专利名称：：一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的凝胶层析复性方法
技术领域：
：本发明涉及生物制药领域，具体地说是涉及一种抗凝溶栓双功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的凝胶层析复性方法。
背景技术：
：本发明中的复性目标水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白，是通过一个(Gly)3柔性肽基团首次将重组水蛭素HV3的C末端12肽与rPA基因融合而成的一种全新蛋白。大肠杆菌表达体系因具有低廉性、高效性和稳定性等优点在科研生产中被广泛应用。然而，重组蛋白在大肠杆菌中的高水平表达经常导致蛋白聚集而形成不溶的、无活性的包涵体。目前上市的重组蛋白药物中，54%以大肠杆菌作为表达系统，而大肠杆菌表达蛋白中有一半形成包涵体。本研究所构建的水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白是通过大肠杆菌进行表达，以包涵体的形式存在。包涵体虽然由无活性的蛋白组成，但包涵体形成对于重组蛋白的生产也提供了几个优势①以包涵体形式表达的蛋白质的浓度比较高，有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的30%(S.A/^awfl,/义wwagOT..5/opo(v附era(^e^/ife"/e"ce人1999,57:297-307.);②如果重组蛋白质以包涵体形式存在，由于包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击；③包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后的纯化步骤，不用考虑蛋白质的失活问题；包涵体形式表达的蛋白质与宿主细胞的其他蛋白质的分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离；有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低，而包涵体形式的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达；◎对于以包涵体形式表达的产物可以比较容易地进行在线的观测定性。包涵体蛋白质复性是生物工程下游技术中的一个重要问题。一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点①活性蛋白质的回收率高；②正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；③折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；④折叠复性方法易于放大；⑤复性过程耗时较少。就实际生产而言，要求折叠复性过程必须快速、低成本、高效。虽然蛋白质的折叠复性已有很多方法，但针对每一种蛋白质仍需通过实验摸索出最佳的方法。由于蛋白质本身的复杂性和多样性，蛋白质的复性方法也各不相同，本研究目标是对已采用第三代基因工程技术-蛋白质工程技术在分子水平上有目的设计构建的水蛭素12肽与瑞替普酶新型抗凝溶栓双功能重组融合蛋白HV12p-rPA进行复性。対该具有9对二硫键的HV12p-rPA融合蛋白体外折叠复性具有相当的挑战性和难度。由于融合蛋白的r-PA分子中18个Cys要形成9对二硫键，所以大肠杆菌表达HV12p-rPA时，因发生二硫键的错配而形成致密的包涵体，溶解变性后要使其重新正确折叠和复性成活性状态非常困难，这是由于组成九对二硫键的18个Cys在复性时错误配对造成的。蛋白质复性技术是基因工程蛋白产生的重大共性关键技术，直接关系到生产成本和技术能否产业化，所以，研究基因工程蛋白的复性技术不但在理论上有重大意义而且也有重大的应用价值。蛋白的体外复性被认为是一项异常艰巨的任务，目前己存在的复性方法是很多的，较常见的除了稀释复性以外，还有透析复性、柱上复性，但普遍复性率不高，只有20%左右的目的蛋白分子(汪家政等，蛋白质技术手册，科学出版社，2001年，p31)得到正确的空间构型，获得生物学活性。并且，变性蛋白的体外复性受外部环境的影响较大，不同蛋白的复性过程不同，特异的复性环境，包括缓冲液的组成、蛋白浓度、温度、pH等应根据蛋白的不同而异。没有哪种复性方法可以通用于所有的蛋白。近來，有人转向于体内蛋白质折叠的模拟，产生了一些新的方法，例如将小分子伴侣固定化后，相当于亲和层析的原理，复性蛋白质的同时使其浓縮和纯化。有很大的应用前景，但是，由于这些分子伴侣均需要特别制备技术，对于大规模多种蛋白质制备，仍属昂贵试剂。所以，要将实验室的研究成果产业化，获取实际的生产成果，就不得不考虑生产成本以及操作难易程度这两个问题。因此，制约基因药物生产的一个关键性难题就是复性效率、复性成本以及生产操作难易的问题。