专利名称：靶向性wwox基因重组腺病毒及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组腺病毒，特别涉及靶向性WffOX基因重组腺病毒，还涉及该重 组腺病毒的制备方法和应用。
背景技术：
肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，肿瘤治疗新方法的研究一直是医学和生命科学 研究的重点。肿瘤生物治疗已被世界医学界公认为是继手术、放射治疗和化学治疗之后的 第四大治疗方法，其中肿瘤基因治疗更是目前肿瘤生物治疗中最活跃的研究领域之一。肿 瘤基因治疗的原理是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使靶细胞表达此基因而获得 特定的功能，继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用，从而达到治疗之目的。氧化还原酶的双色氨酸域(WW domain-containing oxidoreductase, WffOX)基因 是跨越了整个常见染色体脆性部位FRA16D的一个新的抑癌基因，在肺癌、胃癌等多种人类 恶性肿瘤中表达降低或缺失。WWOX蛋白包含两个功能区即N末端的两个Wff域(双色氨酸 域)和C末端的SDR区(氧化还原酶区)，Wff域易与富含脯氨酸的结构结合，参与蛋白之间 的相互作用；SDR区与类固醇激素代谢有关。根据WffOX蛋白结构推测其可能通过与其他蛋 白相互作用和参与激素代谢来干预肿瘤生长。在肿瘤基因治疗中，为了提高杀伤肿瘤细胞的特异性，寻找肿瘤细胞与正常细胞 的差异十分重要。其中，以外源性肿瘤特异性启动子调控目的基因的表达是一种重要的技 术手段。生存素(Survivin)是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，具有抑制细胞凋亡和 维持细胞有丝分裂的双重功能。Survivin在正常的终末分化组织中几乎不表达，但在几乎 所有恶性肿瘤组织中高表达，并与疾病的进展、预后密切相关。既往研究已经证实，在肺癌、 胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胶质瘤及黑色素瘤等肿瘤中，Survivin启动子都具有较强的调 控能力，表明Survivin启动子是一个广谱的肿瘤特异性启动子。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种靶向性WWOX基因重组腺病毒，通过肿 瘤特异性启动子控制WffOX基因的表达，使WffOX基因能选择性地表达于肿瘤细胞中，从而准 确杀伤肿瘤细胞，尽量减少正常组织的损伤；目的之二在于提供所述靶向性WffOX基因重组 腺病毒的制备方法；目的之三在于提供所述靶向性WffOX基因重组腺病毒在医药方面的应用。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案1、靶向性WffOX基因重组腺病毒，所述重组腺病毒含有一个WWOX基因表达盒，所 述WffOX基因表达盒包含Survivin启动子、WffOX基因和终止子，所述WffOX基因的表达由 Survivin启动子调控。进一步，所述重组腺病毒是将WffOX基因表达盒插入复制缺陷5型腺病毒基因组中 而得到。
2、所述靶向性WffOX基因重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤a、Survivin启动子的克隆根据Survivin基因启动子片段的核苷酸序列设计并 合成引物，以人喉癌Hep-2细胞基因组DNA为模板，PCR扩增两端分别带有Xho I酶切位点和Nco I酶切位点的Survivin启动子片段，克隆入pGEM-T载体，得重组载体pGEM-T/SurP ；
b、WffOX基因的克隆根据WffOX基因的核苷酸序列设计并合成引物，将人胚胎肾 293细胞总RNA逆转录为总cDNA，再以总cDNA为模板，PCR扩增两端分别带有Hind III酶 切位点和BamH I酶切位点的WffOX基因，克隆入pMD18_T载体，得重组载体pMD18-T/WW0X ； 再自重组载体PMD18-T/WW0X中用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切出WffOX基因， 与同样经Hind III和BamH I双酶切的真核表达载体pcDNA3. 1 (+)在T4 DNA连接酶的作 用下连接，得重组载体pcDNA3. I-WffOX ；c、Survivin启动子调控WffOX基因重组腺病毒穿梭载体的构建自重组载体 pGEM-T/SurP中用Xho I和Nco I双酶切出Survivin启动子片段，与同样经Xho I和 Nco I双酶切的重组载体pcDNA3. I-WffOX在T4 DNA连接酶的作用下连接，得重组载体 pcDNA3. I-SurP-WffOX ；再自重组载体 pcDNA3. 