用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种通过弱直流电刺激活体水蛭，使水蛭头部腺体释放腺液，同时通过控制电流的强度，确保水蛭保持活体状态，从而实现在有限的水蛭活体资源条件下，多次从活体水蛭的腺液中获得高纯度水蛭素的方法。
【背景技术】
[0002]水蛭素(hirudin)因最早从水蛭中分离得到而得名。天然水蛭素由65个氨基酸残基组成，分子量7000道尔顿，属水溶性动物蛋白肽。水蛭素具有使凝血酶失活的功能，功能机理是它通过与凝血酶的催化中心及纤维蛋白原结合中心发生不可逆的结合，从而达到凝血酶不能实现凝血功能。水蛭素是目前发现的、源于动物的最强有力的凝血酶抑制剂。水蛭素通过对凝血酶的失活作用，从而在人体内实现了很强的抗血栓作用，对多种实验性血栓模型有阻抑作用。水蛭素对于各种血栓疾病如静脉血栓、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓都有预防和治疗效果，尤其是静脉血栓和弥漫性血管内凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管成形术后再栓塞；改善体外血液循环和血液透析过程，在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。所以基于上述功效，人类出于对疾病的治疗和健康保健的需要，对水蛭素产生了巨大的需求。
[0003]工业化生产水蛭素的方法中除重组水蛭素的生产外，多以对水蛭活体的破坏方法获得水蛭素，一方面影响所得水蛭素的纯度，更重要的是水蛭资源的供应的严重依赖。在动物生理方面，弱直流电流对生物体腺体的是有刺激影响作用，可以使生物腺体产生应激反应。在水蛭素的提取上，直接使用直流弱电刺激活体水蛭，使其唾液腺体应激分泌富含水蛭素的唾液，以实现批量提取高纯度水蛭素的方式并通过对电流的控制保持水蛭的活体性状的方法，简化了水蛭素的生产工艺，提高产品纯度，保持野生水蛭资源的重复利用，降低生产成本，克服生产的季节性障碍问题的方法，至今尚未有成功实现的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法，它能解决上述水蛭素提取存在的实际问题，具有很强的针对性。
[0005]为了达到上述目的，本发明采取以下步骤:
[0006]步骤1，提取分泌物:通过弱直流电刺激活体水蛭，以获得在电流刺激下水蛭唾液腺体应激产生的分泌物；
[0007]步骤2，配制保护剂:添加0.005?0.05%海藻糖、0.005?0.02%乙酰半膀氨酸，0.005?0.05%枸杞酸钠为组合保护剂以保持水蛭分泌物中所含抗凝血酶的高活性；
[0008]步骤3，分泌物处理:将分泌物经过800 μ m纳滤膜后续处理30?180分钟，除去水分及盐，添加I?15%医用淀粉；
[0009]步骤4，干燥:减压至0.9大气压下，在进口温度为230?180°C，出口温度90?75°C下进行喷雾干燥，获得含800AT-U/g的高活性抗凝血酶活性水蛭素干粉；
[0010]上述所得的高活性抗凝血酶活性水蛭素干粉用于预防和治疗脉血栓、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓等疾病。
[0011]优选的，步骤I中，采用直电流为3?12mA，进行电刺激活体水蛭5?20分钟后，获得在电流刺激下水蛭产生的分泌物
[0012]本发明具有以下有益效果:本发明简化了水蛭素的生产工艺，提高产品纯度，保持野生水蛭资源的重复利用，降低生产成本，克服生产的季节性障碍问题的方法。另外本产品中水輕素中抗凝血酶的活性含量达到800 (干粉)或1000 (液体)AT-U/g。
【具体实施方式】
[0013]下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0014]实施例1:
[0015]在I?30度室温，先将活体水蛭从饲养槽中取至贮藏槽，用去离子水漂洗20分钟出去活体水蛭表面的杂质，滤出水分，再浸入生理盐水漂洗20秒，使水蛭表面覆盖电解质，滤除盐水，置入底200目滤网的长方形不锈钢滤槽内(滤槽与地面绝缘)平铺，滤网下为同面积已消毒洁净器皿，滤槽两端分别连接直流电的两极，调整至最小的输出电流，合并电源开关，调整电流为I?20mA，5?30分钟后，断开电源，收取器皿中滤槽滴出的液体，后将水蛭从滤槽中倒回贮藏槽，再倒回饲养槽。
