专利名称：一种鱿鱼内脏酶的提取工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从鱼类加工副产物中提取酶的方法，尤其涉及一种鱿鱼内脏酶的提取工艺。
背景技术：
鱿鱼是生活在海洋中的无脊椎动物，每年全球食用量非常大，而鱿鱼有30%左右的头、足、内脏及表皮等废弃物，其中内脏占15. 92%，通常被废弃和就地掩埋处理，这样既没有充分开发鱿鱼附加值，造成其中蛋白质资源的极大浪费，而且还存在着环境污染的隐患。随着鱿鱼加工业的不断发展，加工下脚料中内脏占大部分，鱿鱼内脏中含有丰富的酶，但至今还没有对其进行提取方法的研究。目前对鱿鱼内脏的利用主要集中在利用蛋白酶从鱿鱼内脏中提取鱼油和用其生产“鱿溶浆”，该法利用内源蛋白酶的自溶作用将鱿鱼内脏液化， 以得到蛋白水解液，但通过自溶作用获得的水解液存在明显的苦涩味和腥臭味，产品风味差。因此，有效地处理鱿鱼废弃物并进行高值化综合利用，具有较大的经济和环保价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提取方法设计合理、能将鱿鱼废弃物进行综合利用的鱿鱼内脏酶的提取工艺。本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种鱿鱼内脏酶的提取工艺，其特点是其步骤如下
(1)以新鲜的鱿鱼内脏为原料，将水浙干后，按质量体积比I:1 3向原料中加入丙酮，再用组织匀浆机处理成浆状；过滤，所得滤液经冷冻离心机0°C，3000r/min,离心5 15min,弃去上清液,沉淀用丙酮溶解,溶液再经离心机0°C,3000r/min,离心5 15min,弃去上清液，沉淀用丙酮溶解，所得溶液经离心机0°C, 3000r/min,离心5 15min,弃去上清液，取出沉淀在自然条件下风干，得丙酮干粉；
(2)碱性酶的提取将丙酮干粉按重量体积比I:8 12用pH为7. 5的20mM Tris-HCl溶解成均匀状态，经冷冻离心机0°C，3000 4000r/min离心10 20min后，得到上清液，沉淀再用pH为7. 5的20mM Tris-HCl处理后再次离心，弃去沉淀，上清液合并，过滤，得到鱿鱼内脏碱性酶液。本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还提供了另一种鱿鱼内脏酶的提取工艺，其特点是其步骤如下
(1)以新鲜的鱿鱼内脏为原料，将水浙干后，按质量体积比I:1 3向原料中加入丙酮，再用组织匀浆机处理成浆状；过滤，所得滤液经冷冻离心机0°C，3000r/min,离心5 15min,弃去上清液,沉淀用丙酮溶解,溶液再经离心机0°C,3000r/min,离心5 15min,弃去上清液，沉淀用丙酮溶解，所得溶液经离心机0°C, 3000r/min,离心5 15min,弃去上清液，取出沉淀在自然条件下风干，得丙酮干粉；
(2)酸性酶的提取将丙酮干粉按重量体积比I: 8 12用0. 065M HCl溶解成均匀状态，经冷冻离心机0°C, 3000 4000r/min,离心5 20min后，取上清液,沉淀再用0. 065MHCl缓冲液处理后再次离心，弃去沉淀，上清液合井，过滤，即得鱿鱼内脏酸性酶液。本发明所述的鱿鱼内脏酶的提取エ艺中可以将所得的碱性或者酸性酶液在-20°C _40°C的温度条件下保藏，作为酶液存入。或者经冷冻干燥，即得到高活性的鱿鱼内脏酶酶粉粗制品。保藏的温度条件最佳为-23. 5°C。与现有技术相比，本发明方法以鱿鱼加工废弃物为原料，从中提取内脏酶，有效利用鱿鱼加工过程中的副产物——内脏，变废为宝，避免了其中蛋白资源的浪费，減少对环境的污染。该エ艺简单，生产成本低，高效节能，本发明所得酶粉活性高，稳定性強，产品质量稳定，エ艺简単，生产周期短，提取率高，高效节能，适合 エ业化生产，有很好的经济效益和广阔的应用前景。
