专利名称：一种水蛭素的双水相-反胶束提取法的制作方法
技术领域：
本发明属医药制剂技术领域，涉及
材料的水蛭素提取技术。
种水蛭素的提取技术，特别是以菲牛蛭为原
背景技术：
调查数据表明，当今危害人类健康的主要疾病是心脑血管疾病。心脑血管疾病发 生的主要原因是体内形成的血栓，而凝血酶是导致血栓形成的主要因素。水蛭素能与凝血 酶特异性结合使之丧失凝血活力。临床试验表明，水蛭蛭素既能使血栓融化从而消除或缓 解病情，也能防止血栓形成，具有极好的预防和治疗血栓性心脑血管疾病的效果。现存的水 蛭素类药物剂型主要为注射剂和口服片剂。目前，水蛭素主要以菲牛蛭、欧洲医用水蛭、印 度水蛭、亚马逊巨型水蛭等为原材料提取。 目前，国内外提取水蛭素的方法有多种。例如1970年Markwardt采用的乙醇分 级沉淀、阳离子交换、凝胶过滤以及阴离子交换等步骤获得水蛭素。中国专利〈申请号 >92107076〈发明名称 > 医用天然水蛭素的提取方法，是将水蛭捣碎成浆状，加热，用冰醋酸 调pH值，冷却至室温，用Na2C03溶液调pH值，离心收集滤液，沉淀用生理盐水浸提2 3次， 离心收集液滤。合并全部液滤，透析，透析液用95%以上的乙醇沉淀，静置，收集沉淀，低温 干燥得到水蛭素。水蛭素可以用于生产口服片剂或口服液。这些工艺的不足之处是提取步 骤多，过程复杂，周期长。
发明内容
本发明的目的是提供一种水蛭素的双水相_反胶束提取法，以菲牛蛭为原材料， 克服上述工艺的不足之处是提取步骤多，过程复杂，周期长的不足之处。 本发明包括原材料处理、水蛭素粗产品提取及水蛭素粗产品纯化步骤，将原材料 处理后，加入生理盐水搅拌，离心得水相和沉淀；取水相备用，沉淀用组织捣碎机捣成浆 状，加生理盐水搅拌，离心得水相和沉淀；取水相备用，沉淀再用组织捣碎机捣成浆状后， 用生理盐水重复处理一次；离心，去沉淀取水相；合并3次的水相，加入硫酸钠使浓度为 0. 05mol L—、加入聚乙二醇6000使质量浓度为30 % ，搅拌，离心分离，取上相水溶液，加 入无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心取沉淀称重后溶解于生理盐水中，用盐酸溶液调至 pHl. 8 2. 0得酸性水蛭素提取液。另取正辛烷加入丁二酸_2-乙基己基酯磺酸钠使浓度 达到0. 05 0. 07mol L—、搅拌，得反胶束提取液。加入相当于其体积二分之一的上述酸 性水蛭素提取液，搅拌，离心分离，取上相加入1. 5 2倍体积pH9. 3 9. 5的生理盐水，搅 拌，离心取下相，加无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心取沉淀得水蛭素。
所述的原材料处理是，将菲牛蛭鲜活个体放入80 90°C的热水中2 3分钟， 迅速捞出，放冷至室温，沥至半干；或将于_181:保存的菲牛蛭个体取出，放至室温，沥至半 干。将沥至半干的菲牛蛭个体于组织捣碎机中以10000 12000r/min处理5 6分钟使 之成浆状。
所述的水蛭素粗产品提取是，将预处理过的浆状原材料加入2 2. 5倍重量的生 理盐水搅拌2. 5 3小时，离心取水相，沉淀用组织捣碎机10000 12000r/min处理2 3 分钟捣成浆状，按浆状原材料的量加入1. 5 2倍生理盐水，240 300r/min搅拌2 2. 5 小时，离心取水相，沉淀再用组织捣碎机10000 12000r/min处理2 3min捣成浆状，按 浆状原材料的量加入1 1. 5倍生理盐水搅拌2 2. 5小时，离心去沉淀，取水相，合并3 次的水相，此即为水蛭素粗产品水溶液。 所述的水蛭素纯化是在水蛭素粗产品水溶液中加入硫酸钠使浓度为 0. 05mol L—、加入聚乙二醇6000使质量浓度为30%，240 300r/min搅拌30分钟，离心 分离形成上、下相，取上相水溶液，加入2. 8 3倍无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心。取沉 淀称重，溶解于4倍重量的生理盐水中，用0. 05mol *L—1的HC1溶液调至pHl. 8，得酸性水蛭 素溶液。