一种生物活性酶及其提取工艺的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有生物活性的物质，具体涉及一种生物活性酶及其提取工艺。
【背景技术】
[0002] 目前，国内外生物活性酶多数来源于动物血液、肝脏，在我国有着丰富的资源，现 有技术对于从血液或血液相关原料中提取生物活性酶的方法多有报道。张尔贤等发表的 《猪血过氧化氢酶的纯化及其某些性质研宄》（药物生物技术，1994年第2期5-8)公开了猪 血过氧化氢酶的纯化方法，其采用CM-23及sephadexG-100层析和硫酸按盐析法纯化了猪 血过氧化氢酶。此外，专利文献CN102690794A公开了一种制备过氧化氢酶的方法，该方法 以新鲜牛肝为原料，将其切碎后匀浆，采用超声波提取、离子交换层析、凝胶过滤层析、冷冻 干燥等工艺制取高酶活过氧化氢酶产品。
[0003] 然而，传统的提取、分离生物活性酶的技术，存在耗时长、效率低、酶的活性不高以 及污染性强的缺陷。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在克服现有技术存在的缺陷，提供一种具有良好生物学活性的酶。
[0005] 本发明提供了一种生物活性酶，所述生物活性酶由包括以下步骤的方法制备而 成：
[0006] 1)将洗净后的血红细胞与水混合，用闪式提取器提取，在所得提取液中加入氯仿 和95%乙醇混合溶剂萃取，取上清液，即得粗酶液；
[0007] 2)在步骤1)所得粗酶液中加入硫酸铵，静置，离心后收集沉淀；将沉淀溶解于 pH7. 0?7. 4的0. 01?0. 02mol/L磷酸盐缓冲液中，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶 柱S印hadexG-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质且不含硫酸 铵的洗脱液，浓缩，得浓缩液；
[0008] 3)在步骤2)所得浓缩液中加入NaCl，得到NaCl浓度为0. 4?0. 6mol/L的溶液， 将所得溶液加入平衡好的金属螯合亲和柱顶端，用pH5. 8?6. 2的0. 015?0. 025mol/L 磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质的洗脱液；
[0009] 4)浓缩步骤3)所得洗脱液，冷冻干燥，即得生物活性酶。
[0010] 本发明中作为原料的血红细胞为哺乳动物的血红细胞，血红细胞的获取方法为生 物领域常规方法。
[0011] 本发明所述步骤1)中，所述柠檬酸缓冲液的浓度优选为〇. 〇2mol/L，pH值优选为 5. 0 ;血红细胞与所述柠檬酸缓冲液的体积比为1:0. 5?2,优选为1:1 ;所述破碎血红细胞 的装置优选为闪式提取器，所述闪式提取器为本领域用于提取的常规闪式提取器，也可以 由本领域可以实现本申请所述破碎效果的其它仪器或方法代替，其操作参数为：在3000? 8000rpm条件下提取，每次提取20?45s，共提取2?5次，每次间隔1?2min，操作参数 优选为在5000rpm条件下提取、每次提取30s、共提取3次、每次间隔2min;所述离心具体为 3000?3200rpm条件下离心5?15min，优选为在3000rpm条件下离心15min。
[0012] 本发明所述步骤2)所述在粗酶液中加入硫酸铵从而够将生物活性酶充分沉淀， 加入硫酸铵的终浓度为0. 3?0. 5g/ml，加入硫酸铵后，应静置20?40min，在0?4°C、 7500?8500rpm条件下离心10?20min，分离上清液，收集沉淀；在所得上清液中加入 0? 7?0? 9g/ml硫酸按，静置20?40min，在0?4°C、8500?9500rpm条件下离心25? 35min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并。
[0013] 在硫酸铵沉淀完毕后，本发明没有使用常规的透析方法，而是采用凝胶层析法除 去硫酸铵，且避免了常规透析除盐方法的繁冗过程和可能造成的目标产物损失。具体的，所 述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液；缓冲液的浓度优选为〇. 〇15mol/L，pH 值优选为7. 2 ;步骤3)所得沉淀以质量体积比1:1?5溶解于磷酸盐缓冲液中，此处沉淀 的质量单位为g，磷酸盐缓冲液体积的单位为ml;葡聚糖凝胶柱选用SephadexG-25,凝胶 柱的平衡和流动相的洗脱均为常规操作；所述浓缩优选为聚乙二醇浓缩法，所述聚乙二醇 优选为PEG4000,浓缩步骤为常规操作。为了鉴别硫酸铵是否被清除干净，本发明选择奈氏 试剂鉴定洗脱液中的硫酸铵，具体步骤为：取1滴洗脱液，滴在白色比色盘孔中，加入1滴奈 氏试剂混合，若出现棕黄色沉淀则表明洗脱液中含有硫酸铵。
[0014] 同时，本发明步骤2)收集的洗脱液中应含有蛋白质，具体而言，洗脱液中蛋白质 的鉴别方法具体为：取1滴洗脱液，滴在黑色比色磁盘中，加入1滴20%磺基水杨酸混合， 若出现白色絮状沉淀则表明洗脱液中含有蛋白质。
[0015] 本发明所述步骤3)对生物活性酶溶液进行纯化，并采用与步骤2)相同的方法鉴 定溶液中是否还有蛋白质，当检测不到蛋白质时，停止收集。具体而言，本步骤通过金属亲 和层析法进行蛋白纯化，所述金属螯合亲和柱所螯合的金属离子选自铜、锌、铁、镍离子等 金属螯合亲和层析中常用的螯合用金属离子；所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二 钾缓冲液；缓冲液的浓度优选为〇. 〇2mol/L，pH值优选为6. 0 ;洗脱液中蛋白质的鉴别方法 与步骤3)相同；所述浓缩优选为聚乙二醇浓缩法，所述聚乙二醇优选为PEG4000,浓缩步骤 为常规操作。