[0016]器皿中滤槽滴出的液体大部分为水蛭素有效成分，经过800 μm纳滤膜后续处理30?180分钟可以除90%水，后通过添加1%?15%的医用淀粉，减压至0.2?0.9大气压喷雾干燥100?180度下获得含高活性(800?200AT-U/g)抗凝血酶活性水蛭素干粉。
[0017]实施例2
[0018]在I?30度室温，先将活体水蛭从饲养槽中取至贮藏槽，用去离子水漂洗2分钟出去活体水蛭表面的杂质，滤出水分，再浸入生理盐水漂洗20秒，置入底不锈钢网的吊篮内，浸入装有0.5?1%浓度的盐水槽中，盐水槽内通入直流电，使得槽中盐水处于带电状态，调整至最小的输出电流，合并电源开关，调整电流为I?20mA，5?30分钟后，移出，后将水蛭从锈钢网的吊篮内倒回贮藏槽，再倒回饲养槽，同时重复将新装活体水蛭的另个锈钢网的吊篮浸入盐水槽中，实现活体水蛭提取水蛭素的连续生产。
[0019]盐水槽中滴出的液体大部分为水蛭素有效成分和盐水溶液混合物，经过800 μ m纳滤膜后续处理30?180分钟可以除90%水和盐，后通过添加0.005?0.05%海藻糖、0.005?0.02%乙酰半膀氨酸，0.005?0.05%枸杞酸钠配制的混合稳定剂，制成含500?1000AT-U/g抗凝血酶活性水蛭素含水混合物。可直接常温贮藏也可以通过喷雾干燥得到水蛭素干粉。
[0020]实施例3
[0021]在I?30度室温，先将活体水蛭从饲养槽中取至贮藏槽，用去离子水漂洗2分钟出去活体水蛭表面的杂质，滤出水分，置入50?200升塑料桶中，再倒入0.5?1%浓度的盐水，盐水的量为水蛭量的体积与盐水体积比为1:0.5?1.5，塑料桶内底部放置金属电极，塑料桶顶端放置金属电极到液面，分别连接直流电的两极，调整至最小的输出电流，合并电源开关，缓慢调整电流为I?20mA，5?30分钟后，断开电源，将水蛭从塑料桶中倒回贮藏槽，后将再倒回饲养槽。将塑料桶中的液体收集，这部分液体大部分为水蛭素有效成分和盐水溶液混合物，经过800 μπι纳滤膜后续处理30分钟可以除90%水和盐，后通过添加5%?11%的医用淀粉，减压至0.2?0.9大气压喷雾干燥100?180度下获得含高活性(800?200AT-U/g)抗凝血酶活性水蛭素干粉。
[0022]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法，其特征在于该水蛭素活体水蛭通过电刺激提取，包括以下步骤: 步骤1，提取分泌物:通过弱直流电刺激活体水蛭，以获得在电流刺激下水蛭唾液腺体应激产生的分泌物； 步骤2，配制保护剂:添加0.005?0.05%海藻糖、0.005?0.02%乙酰半膀氨酸，0.005?0.05%枸杞酸钠为组合保护剂以保持水蛭分泌物中所含抗凝血酶的高活性； 步骤3，分泌物处理:将分泌物经过800 μ m纳滤膜后续处理30?180分钟，除去水分及盐，添加I?15%医用淀粉； 步骤4，干燥:减压至0.9大气压下，在进口温度为230?180°C，出口温度90?75°C下进行喷雾干燥，获得含800AT-U/g的高活性抗凝血酶活性水蛭素干粉； 上述所得的高活性抗凝血酶活性水蛭素干粉用于预防和治疗脉血栓、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓等疾病。2.根据权利要求1所述的用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法，其特征在于:步骤I中，采用直电流为3?12mA，进行电刺激活体水蛭5?20分钟后，获得在电流刺激下水蛭产生的分泌物。
【专利摘要】本发明公开一种用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法，其步骤如下：该提取的方法通过提取分泌物、配制保护剂、分泌物处理和干燥四个步骤，所得到的干粉，它保存了活体水蛭最主要的有效活性成分——水蛭素，可以用于预防和治疗脉血栓、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓等疾病。本发明能够简化水蛭素的生产工艺，同时保持水蛭的活体，多次提取高纯度水蛭素。
【IPC分类】C07K1/14, C07K14/815
【公开号】CN105153298
【申请号】CN201510542685
【发明人】苏国强, 刁建中
【申请人】南宁市金贝生物技术有限责任公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年8月31日