HV12p-rPA融合蛋白含有九对二硫键，无疑为其复性增加了更大的难度，其复性问题是下游工作的一个很大的考验。目前，对于这种含有多对二硫键的蛋白的复性率普遍不高。例如同样含有九对二硫键的瑞替普酶(r-PA)，Kohnert(KohnertU,effl/.ProteinEngineering，1992,5:93-100)等用稀释复性法复性r-PA，复性率不超过5%。孙石静(孙石静等，中国药科大学学报，2005，36:363-367)等运用金属螯合柱一步复性，融合蛋白复性率也仅达10%。赵友春(赵友春等，化工科技，2003，11:15-17)等改进了Kohnert的方法，在谷胱甘肽还原体系中，用重组人二硫键异构酶(PDI)辅助瑞替普酶复性，其复性率达到14%以上。但PDI价格昂贵，用于工业化无疑大大提高了成本。相比于传统的稀释复性方法，凝胶层析复性有其独特的优点。1994年Werner(M.H.Werner,GM.Clore,R丄Fisher,erFEBSLett.1994，345:125-130.)等人第一次使用SEC复性蛋白质，最后洗脱出71±15%的活性蛋白质。为提高蛋白复性率，2002年谷等人(Z.Gu，Z.Su,J,C.Janson，eM/.ProteinExpress.Purif.2002,25:174-179.)利用Superdex30预装柱复性scFv蛋白质，在柱内预先设置了变性剂浓度梯度和pH值的梯度，获得了25%的活性收率。2006年刘海峰(HaifengLiu,XiangshanZhou,YuanxingZhang,Wa/'BiotechnologyLetters,2006,28:457~463)等用Sephacryl-200层析复性和两步温控法复性Trx-r-PA融合蛋白，收集到的样品在25'C下复性20h，其复性率达到13.8%。本发明中的凝胶层析复性方法，与文献方法相比，其改进在于(l)进行柱上层析复性的样品事先进行6-12h的氧化复性处理，使GSSG与变性蛋白中的半胱氨酸形成复合物，有效降低了二硫键的错配几率，大大提高了该融合蛋白的复性率。(2)在层析复性时在层析柱内预先设置了长度为O.l—OJ个柱体积的变性剂(脲，盐酸胍等，含有L-Arg)浓度梯度，使变性蛋白在复性过程中缓慢脱离变性剂环境进入复性环境，有效抑制其聚集及二硫键错配。(3)在复性缓冲液中添加了氧化还原体系(GSSG/GSH等)以及一定浓度的L-Arg和脲，有效促进了该融合蛋白的正确折叠和分子内二硫键的正确配对。(4)在复性过程中简化了调pH过程及其他操作，降低了蛋白活性的影响。改进后使复性蛋白溶液的浓度和比活有了一定程度的提高。
发明内容本发明提出了一种抗凝溶栓双功能HV12p-rPA融合蛋白的复性方法。该技术的优点在于复性产品比活高、收率高、浓度高、体积小便于后续处理，操作简便、易于推广。本发明所述抗凝溶栓双功能HV12p-rPA融合蛋白凝胶层析复性的技术方案内容如下(1)将发酵所得的HV12p-rPA融合蛋白包涵体，使用20-50mmol/LTris-HCl、6-8mol/L的尿素或3-7mol/L胍缓冲液，pH8.5，37'C-40'C变性6-8h，使包涵体变性溶解，其中缓冲液含有还原剂DTT(0.5-lmmol/L)或p-巯基乙醇(1%-1.5%,v/v)，12000r/min，15min，除去不溶物，收集上清液。(2)用20-50mmol/LTris-HCl、6-8mol/L尿素或3-7mol/L胍缓冲液将变性蛋白溶液稀释至浓度为8-12mg/ml，该溶液中含有GSSG(0.05-0.lmol/L)、L-Arg(0.5-0.9mol/L)，pH9.0-9.5。25。C下，温育6-12h。(3)采用平衡缓冲液(20國50mmol/LTris-HCl，0.5-0.7mol/LL-Arg，0.5-1.5mol/LUrea,l-10mmol/LGSH,1-10纖ol/LGSSG，l匪ol/LEDTA，pH8.5)以0.5ml/min的流速平衡层析柱。(4)平衡后，在层析柱内设置0.1-0.3柱体积的变性剂缓冲液(20-50mmol/LTris-HCl,6-8mol/L的尿素或3-7mol/L胍，0.5-0.7mol/LL-Arg，pH8.5)。(5)将(2)作为样品，进样50nl。(6)用平衡缓冲液(20-50mmol/LTris-HCl，0.5-0.7mol/LL-Arg，0.5-1.5mol/LUrea,1-10mmol/LGSH，1-10mmol/LGSSG，1mmol/LEDTA，pH8.5)以0.5ml/min的流速进行洗脱，按照280nm吸光度的变化收集目的蛋白液，并对样品进行适当处理。(7)活性测定HV12p-rPA融合蛋白的溶栓活性测定釆用纤维蛋白-琼脂糖平板测定法，抗凝活性采用凝血酶直接滴定法测定。本发明提供的复性抗凝溶栓双功能HV12p-rPA融合蛋白的技术方法，复性产品比活高、收率高、体积小、浓度高便于后续处理，且操作简便、易于推广，下面结合具体实施方式加以说明。图1是HV12p-rPA融合蛋白的SuperdexG75柱上复性色谱图(实施例一)。