBS(pH7.4)吹匀洗涤一次后，同条件离心得菌体。
[0011]③菌体的破碎:以Tris-Cl (pH 8.0)重悬菌体，250W，5sX 10s，冰浴超声累计5min, 12000rpm, 4°C离心 20min 得包涵体，-20°C保存。
[0012]2.结果鉴定:所得包涵体蛋白经12%SDS_PAGE电泳后，以考马斯亮蓝R-250染色，脱色后进行扫描，所得目的蛋白在菌体总蛋白中的表达量为31%。
[0013]实施例二:
1.重组大肠杆菌工程菌表达水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法:
①摇瓶发酵:用蒸懼水新鲜配制LB液体培养基,加入100ug/ml的Amp溶液,再以1%的接种量，将15%甘油管保存的菌种接种至培养基中，37 °C、200rpm培养12h，使菌种得到活化。再将此活化的菌液按5%的接种量转接至摇瓶中，摇瓶内为蒸馏水配制的LB培养基，其中含 AmplOOug/ml, Ca2+ lmmol/L、Mg2+20mmol/L,继续培养 3h 后,加 lmmol/L IPTG 作为诱导齐[1，381:、200印111诱导 4h。
[0014]②收菌:诱导结束后，于4°C条件下，以8000rpm离心3min,所得菌体沉淀以PBS(pH7.4)吹匀洗涤一次后，同条件离心得菌体。
[0015]③菌体的破碎:以Tris-Cl (pH 8.0)重悬菌体，250W，5sX 10s，冰浴超声累计5min, 12000rpm, 4°C离心 20min 得包涵体，-20°C保存。
[0016]2.结果鉴定:所得包涵体蛋白经12%SDS_PAGE电泳后，以考马斯亮蓝R-250染色，脱色后进行扫描，所得目的蛋白在菌体总蛋白中的表达量为36%。
[0017]实施例三:
1.重组大肠杆菌工程菌表达水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法:
①摇瓶发酵:用蒸懼水新鲜配制LB液体培养基,加入100ug/ml的Amp溶液,再以1%的接种量，将15%甘油管保存的菌种接种至培养基中，37 °C、200rpm培养12h，使菌种得到活化。再将此活化的菌液按5%的接种量转接至摇瓶中，摇瓶内为蒸馏水配制的LB培养基，其中含 AmplOOug/ml, Ca2+ 1.0SmmoI /I,、Mg2+20mmol/L,继续培养 3h 后，加 lmmol/L IPTG 作为诱导剂，38.060C >207.84rpm 诱导 4h。
[0018]②收菌:诱导结束后，于4°C条件下，以8000rpm离心3min,所得菌体沉淀以PBS(pH7.4)吹匀洗涤一次后，同条件离心得菌体。
[0019]③菌体的破碎:以Tris-Cl (pH 8.0)重悬菌体，250W，5sX 10s，冰浴超声累计5min, 12000rpm, 4°C离心 20min 得包涵体，-20°C保存。
[0020]2.结果鉴定:所得包涵体蛋白经12%SDS_PAGE电泳后，以考马斯亮蓝R-250染色，脱色后进行扫描，所得目的蛋白在菌体总蛋白中的表达量为36.15%。
【主权项】
1.一种高效表达新型抗凝溶栓双功能水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的方法，其表达条件为:将终浓度为ΙΟΟμ g/ml的Amp+溶液加入到新鲜的LB液体培养基中，以体积比1%的接种量将含有HV12p-rPA融合基因的pET21a_HrP/BL21大肠杆菌工程菌菌种接种至培养基中，于37°C，200rpm条件下，培养12h，使菌种得到活化，然后向培养基中加入0.5-1.5 mmol/L CaCl2* 20mmol/L MgCl 2至少一种,再以体积比5%接种量加入活化菌液，于37-39°C，180-220rpm下发酵培养3h，最后加入终浓度为ImmoI/L的IPTG作为诱导剂，37-39°C和180-220rpm条件下摇瓶培养4h，获得表达量为20-36%的目标蛋白。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:培养重组大肠杆菌的最优温度为38.060C，最佳转速为207.84 rpm，最佳Ca2+浓度为1.05 mmol/L,最佳表达量为36.15%。
【专利摘要】本发明属于生物制药领域，具体涉及到一种新型抗凝溶栓双功能融合蛋白-水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白（HV12p-rPA）的高效表达法。本方法筛选优化了大肠杆菌工程菌摇瓶培养条件中的七个主要因素（培养基的配制、接种量、诱导时间、转速、诱导温度、补料方式、微量元素），确定出影响目标蛋白表达量的三个最重要因素为转速、温度及钙离子浓度，并使目标蛋白HV12p-rPA的表达量达到36.15%。本法简单、易行、高效，成本相对低，具有良好应用价值。
【IPC分类】C07K14-815, C12R1-19, C12N9-64
【公开号】CN104593343
【申请号】CN201510017906
【发明人】余蓉, 刘立平, 许小枫, 邓璇
【申请人】四川大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月14日