另取正辛烷加入丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠使浓度达到0. 05 0. 07mol L—、 搅拌，得反胶束提取液。加入相当于其体积二分之一的酸性水蛭素溶液，搅拌，离心分离，取 上相加入1. 5 2倍体积pH9. 3 9. 5的生理盐水，搅拌，离心取下相，加无水乙醇搅拌均 匀，冷藏过夜，离心取沉淀得水蛭素。 关键试剂优选的使用浓度为丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠浓度0. 06mol *L—、生 理盐水pH9. 4。 与现有的技术相比，本发明的突出的优点和显著的进步是于没有层析的操作步 骤，所以提取过程简单，生产周期縮短，提取液体积小，乙醇的使用量明显减少，水蛭素的收率高。
具体实施方式
实施例l: 1)将菲牛蛭鲜活个体放入80 9(TC的热水中2 3分钟，迅速捞出，放冷至室温，
沥至半干；或将于_181:保存的菲牛蛭个体取出，放至室温，沥至半干。 2)取一定量将沥至半干的菲牛蛭个体于组织捣碎机中以10000 12000r/min处
理5 6分钟捣成浆状。 3)取一定量浆状物按重量加入2 2. 5倍的生理盐水240 300r/min搅拌2. 5 3小时。 4) 4000 4500r/min离心10分钟取水相，备用，沉淀用组织捣碎机10000 12000r/min处理2 3分钟捣成桨状。 5)按步骤3)桨状物的重量加入1. 5 2倍生理盐水240 300r/min搅拌2 2. 5小时。 6) 4000 4500r/min离心10分钟取水相，备用，沉淀用组织捣碎机10000 12000r/min处理2 3分钟捣成桨状。 7)按步骤3)桨状物的重量加入1 1. 5倍生理盐水240 300r/min搅拌2 2. 5小时，4000 4500r/min离心10分钟去沉淀，取水相备用。 8)合并3次的水相，加入硫酸钠使浓度为0. 05mol L—、加聚乙二醇6000使质量
浓度为30% ，240 300r/min搅拌30分钟。9)4000 4500r/min离心20分钟，分离上、下相。
10)取上相水溶液加入2. 8 3倍无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，4000 4500r/ min离心IO分钟取沉淀。 11)沉淀溶解于4倍重量的生理盐水中，用0. 05mol L—1的HC1溶液调至pHl. 8， 得酸性水蛭素溶液。 12)正辛烷加入丁二酸_2-乙基己基酯磺酸钠使浓度达到0. 06mol L—、240 300r/min搅拌30分钟，得反胶束提取液。 13)酸性水蛭素溶液加入2倍体积反胶束提取液，240 300r/min搅拌30分钟。
14)4000 4500r/min离心30分钟，取上相。 15)上相溶液加入1. 5 2倍体积pH9. 4的生理盐水，240 300r/min搅拌30分钟。 16) 4000 4500r/min离心30分钟取下相，加2. 8 3倍无水乙醇混合均匀，冷藏 过夜。 17) 4000 4500r/min离心30分钟取沉淀得水蛭素。
实施例2 : 根据实施例l，加入丁二酸_2-乙基己基酯磺酸钠使浓度达到0. 05mol L—、上相 溶液加入1. 5 2倍体积pH9. 5的生理盐水，其余同实施例1。
实施例3: 根据实施例l，加入丁二酸_2-乙基己基酯磺酸钠使浓度达到0. 07mol L—、上相 溶液加入1. 5 2倍体积pH9. 3的生理盐水，其余同实施例1。
权利要求
一种水蛭素的双水相-反胶束提取法，其特征在于包括原材料处理、水蛭素粗产品提取及水蛭素粗产品纯化步骤，将原材料处理后，加入生理盐水搅拌，离心得水相和沉淀；取水相备用，沉淀用组织捣碎机捣成浆状，加生理盐水搅拌，离心得水相和沉淀；取水相备用，沉淀再用组织捣碎机捣成浆状后，用生理盐水重复处理一次；离心，去沉淀取水相；合并3次的水相，加入硫酸钠使浓度为0.05mol·L-1，加入聚乙二醇6000使质量浓度为30％，搅拌，离心分离，取上相水溶液，加入无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心取沉淀称重后溶解于生理盐水中，用盐酸溶液调至pH1.8～2.0得酸性水蛭素提取液。另取正辛烷加入丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠使浓度达到0.05～0.07mol·L-1，搅拌，得反胶束提取液。加入相当于其体积二分之一的上述酸性水蛭素提取液，搅拌，离心分离，取上相加入1.5～2倍体积pH9.3～9.5的生理盐水，搅拌，离心取下相，加无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心取沉淀得水蛭素。