图2是本发明HV12p-rPA融合蛋白样品溶栓试验结果的平板图。图中标示的1、2、3、4、5分别为r-PA1000、400、10、50、200IU/ml;标示6为本发明HV12p-rPA融合蛋白样品稀释20倍的试样。图3是HV12p-rPA融合蛋白基质辅助激光解析飞行时间质谱。图4是HV12p-rPA融合蛋白一级结构的氨基酸序列。具体实施例方式实施例一LHV12p-rPA融合蛋白复性用平衡缓冲液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，lmmol/LGSH，lmmol/LGSSG，lmmol/LEDTA,pH8.5)平衡柱，流速为0.5ml/min。上样前先在层析柱内设置一个长度为0.2个柱体积的8mol/L脲的浓度梯度，使得变性剂在0.2个柱体积的长度内浓度由8mol/L逐渐降至lmol/L，由此变性蛋白在进入复性缓冲液时有一个脲浓度逐渐降低的过程。将在25'C温度下温育10h小时的变性蛋白溶液(10mg/ml)作为柱上复性的样品，上样5(V1。以平衡缓冲液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，lmmol/LGSH，lmmol/LGSSG,lmmol/LEDTA，pH8.5)洗脱，流速为0.5ml/min。根据蛋白质在280nm的吸光度得到如附图l所示的吸收峰。根据出峰情况收集到三个样品P,、P2、P3(如图l内所示)，其中P2为目标蛋白。2.生物活性测定抗凝活性的测定(滴定法)于酶标板小孔中加200pl0.5°/。牛血纤维蛋白原(0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)配制)，再加入10-10(^1复性蛋白溶液，充分混匀。用微量进样器吸取标准的凝血酶溶液(100NIH/ml)，时间间隔为lmin，若在lmin内纤维蛋白原发生凝固，即说明己达滴定终点。每消耗一个凝血酶单位(NIH)相当于一个抗凝血酶单位(ATU)。溶栓活性测定(纤维蛋白-琼脂糖平板测定法)配制平板用溶液均为PBS(pH7.4)。将1BP单位/ml的凝血酶溶液贴壁加入10ml血纤蛋白原(5mg/ml)溶液中，快速混匀，倾入至完全融化且已降至45'C的10mL琼脂糖溶液(1.0Q/Q)中，混匀，倒入直径90mm的平皿中，凝固后打孔使用。分别吸取不同比活性的r-PA和复性后稀释20倍的HV12p-rPA融合蛋白滴于孔中，平皿加盖于37'C温育14h。溶栓平板试验结果如图2所示。经过检测，本发明技术复性HV12p-rPA融合蛋白后其溶栓活性可达93106IU/mg，抗凝活性达到273ATU/mg，融合蛋白溶栓活性的复性率约为18.6%。3.—级结构解析本发明采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)准确测定了该融合蛋白的分子量，使用胰蛋白酶和糜蛋白酶将融合蛋白进行降解，LC-ESI-MS/MS液质联用技术对酶解产物中的多肽进行了识别，使用肽序列标签法对目标蛋白的氨基酸序列进行了分析。结果实际测定该融合蛋白的分子量(如图3所示)为41473Da，与理论分子量41472.38Da相符；本发明采用液质联用进行肽图分析，识别出的多取匹配度Xcorr均超过1.5,部分多肽的Xcorr超过3.0(如表1所示)，表明本实验测定过程中多肽识别结果准确可靠胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解后进行液质联用分析，目标蛋白的氨基酸覆盖率超过85%(如表1所示)；对融合蛋白的N末端结构分析，采用胰凝乳蛋白酶对融合蛋白进行了酶切处理，并使用液质联用系统对产生的多肽进行了识别，识别出了多肽^^ASDF5(m/z570.3)，E6PIPEDAY13(m/z933.2)，E6PIPEDAYDEGGGSY20(m/zl599.2)，Q21GNSDCY27(m/z786.5)，L364DWIRDNMRP373(m/z1315.4)(如表1所示)。从而确定了该融合蛋白的N末端MASDFEPIPEDAYDEGGGSYQGNSDCY和C末端LDWIRDNMRP的多肽序列与理论值(如图4所示)相符。上述结果证明本发明所复性的该蛋白不仅具有双功能的生物活性，而且结构正确。表1HV12p-rPA融合蛋白酶解后使用液质联用系统识别出的多肽<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注c:Chymotrypsin酶解产物，其它为Trypsin酶解产物；d:离子带双电荷；t:理论平均值；o实验检测值实施例二用平衡缓冲液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea,lmmol/LGSH，lmmol/LGSSG，lmmol/LEDTA，pH8.5)平衡柱，流速为0.5ml/min。