1-SurP-ffffOX 中用 Xho I 和 BamH I 双酶切出 SurP-WffOX片段，与同样经Xho I和BamH I双酶切的腺病毒穿梭载体pShuttle在T4 DNA 连接酶的作用下连接，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-SurP-WWOX ；d、Survivin启动子调控WffOX基因重组腺病毒载体的构建将重组腺病毒穿梭载 体pShuttle-SurP-WWOX用Pme I酶切线性化后，与腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι共转染大肠 杆菌BJ5183感受态细胞进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd-SurP-Apoptin ；e、SurViVin启动子调控WffOX基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化用脂质体法将 重组腺病毒载体pAd-SurP-Apoptin转染人胚胎肾293细胞，待细胞出现明显病变时，离心 收集细胞，反复冻融使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重组腺病 毒Ad-SurP-Apoptin原液；将病毒原液再感染293细胞以扩增病毒，所得含病毒的上清液采 用氯化铯梯度离心纯化。进一步，步骤a中所述引物序列为上游弓丨物5，-gcctcgagctggccatagaaccagagaagtga-3，；下游弓丨物5，-gcccatggccacctctgccaacgggtcccgcg-3，；进一步，步骤a中所述PCR循环条件参数为94°C预变性3分钟，然后94°C变性1 分钟、58°C退火1分钟，72°C延伸1. 5分钟，共30个循环，最后72°C延伸7分钟；进一步，步骤b中所述引物序列为上游弓丨物5，-gggaagcttttggagcgggagtgag-3‘；下游弓丨物5，-atgggatcccagcagttgttgaagtaca-3，；进一步，步骤b中所述PCR循环条件参数为94°C预变性3分钟，然后94°C变性30 秒、65 °C退火1分钟，72 °C延伸1分钟，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。3、所述靶向性WffOX基因重组腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的有益效果在于本发明的靶向性WWOX基因重组腺病毒具有较强的选择 性和特异性，通过肿瘤特异性Survivin启动子控制WffOX基因的表达，使WffOX基因选择性 地表达于肿瘤细胞中，从而能够在准确杀伤肿瘤细胞的同时尽量减少正常组织的损伤；体 内外研究结果显示，本发明的重组腺病毒能够有效并且特异地诱导肿瘤细胞的凋亡，能够有效并且特异地抑制肿瘤细胞的克隆，能够有效抑制肿瘤细胞的生长，同时能够延长荷瘤 裸鼠的平均生存期并提高平均生存率；此外，该重组腺病毒还具有转染效率高，稳定性好， 肿瘤治疗谱广，制备方法简单等优点，可用于制备抗肿瘤药物，在肿瘤基因治疗领域有着良 好的开发应用前景。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中图1为Survivin启动子PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；图2为WffOX基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；图3为感染本发明重组腺病毒的肿瘤细胞和正常组织细胞的凋亡率比较图；图4为感染本发明重组腺病毒的肿瘤细胞和正常组织细胞的克隆形成率比较图；图5为给予本发明重组腺病毒或PBS的荷瘤裸鼠的肿瘤生长曲线；图6为给予本发明重组腺病毒或PBS的荷瘤裸鼠的平均生存率。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、靶向性WffOX基因重组腺病毒的制备1、Survivin启动子的克隆采用基因组DNA提取试剂盒提取人喉癌H印-2细胞基因组DNA，按照试剂盒说明书 操作。以所得细胞基因组 DNA 为模板，以 Fl 5‘-gcctcgagctggccatagaacca-gagaagtga-3‘ (SEQ ID No. 1，下划线部分为限制性内切酶Xho I酶切位点)和Rl ^'-gcccatggccacctct gccaacgggtcccgcg-3，(SEQ ID No. 2，下划线部分为限制性内切酶Nco I酶切位点)为上下 游引物，采用PCR试剂盒扩增Survivin启动子片段，按照试剂盒说明书操作。PCR循环条件 参数为94°C预变性3分钟，然后94°C变性1分钟、58°C退火1分钟，72°C延伸1. 5分钟，共 30个循环，最后72°C延伸7分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回 收纯化后，与PGEM-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉 素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为pGEM-T/SurP。琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约980bp处出现唯一特异性条带(图1)，与 目的片段大小相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列(SEQ IDNo. 3)与GenBank 登录号为U75285的Survivin启动子片段序列一致。2、WffOX基因的克隆采用Trizol试剂提取人胚胎肾(HEK) 293细胞总RNA，按照试剂说明书操作。将所 得细胞总RNA逆转录为总cDNA，再以总cDNA为模板，以F2 :5，-ggg-aagcttttggagcgggagt gag-3' (SEQ ID No. 4，下划线部分为限制性内切酶Hind III酶切位点)和R2 :5，-atggg^ cccagcagttgttgaagtaca-3' (SEQ ID No. 5，下划线部分为限制性内切酶BamH I酶切位点) 为上下游引物，采用PCR试剂盒扩增WffOX基因，按照试剂盒说明书操作。PCR循环条件参数为94°C预变性3分钟，然后94°C变性30秒、65°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，共30个循 环，最后72°C延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯 化后，与PMD18-T载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素 的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为PMD18-T/WWOX。琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR产物在约1250bp处出现唯一特异性条带(图1)，与 目的片段大小相符；测序结果显示阳性克隆质粒的插入基因序列(SEQ IDNo. 6)与GenBank 登录号为NP_057457的WffOX基因序列一致。自阳性克隆质粒pMD18-T/WW0X中用Hind III禾Π BamH I双酶切出WffOX基因， 与同样经Hind III和BamH I双酶切的真核表达载体pcDNA3. 1⑴在T4DNA连接酶的作 用下连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选 阳性克隆，抽提质粒，Hind III和BamH I双酶切鉴定及测序鉴定，将阳性克隆质粒命名为 pcDNA3. I-WffOX03、Survivin启动子调控WffOX基因重组腺病毒穿梭载体的构建自阳性克隆质粒pGEM-T/SurP中用Xho I和Nco I双酶切出Survivin启动子片 段，与同样经Xho I和Nco I双酶切的阳性克隆质粒pcDNA3. I-WffOX在T4 DNA连接酶的作用 下连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性 克隆，抽提质粒，Xho I和Nco I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为pcDNA3. 1-SurP-ffffOX。自阳性克隆质粒pcDNA3. 1-SurP-ffffOX中用Xho I和BamH I双酶切出SurP-ffffOX 片段，与同样经Xho I和BamH I双酶切的腺病毒穿梭载体pShuttle在T4 DNA连接酶的作 用下连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳 性克隆，抽提质粒，Xho I和BamH I双酶切鉴定，所得阳性克隆质粒即为Survivin启动子 调控WffOX基因重组腺病毒穿梭载体，将其命名为pShuttle-SurP-WWOX。4、Survivin启动子调控WffOX基因重组腺病毒载体的构建将重组腺病毒穿梭载体pShuttle-SurP-WWOX用Pme I酶切线性化后，与腺病毒骨 架载体pAdEasy-Ι同时电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行胞内同源重组，用含有卡那 霉素的LB平板筛选阳性克隆，抽提质粒，Pac I酶切鉴定，所得阳性克隆质粒即为Survivin 启动子调控WWOX基因重组腺病毒载体，将其命名为pAd-SurP-WWOX。5、Survivin启动子调控WffOX基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化将人胚胎肾293细胞以40% 60%的细胞密度接种至T_25培养瓶中，待细胞 生长至30 % 50 %融合时弃去培养液，用Lipofectamine 2000试剂将重组腺病毒载体 pAd-SurP-WWOX转染293细胞，通过显微镜观察细胞病理改变，待出现明显细胞病变效应时 离心收集细胞，用PBS重悬，反复冻融3次使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上 清液，即得Survivin启动子调控WffOX基因重组腺病毒Ad-SurP-WffOX原液；将病毒原液再 感染293细胞以扩增病毒，最后将含病毒的上清液采用氯化铯梯度离心纯化。