2. 据权利要求1所述的一种水蛭素的双水相_反胶束提取法，其特征在于所述的原材料处理是将菲牛蛭鲜活个体放入80 90°C的热水中2 3分钟，迅速捞出，放冷至室温，沥至半干；或将于-18t:保存的菲牛蛭个体取出，放至室温，沥至半干。将沥至半干的菲牛蛭个体于组织捣碎机中以10000 12000r/min处理5 6分钟使之成浆状。
3. 据权利要求1所述的一种水蛭素的双水相_反胶束提取法，其特征在于所述的水蛭素粗产品提取是将预处理过的浆状原材料加入2 2. 5倍重量的生理盐水搅拌2. 5 3小时，离心取水相，沉淀用组织捣碎机10000 12000r/min处理2 3分钟捣成浆状，按浆状原材料的量加入1. 5 2倍生理盐水，240 300r/min搅拌2 2. 5小时，离心取水相，沉淀再用组织捣碎机10000 12000r/min处理2 3min捣成浆状，按浆状原材料的量加入1 1. 5倍生理盐水搅拌2 2. 5小时，离心去沉淀，取水相，合并3次的水相，此即为水蛭素粗产品水溶液。
4. 据权利要求1所述的一种水蛭素的双水相_反胶束提取法，其特征在于所述的水蛭素纯化是在水蛭素粗产品水溶液中加入硫酸钠使浓度为0. 05mol L—、加入聚乙二醇6000使质量浓度为30 % ， 240 300r/min搅拌30分钟，离心分离形成上、下相，取上相水溶液，加入2. 8 3倍无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心；取沉淀称重，溶解于4倍重量的生理盐水中，用0. 05mol L—1的HC1溶液调至pHl. 8，得酸性水蛭素溶液；另取正辛烷加入丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠使浓度达到0. 05 0. 07mol L—、搅拌，得反胶束提取液。加入相当于其体积二分之一的酸性水蛭素溶液，搅拌，离心分离，取上相加入1. 5 2倍体积pH9. 3 9. 5的生理盐水，搅拌，离心取下相，加无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心取沉淀得水蛭素。
5. 据权利要求4所述的一种水蛭素的双水相-反胶束提取法，其特征在于关键试剂优选的使用浓度为丁二酸_2-乙基己基酯磺酸钠浓度0. 06mol L—、生理盐水pH9. 4。
全文摘要
一种水蛭素的双水相-反胶束提取法，将原材料处理后，加生理盐水搅拌，离心得水相和沉淀。取水相备用，沉淀捣成浆状，加生理盐水搅拌，离心得水相和沉淀。取水相备用，沉淀捣成浆状，用生理盐水重复处理一次。离心，去沉淀取水相。合并3次的水相，加硫酸钠和聚乙二醇，搅拌，离心分离，取上相水溶液，加无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心取沉淀称重后溶解于生理盐水中，用盐酸调酸性水蛭素溶液。另取正辛烷加丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠，搅拌，得反胶束提取液。加酸性水蛭素溶液，搅拌，离心分离，取上相加生理盐水，搅拌，离心取下相，加无水乙醇搅拌均匀，冷藏过夜，离心取沉淀得水蛭素。本发明生产周期短，水蛭素提取率高，乙醇使用量少。
文档编号C07K14/81GK101759802SQ200910194320
公开日2010年6月30日 申请日期2009年11月27日 优先权日2009年11月27日
发明者宋文东, 方富永, 王宏波, 苗艳丽 申请人:广东海洋大学