具体实施例方式以下进ー步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进ー步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。实施例1，ー种鱿鱼内脏酶的提取エ艺，其步骤如下
(1)以新鲜的鱿鱼内脏为原料，将水浙干后，按质量体积比I:1向原料中加入丙酮，再用组织匀浆机处理成浆状；过滤，所得滤液经冷冻离心机0°c，3000r/min,离心5min，弃去上清液，沉淀用丙酮溶解，溶液再经离心机0°C, 3000r/min,离心5min,弃去上清液,沉淀用丙酮溶解，所得溶液经离心机0°C,3000r/min,离心5min,弃去上清液,取出沉淀在自然条件下风干，得丙酮干粉；
(2)碱性酶的提取将丙酮干粉按重量体积比I:8用pH为7. 5的20mM Tris-HCl溶解成均匀状态，经冷冻离心机0°C，3000r/min离心IOmin后，得到上清液，沉淀再用pH为7. 5的20mM Tris-HCl处理后再次离心，弃去沉淀，上清液合并，过滤，得到鱿鱼内脏碱性酶液。实施例2，ー种鱿鱼内脏酶的提取エ艺，其步骤如下
(1)以新鲜的鱿鱼内脏为原料，将水浙干后，按质量体积比I: 3向原料中加入丙酮，再用组织匀浆机处理成浆状；过滤，所得滤液经冷冻离心机0°C，3000r/min,离心15min，弃去上清液，沉淀用丙酮溶解，溶液再经离心机0°C, 3000r/min,离心15min,弃去上清液,沉淀用丙酮溶解，所得溶液经离心机0°C, 3000r/min,离心15min,弃去上清液,取出沉淀在自然条件下风干，得丙酮干粉；
(2)碱性酶的提取将丙酮干粉按重量体积比I: 12用pH为7. 5的20mM Tris-HCl溶解成均匀状态，经冷冻离心机0°C，4000r/min离心20min后，得到上清液，沉淀再用pH为7. 5的20mM Tris-HCl处理后再次离心，弃去沉淀，上清液合并，过滤，得到鱿鱼内脏碱性酶液。实施例3，ー种鱿鱼内脏酶的提取エ艺，其步骤如下
(I)以新鲜的鱿鱼内脏为原料，将水浙干后，按质量体积比I :2向原料中加入丙酮，再用组织匀浆机处理成浆状；过滤，所得滤液经冷冻离心机0°C，3000r/min，离心lOmin，弃去上清液，沉淀用丙酮溶解，溶液再经离心机0°C，3000r/min,离心lOmin，弃去上清液，沉淀用丙酮溶解，所得溶液经离心机0°C, 3000r/min,离心lOmin,弃去上清液,取出沉淀在自然条件下风干，得丙酮干粉；(2)碱性酶的提取将丙酮干粉按重量体积比I :10用pH为7. 5的20mM Tris-HCl溶解成均匀状态，经冷冻离心机0°C，3500r/min离心15min后，得到上清液，沉淀再用pH为7. 5的20mM Tris-HCl处理后再次离心，弃去沉淀，上清液合并，过滤，得到鱿鱼内脏碱性酶液。实施例4，实施例1-3任何一项所述的鱿鱼内脏酶的提取エ艺中将所得的碱性酶液在_20°C的温度条件下保藏，或经冷冻干燥，即得到高活性的鱿鱼内脏酶酶粉粗制品。