二、靶向性WffOX基因重组腺病毒的抗肿瘤作用检测1、体外抗肿瘤作用(1)细胞凋亡率检测分别将人肝癌!fepG2细胞和美洲绿猴肾C0S-7细胞接种于培养瓶内，培养24小 时后，将重组腺病毒Ad-SurP-WffOX按感染复数(MOI)为100感染细胞，同时设置相应对照组(用PBS替代重组腺病毒Ad-SurP-WffOX)，感染3天后，收集细胞，用PBS洗涤后，调整 细胞浓度为IX IO5个/ml，加入浓度为250 μ g/ml的异硫氰酸荧光素标记的磷脂结合蛋白 V (Annexin V) 5 μ 1和浓度为250 μ g/ml的碘化丙啶(PI) 5 μ 1，冰浴避光孵育10分钟，用 PBS洗涤细胞，再用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡情况=Armexin V和PI均低染 的细胞为正常活细胞；ArmexinV高染而PI低染的细胞为凋亡细胞，Armexin V和PI均高染 的细胞为坏死细胞。结果见图3，感染重组腺病毒Ad-SurP-WffOX或PBS的肿瘤细胞H印G2的凋亡率分 别为46. 8%和5. 2%，而感染重组腺病毒Ad-SurP-WffOX或PBS的正常组织细胞C0S-7的凋 亡率分别为4. 3%和3. 9%，表明本发明的重组腺病毒Ad-SurP-WffOX能够有效并且特异地 诱导肿瘤细胞的凋亡。(2)细胞克隆形成率检测分别将人肝癌H印G2细胞和美洲绿猴肾C0S-7细胞各200个接种于6孔板，培养 24小时后，将重组腺病毒Ad-SurP-WffOX按MOI为100感染细胞，同时设置相应对照组(用 PBS替代重组腺病毒Ad-SurP-ffffOX)，感染2周至细胞集落形成后，行吉姆萨染色，镜下计数 大于50个细胞的集落，按下述公式计算细胞克隆形成率细胞克隆形成率=克隆数/接种 细胞数X100%。结果见图4，感染重组腺病毒Ad-SurP-WffOX或PBS的肿瘤细胞H印G2的克隆形成 率分别为13 %和87 %，而感染重组腺病毒Ad-SurP-WffOX或PBS的正常组织细胞C0S-7的 克隆形成率分别为82%和89%，表明本发明的重组腺病毒Ad-SurP-WffOX能够有效并且特 异地抑制肿瘤细胞的克隆。2、体内抗肿瘤作用将IX IO5个H印G2细胞接种于裸鼠皮下建立荷瘤裸鼠，将荷瘤裸鼠随机 分为两组对照组和实验组，对照组尾静脉注射PBS，实验组尾静脉注射重组腺病毒 Ad-SurP-ffffOX，观察60天内两组小鼠的生存率和肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。结果两组小鼠肿瘤生长曲线见图5，第30天时，对照组小鼠肿瘤体积达到 5500mm3，而实验组小鼠肿瘤生长缓慢，肿瘤体积仅为1800mm3 ；两组小鼠平均生存率见图6， 对照组小鼠于30天内全部死亡，而实验组小鼠60天的生存率为60% ；表明本发明的重组 腺病毒Ad-SurP-ffffOX能够有效抑制肿瘤细胞的生长，同时能够延长荷瘤裸鼠的平均生存 期并提高平均生存率。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。序列表<110>中国人民解放军第三军医大学<120>靶向性WffOX基因重组腺病毒及其制备方法和应用<160>6<210>1<211>32
<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 Fl<400>1gcctcgagct ggccatagaa ccagagaagt ga32<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物 Rl<400>2gcccatggcc acctctgcca acgggtcccg eg32<210>3<211>980<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>3ctggccatag aaccagagaa gtgagtggat gtgatgccca gctccagaag tgactccaga 60acaccctgtt ccaaagcaga ggacacactg attttttttt taataggctg caggacttac 120tgttggtggg acgccctgct ttgcgaaggg aaaggaggag tttgccctga gcacaggccc 180ccaccctcca ctgggctttc cccagctccc ttgtcttctt atcacggtag tggcccagtc 240cctggcccct gactccagaa ggtggccctc ctggaaaccc aggtcgtgca gtcaacgatg 300tactcgccgg gacagcgatg tctgctgcac tccatccctc ccctgttcat ttgtccttca 360tgcccgtctg gagtagatgc tttttgcaga ggtggcaccc tgtaaagctc tcctgtctga 420cttttttttt