上样前先在层析柱内设置一个长度为0.1个柱体积的8mol/L脲的浓度梯度，使得变性剂在0.1个柱体积的长度内浓度由8mol/L逐渐降至lmol/L，由此变性蛋白在进入复性缓冲液时有一个脲浓度逐渐降低的过程。将在25'C温度下温育6h小时的变性蛋白溶液(12mg/ml)作为柱上复性的样品，上样50^1。以平衡缓冲液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，l蘭ol/LGSH，l腿ol/LGSSG，lmmol/LEDTA，pH8.5)洗脱，流速为0.5ml/min。根据蛋白质在280nm的吸光度收集目标蛋白，按照实施例一中的方法测定复性后HV12p-rPA融合蛋白的活性，结果发现其溶栓活性可达83242IU/mg，抗凝活性达到251ATU/mg，融合蛋白溶栓活性的复性率约为16.6%。实施例三用平衡缓冲液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，lmmol/LGSH，lmmoI/LGSSG，lmmol/LEDTA,pH8.5)平衡柱，流速为0.5ml/min。上样前先在层析柱内设置一个长度为0.3个柱体积的8mol/L脲的浓度梯度，使得变性剂在0.3个柱体积的长度内浓度由8mol/L逐渐降至lmol/L，由此变性蛋白在进入复性缓冲液时有一个脲浓度逐渐降低的过程。将在25'C温度下温育8小时的变性蛋白溶液(10mg/ml)作为柱上复性的样品，上样50pl。以平衡缓冲液(50縣oI/LTris-HCI，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，lmmol/LGSH，lmmol/LGSSG，lmmol/LEDTA，pH8.5)洗脱，流速为0.5ml/min。根据蛋白质在280nm的吸光度收集目标蛋白，按照实施例一中的方法测定复性后HV12p-rPA融合蛋白的活性，结果发现其溶栓活性可达87574IU/mg，抗凝活性达到262ATU/mg，融合蛋白溶栓活性的复性率约为17.5%。权利要求1.一种抗凝溶栓双功能融合蛋白的凝胶层析复性方法，其特征在于以水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的包涵体为原料，变性溶解后得到融合蛋白的变性溶液，变性蛋白先在氧化复性缓冲液中进行氧化复性，然后在具有脲浓度梯度的凝胶层析柱中进行层析复性，最后经过适当后续操作得到具有抗凝溶栓双功能的融合蛋白。2.按照权利要求1所述的凝胶层析复性法，其特征在于复性对象为水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白包涵体，复性后的蛋白具有抗凝溶栓双功能。3.按照权利要求1所述的抗凝溶栓双功能融合蛋白凝胶层析复性方法，其特征在于变性溶解包涵体的缓冲溶液组成为20-50mmol/LTris-HCl、6-8mol/L脲或3-7mol/L胍，含0.5-1mmol/LDTT或ni.5X(v/v)p-巯基乙醇，pH8.5，变性温度为37。C一40。C，变性时间为6隱8h。4.按照权利要求1所述抗凝溶栓双功能融合蛋白凝胶层析复性方法，其特征在于氧化复性缓冲液组成为20-50mmol/LTris-HCl，6-8mol/L尿素或3-7mol/L胍，0.05-0.1mol/LGSSG、0.5隱0.9mol/LL隱Arg，pH9.0-9.5，氧化复性温度为25。C，时间为6-12h。5.按照权利要求l所述抗凝溶栓双功能融合蛋白凝胶层析复性方法，其特征在于所用层析介质为SuperdexG75。6.按照权利要求1所述双功能抗凝溶栓HV12p-rPA融合蛋白凝胶层析复性方法，其特征在于柱平衡及洗脱所用的缓冲液为20-50mmol/LTris-HCl，0.5-0.7mol/LL-Arg，0.5-1.5mol/LUrea，1-10mmol/LGSH，1-10mmol/LGSSG，lmmol/LEDTA，pH8.5。7.按照权利要求15所述新型抗凝溶栓双功能HV12p-rPA融合蛋白凝胶层析复性方法，其特征在于在层析柱中构建了0.1-0.3柱体积长度的变性剂缓冲液梯度。全文摘要本发明属于生物制药领域，具体涉及一种抗凝溶栓双功能融合蛋白即水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白包涵体的凝胶层析复性方法。该方法特征在于先将变性蛋白进行一定时间氧化复性，然后采用Superdex75进行层析复性。层析复性时先在Superdex75柱内预设一段变性剂浓度梯度，融合蛋白在变性剂浓度梯度降低的过程中恢复其空间构象。同时在缓冲液中添加氧化还原体系和分子伴侣辅助蛋白构象转变。该方法得到的双功能融合蛋白经过一定处理后复性效果更好。该方法的优点在于操作简单，易于放大，复性后蛋白浓度较高，复性率较高。文档编号C07K1/00GK101386639SQ20081010496公开日2009年3月18日申请日期2008年4月25日优先权日2008年4月25日发明者蓉余,刘永东,张贵峰,兰梁,苏志国,净陈,玲高申请人:中国科学院过程工程研究所