实施例5，实施例1-3任何一项所述的鱿鱼内脏酶的提取エ艺中将所得的碱性酶液在_40°C的温度条件下保藏，或经冷冻干燥，即得到高活性的鱿鱼内脏酶酶粉粗制品。实施例6，实施例1-3任何一项所述的鱿鱼内脏酶的提取エ艺中将所得的碱性酶液在-23. 5°C的温度条件下保藏，或经冷冻干燥，即得到高活性的鱿鱼内脏酶酶粉粗制品。实施例7，ー种鱿鱼内脏酶的提取エ艺，其步骤如下 (1)以新鲜的鱿鱼内脏为原料，将水浙干后，按质量体积比I:1向原料中加入丙酮，再用组织匀浆机处理成浆状；过滤，所得滤液经冷冻离心机0°c，3000r/min,离心5min，弃去上清液，沉淀用丙酮溶解，溶液再经离心机0°C, 3000r/min,离心5min,弃去上清液,沉淀用丙酮溶解，所得溶液经离心机0°C,3000r/min,离心5min,弃去上清液,取出沉淀在自然条件下风干，得丙酮干粉；
(2)酸性酶的提取将丙酮干粉按重量体积比I:8用0. 065M HCl溶解成均匀状态，经冷冻离心机0°C，3000r/min，离心5min后，取上清液，沉淀再用0. 065M HCl缓冲液处理后再次离心,弃去沉淀,上清液合并,过滤,即得鱿鱼内脏酸性酶液。实施例8，ー种鱿鱼内脏酶的提取エ艺，其步骤如下
(1)以新鲜的鱿鱼内脏为原料，将水浙干后，按质量体积比I:3向原料中加入丙酮，再用组织匀浆机处理成浆状；过滤，所得滤液经冷冻离心机0°C，3000r/min，离心15min，弃去上清液，沉淀用丙酮溶解，溶液再经离心机0°C,3000r/min,离心15min,弃去上清液,沉淀用丙酮溶解，所得溶液经离心机0°C, 3000r/min,离心15min,弃去上清液,取出沉淀在自然条件下风干，得丙酮干粉；
(2)酸性酶的提取将丙酮干粉按重量体积比I: 12用0. 065M HCl溶解成均匀状态，经冷冻离心机0°C，4000r/min，离心20min后，取上清液，沉淀再用0. 065M HCl缓冲液处理后再次离心,弃去沉淀,上清液合并,过滤，即得鱿鱼内脏酸性酶液。实施例9，ー种鱿鱼内脏酶的提取エ艺，其步骤如下
(1)以新鲜的鱿鱼内脏为原料，将水浙干后，按质量体积比I:2向原料中加入丙酮，再用组织匀浆机处理成浆状；过滤，所得滤液经冷冻离心机0°C，3000r/min,离心lOmin，弃去上清液，沉淀用丙酮溶解，溶液再经离心机0°C，3000r/min,离心lOmin，弃去上清液，沉淀用丙酮溶解，所得溶液经离心机0°C,3000r/min,离心IOmin,弃去上清液,取出沉淀在自然条件下风干，得丙酮干粉；
(2)酸性酶的提取将丙酮干粉按重量体积比I: 10用0. 065M HCl溶解成均匀状态，经冷冻离心机0°C，3500r/min，离心12min后，取上清液，沉淀再用0. 065M HCl缓冲液处理后再次离心,弃去沉淀,上清液合并,过滤,即得鱿鱼内脏酸性酶液。实施例10，实施例7-9任何一项所述的鱿鱼内脏酶的提取エ艺中将所得的酸性酶液在_20°C的温度条件下保藏，或经冷冻干燥，即得到高活性的鱿鱼内脏酶酶粉粗制品。实施例11，实施例7-9任何一项所述的鱿鱼内脏酶的提取エ艺中将所得的酸性酶液在_40°C的温度条件下保藏，或经冷冻干燥，即得到高活性的鱿鱼内脏酶酶粉粗制品。实施例12，实施例7-9任何一项所述的鱿鱼内脏酶的提取工艺中将所得的酸性酶液在-23. 5°C的温度条件下保藏，或经冷冻干燥，即得到高活性的鱿鱼内脏酶酶粉粗制品。酶是一种能催化反应过程的蛋白质，本发明通过酶活力的测定来验证所提取出来的物质是酶。蛋白酶在20°C、pH为7的条件下，水解酪素底物，然后 加入三氯乙酸终止酶反应，并将未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。酶活单位的定义每ImL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，Imin水解酪素产生Iug酪氨酸为一个酶活力单位，以(u/mL)表示。I.绘制L-酪氨酸标准曲线