ttttttagac tgagttttgc tcttgttgcc taggctggag tgcaatggca 480caatctcagc tcactgcacc ctctgcctcc cgggttcaag cgattctcct gcctcagcct 540cccgagtagt tgggattaca ggcatgcacc accacgccca gctaattttt gtatttttag 600tagagacaag gtttcaccgt gatggccagg ctggtcttga actccaggac tcaagtgatg 660ctcctgccta ggcctctcaa agtgttggga ttacaggcgt gagccactgc acccggcctg 720cacgcgttct ttgaaagcag tcgagggggc gctaggtgtg ggcagggacg agctggcgcg 780gcgtcgctgg gtgcaccgcg accacgggca gagccacgcg gcgggaggac tacaactccc 840ggcacacccc gcgccgcccc gcctctactc ccagaaggcc gcggggggtg gaccgcctaa 900gagggcgtgc gctcccgaca tgccccgcgg cgcgccatta accgccagat ttgaatcgcg 960ggacccgttg gcagaggtgg980<210>4<211>25<212>DNA
〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物 F2<400>4gggaagcttt tggagcggga gtgag 25<210>5<211>28<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物 R2<400>5atgggatccc agcagttgtt gaagtaca28<210>6〈211>1245<212>DNA〈213〉智人(Homo sapiens)<400>6atggcagcgc tgcgctacgc ggggctggac gacacggaca gtgaggacga gctgcctccg 60ggctgggagg agagaaccac caaggacggc tgggtttact acgccaatca caccgaggag 120aagactcagt gggaacatcc aaaaactgga aaaagaaaac gagtggcagg agatttgcca 180tacggatggg aacaagaaac tgatgagaac ggacaagtgt tttttgttga ccatataaat 240aaaagaacca cctacttgga cccaagactg gcgtttactg tggatgataa tccgaccaag 300ccaaccaccc ggcaaagata cgacggcagc accactgcca tggaaattct ccagggccgg 360gatttcactg gcaaagtggt tgtggtcact ggagctaatt caggaatagg gttcgaaacc 420gccaagtctt ttgccctcca tggtgcacat gtgatcttgg cctgcaggaa catggcaagg 480gcgagtgaag cagtgtcacg cattttagaa gaatggcata aagccaaggt agaagcaatg 540accctggacc tcgctctgct ccgtagcgtg cagcattttg ctgaagcatt caaggccaag 600aatgtgcctc ttcatgtgct tgtgtgcaac gcagcaactt ttgctctacc ctggagtctc 660accaaagatg gcctggagac cacctttcaa gtgaatcatc tggggcactt ctaccttgtc 720cagctcctcc aggatgtttt gtgccgctca gctcctgccc gtgtcattgt ggtctcctca 780gagtcccatc gatttacaga tattaacgac tccttgggaa aactggactt cagtcgcctc 840tctccaacaa aaaacgacta ttgggcgatg ctggcttata acaggtccaa gctctgcaac 900atcctcttct ccaacgagct gcaccgtcgc ctctccccac gcggggtcac gtcgaacgca 960gtgcatcctg gaaatatgat gtactccaac attcatcgca gctggtgggt gtacacactg 1020ctgtttacct tggcgaggcc tttcaccaag tccatgcaac agggagctgc caccaccgtg 1080tactgtgctg ctgtcccaga actggagggt ctgggaggga tgtacttcaa caactgctgc 1140cgctgcatgc cctcaccaga agctcagagc gaagagacgg cccggaccct gtgggcgctc 1200agcgagaggc tgatccaaga acggcttggc agccagtccg gctaa124权利要求