[0016] 作为本发明的最优选方案，所述生物活性酶由包括以下步骤的方法制备而成：
[0017] 1)将洗净后的血红细胞与pH5. 0的0. 02mol/L柠檬酸缓冲液混合以体积比1:1混 合，用闪式提取器破碎血红细胞，其操作参数为：在5000rpm条件下提取，每次提取30s，共 提取3次，每次间隔2min;在3000rpm条件下离心15min，取上清液，即得粗酶液；
[0018] 2)在步骤1)所得粗酶液中，加入0.4g/ml硫酸铵，静置30min，在0°C、8000rpm条 件下离心15min，分离上清液，收集沉淀；将硫酸按以质量体积比0. 8:1加入所得上清液中， 静置30min，在0°C、9000rpm条件下离心30min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并；将 沉淀以质量体积比1 :5溶解于pH7.2的0. 015mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液中，将 所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱SephadexG-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进 行洗脱，收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，用PEG4000浓缩，得浓缩液；
[0019] 3)在步骤2)所得浓缩液中加入NaCl，得到NaCl浓度为0. 5mol/L的溶液，将所得 溶液加入平衡好的镍离子螯合亲和柱顶端，用PH6. 0、0. 02mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾 缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质的洗脱液；
[0020] 4)取步骤3)所得洗脱液，用PEG4000浓缩，冷冻干燥，即得生物活性酶。
[0021] 为了保证制备得到的生物活性酶的活性，本发明各个步骤的操作温度均优选为 0 ?4。。。
[0022] 经高效液相色谱法等方法鉴定，本发明提供的生物活性酶的主要成分为过氧化氢 酶，且过氧化氢酶的含量在90%以上。
[0023] 本发明进一步保护所述生物活性酶在制备化妆品中的应用。
[0024] 与现有技术相比，本发明提供生物活性酶的提取工艺操作简便，安全、环保，且生 物活性酶产率高、纯度高、活性好，适于工业化大规模生产。
【具体实施方式】
[0025] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。本申请各实施例中的血红细胞按照常规采集方法采集于人 工养殖的猪。
[0026] 本发明各实施例中，洗脱液中硫酸铵的鉴别方法具体为：取1滴洗脱液，滴在白色 比色盘孔中，加入1滴奈氏试剂混合，若出现棕黄色沉淀则表明洗脱液中含有硫酸铵；洗脱 液中蛋白质的鉴别方法具体为：取1滴洗脱液，滴在黑色比色磁盘中，加入1滴20%磺基水 杨酸混合，若出现白色絮状沉淀则表明洗脱液中含有蛋白质。
[0027] 实施例1
[0028] 生物活性酶由以下步骤制备而成：
[0029] 1)将洗净后的血红细胞100ml与pH5. 0的0? 02mol/L柠檬酸缓冲液100ml混合， 用闪式提取器破碎血红细胞，其操作参数为：在5000rpm条件下提取，每次提取30s，共提取 3次，每次间隔2min;在3000rpm条件下离心15min，取上清液，即得粗酶液170ml;
[0030] 2)在步骤1)所得粗酶液中，加入68g硫酸铵溶解，静置30min，在0°C、8000rpm条 件下离心15min，分离上清液，收集沉淀；在所得上清液中加入65g硫酸按，静置30min，在 4°C、9000rpm条件下离心30min，收集沉淀；将两次收集所得的沉淀合并，得沉淀4. 41g;将 沉淀溶解于pH7. 2、0. 015mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液15ml中，将所得溶液加入 平衡好的葡聚糖凝胶柱SephadexG-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集含 有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，用PEG4000浓缩，得浓缩液7. 2ml;
[0031] 3)在步骤2)所得浓缩液中加入0.21gNaCl溶解，将所得溶液加入平衡好的镍离子 螯合亲和柱顶端，用PH6. 0、0. 02mol/L磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液进行洗脱，收集含有 蛋白质的洗脱液；
[0032] 4)用PEG4000浓缩步骤3)所得浓缩液，冷冻干燥，得白色粉末39. lmg。
[0033] 经蛋白凝胶电泳SDS-PAGE检测，所得产品分子量与市售过氧化氢酶标准品相同， 证明产物为过氧化氢酶。
[0034] 实施例2
[0035] 生物活性酶由以下步骤制备而成：
[0036] 1)将洗净后的血红细胞100ml与pH4. 8的0. 025mol/L柠檬酸缓冲液200mr混合， 用闪式提取器破碎血红细胞，其操作参数为：在8000rpm条件下提取，每次提取20s，共提取 2次，每次间隔2min;在3200rpm条件下离心5min，取上清液，即得粗酶液265ml;
[0037] 2)在步骤1)所得粗酶液中，加入132. 5g硫酸铵溶解，静置40min，在4°C、8500rpm 条件下离心lOmin，分离上清液，收集沉淀；在所得上清液中加入135g硫酸按，静置40mi