(1)取0.05g L-酪氨酸溶于纯水中，定容至25ml，作为标准溶液I，其浓度为2mg/ml ；
(2)将标准溶液I稀释一倍作为标准溶液2，其浓度为lmg/ml；
(3)将标准溶液2稀释一倍作为标准溶液3，其浓度为0.5mg/ml ；
(4)将标准溶液3稀释一倍作为标准溶液4，其浓度为0.25mg/ml ；
(5)再将标准溶液4稀释一倍作为标准溶液5，其浓度为0.125mg/ml ；
(6)取标准溶液1、2、3、4、5各I.4ml，分别加0. 65ml 22. 5%三氯乙酸溶液，于290nm测其吸光度。(7)根据测得的吸光度值A为为纵坐标，标准溶液的浓度c为横坐标作出一条标准曲线。2.酶活力的测定
(I)碱性酶液活力测定
先将酪蛋白溶液放入40±0. 2°C恒温水浴中，预热5min，吸取适量稀释的碱性酶液2ml于试管中，加入酪蛋白2ml摇匀后放入20°C恒温水浴中反应20min，加入4ml 22. 5%三氯乙酸溶液震荡摇匀后置于冰水浴中lOmin，取出室温条件下6000r/min离心15 min，取上清液过滤，290nm测其吸光度。空白为先把酪蛋白与三氯乙酸混合IOmin后再加酶液，然后与反应液共同离心测吸光度值，以蒸馏水校准仪器。在20°C下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生I U g酪氨酸，定义为I个蛋白酶活力单位。X = AXKX 8/2 X 1/20 XnXE = 1/5 XAXKXnXE 式中X——样品的酶活力，(u/mL)；
A——试样溶液的平均吸光度；
K——吸光常数；
8——反应试剂的总体积，mL ；
2——吸取酶液2. OOmL ；
1/10-反应时间IOmin,以Imin计；
n——稀释倍数；
E——紫外法与福林法的换算系数(中性、碱性蛋白酶系数为0. 50)。
所得结果表示至整数。所得碱性酶液活力不低于12u/mL。(2)酸性酶活力测定
先将牛血红蛋白溶液放入40±0. 2°C恒温水浴中，预热5min，吸取适量稀释的酶液2ml于试管中，加入牛血红蛋白2ml摇匀后放入30°C恒温水浴中反应20min，加入4ml 22. 5%三氯こ酸溶液震荡摇勻后置于冰水浴中IOmin,取出室温条件下6000r/min离心15 min,取上清液过滤，275nm测其吸光度。空白为先把牛血红蛋白与三氯こ酸混合IOmin后再加酶液，然后与反应液共同离心测吸光度值，以蒸馏水校准仪器。在20°C下每毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生I U g酪氨酸，定义为I个蛋白酶活力単位。 X = AXKX 8/2 X 1/20 XnXE = 1/5 XAXKXnXE 式中X——样品的酶活力，(u/mL)；
A——试样溶液的平均吸光度；
K——吸光常数；
8——反应试剂的总体积，mL ；
2——吸取酶液2. OOmL ；
1/20-反应时间20min,以Imin计；
n——稀释倍数
E——紫外法与福林法的換算系数(酸性蛋白酶系数为0. 77)。所得酸性酶液活力不低于12u/mL。
权利要求
1.一种鱿鱼内脏酶的提取工艺，其特征在于其步骤如下 (1)以新鲜的鱿鱼内脏为原料，将水浙干后，按质量体积比I:1 3向原料中加入丙酮，再用组织匀浆机处理成浆状；过滤，所得滤液经冷冻离心机0°C，3000r/min,离心5 15min,弃去上清液,沉淀用丙酮溶解,溶液再经离心机0°C,3000r/min,离心5 15min,弃去上清液，沉淀用丙酮溶解，所得溶液经离心机0°C, 3000r/min,离心5 15min,弃去上清液，取出沉淀在自然条件下风干，得丙酮干粉； (2)碱性酶的提取将丙酮干粉按重量体积比I:8 12用pH为7. 5的20mM Tris-HCl溶解成均匀状态，经冷冻离心机0°C，3000 4000r/min离心10 20min后，得到上清液，沉淀再用pH为7. 5的20mM Tris-HCl处理后再次离心，弃去沉淀，上清液合并，过滤，得到鱿鱼内脏碱性酶液。
2.根据权利要求I所述的鱿鱼内脏酶的提取工艺，其特征在于将所得的碱性酶液在-20°C _40°C的温度条件下保藏，或经冷冻干燥，即得到高活性的鱿鱼内脏酶酶粉粗制品。
3.根据权利要求2所述的鱿鱼内脏酶的提取工艺，其特征在于保藏的温度条件为-23. 5。。。
4.一种鱿鱼内脏酶的提取工艺，其特征在于其步骤如下 (1)以新鲜的鱿鱼内脏为原料，将水浙干后，按质量体积比I:1 3向原料中加入丙酮，再用组织匀浆机处理成浆状；过滤，所得滤液经冷冻离心机0°C，3000r/min，离心5 15min,弃去上清液,沉淀用丙酮溶解，溶液再经离心机0°C, 3000r/min,离心5 15min,弃去上清液，沉淀用丙酮溶解，所得溶液经离心机0°C,3000r/min,离心5 15min,弃去上清液，取出沉淀在自然条件下风干，得丙酮干粉； (2)酸性酶的提取将丙酮干粉按重量体积比I: 8 12用0. 065M HCl溶解成均匀状态，经冷冻离心机(TC, 3000 4000r/min,离心5 20min后，取上清液,沉淀再用0. 065MHCl缓冲液处理后再次离心，弃去沉淀，上清液合并，过滤，即得鱿鱼内脏酸性酶液。
5.根据权利要求4所述的鱿鱼内脏酶的提取工艺，其特征在于将所得的酸性酶液在_20°C _40°C温度条件下保藏，或经冷冻干燥，即得到高活性的鱿鱼内脏酶酶粉粗制品。
6.根据权利要求5所述的鱿鱼内脏酶的提取工艺，其特征在于保藏的温度条件为-23. 5。。。
全文摘要
本发明是一种鱿鱼内脏酶的提取工艺，它以新鲜的鱿鱼内脏为原料，将水沥干后，按质量体积比11～3向原料中加入丙酮，再用组织匀浆机处理成浆状；过滤，所得滤液经冷冻离心机后，取出沉淀在自然条件下风干，得丙酮干粉；将丙酮干粉按重量体积比18～12用pH为7.5的20mMTris-HCl溶解成均匀状态，经冷冻离心机，沉淀再用pH为7.5的20mMTris-HCl处理后再次离心，上清液合并，过滤，得到鱿鱼内脏碱性酶液。本发明方法以鱿鱼加工废弃物为原料，从中提取内脏酶，避免了其中蛋白资源的浪费，减少对环境的污染。该工艺简单，生产成本低，高效节能，本发明所得酶粉活性高，稳定性强，产品质量稳定，工艺简单，生产周期短，提取率高，高效节能，适合工业化生产，有很好的经济效益和广阔的应用前景。
文档编号C12N9/64GK102787110SQ20121021795
公开日2012年11月21日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者张俊杰, 朱勤, 段蕊, 陈忆凤 申请人:江苏天福莱集团有限公司