靶向性WWOX基因重组腺病毒，其特征在于所述重组腺病毒含有一个WWOX基因表达盒，所述WWOX基因表达盒包含Survivin启动子、WWOX基因和终止子，所述WWOX基因的表达由Survivin启动子调控。
2.根据权利要求1所述靶向性WWOX基因重组腺病毒，其特征在于所述重组腺病毒是 将WffOX基因表达盒插入复制缺陷5型腺病毒基因组中而得到。
3.权利要求1所述靶向性WWOX基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤a、Survivin启动子的克隆根据Survivin基因启动子片段的核苷酸序列设计并合成 弓丨物，以人喉癌H印-2细胞基因组DNA为模板，PCR扩增两端分别带有Xho I酶切位点和Nco I酶切位点的Survivin启动子片段，克隆入pGEM_T载体，得重组载体pGEM_T/SurP ；b、WW0X基因的克隆根据WffOX基因的核苷酸序列设计并合成引物，将人胚胎肾293细 胞总RNA逆转录为总cDNA，再以总cDNA为模板，PCR扩增两端分别带有Hind III酶切位点 和BamH I酶切位点的WffOX基因，克隆入pMD18_T载体，得重组载体pMD18-T/WW0X ；再自重 组载体PMD18-T/WW0X中用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切出WffOX基因，与同样 经Hind III和BamH I双酶切的真核表达载体pcDNA3. 1 (+)在T4 DNA连接酶的作用下连 接，得重组载体pcDNA3. I-WffOX ；c、Survivin启动子调控WffOX基因重组腺病毒穿梭载体的构建自重组载体 pGEM-T/SurP中用Xho I和Nco I双酶切出Survivin启动子片段，与同样经Xho I和 Nco I双酶切的重组载体pcDNA3. I-WffOX在T4 DNA连接酶的作用下连接，得重组载体 pcDNA3. I-SurP-WffOX ；再自重组载体 pcDNA3. 1-SurP-ffffOX 中用 Xho I 和 BamH I 双酶切出 SurP-WffOX片段，与同样经Xho I和BamH I双酶切的腺病毒穿梭载体pShuttle在T4 DNA 连接酶的作用下连接，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-SurP-WWOX ；d、Survivin启动子调控WffOX基因重组腺病毒载体的构建将重组腺病毒穿梭载体 pShuttIe-SurP-WffOX用Pme I酶切线性化后，与腺病毒骨架载体pAdEasy-Ι共转染大肠杆 菌BJ5183感受态细胞进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体pAd-SurP-Apoptin ；e、Survivin启动子调控WffOX基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化用脂质体法将重 组腺病毒载体pAd-SurP-Apoptin转染人胚胎肾293细胞，待细胞出现明显病变时，离心收 集细胞，反复冻融使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，即得重组腺病毒 Ad-SurP-Apoptin原液；将病毒原液再感染293细胞以扩增病毒，所得含病毒的上清液采用 氯化铯梯度离心纯化。
4.根据权利要求3所述靶向性WffOX基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于步骤a 中所述引物序列为上游引物5，-gcctcgagctggccatagaaccagagaagtga-3，；下游引物5，-gcccatggccacctctgccaacgggtcccgcg-3，。
5.根据权利要求4所述靶向性WffOX基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于步骤a 中所述PCR循环条件参数为94°C预变性3分钟，然后94°C变性1分钟、58°C退火1分钟， 72°C延伸1. 5分钟，共30个循环，最后72°C延伸7分钟。
6.根据权利要求5所述靶向性WffOX基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于步骤b 中所述引物序列为上游弓I物5，-gggaagcttttggagcgggagtgag-3‘； 下游弓I物5，-atgggatcccagcagttgttgaagtaca-3，。
7.根据权利要求6所述靶向性WffOX基因重组腺病毒的制备方法，其特征在于步骤 b中所述PCR循环条件参数为94°C预变性3分钟，然后94°C变性30秒、65°C退火1分钟， 72°C延伸1分钟，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。
8.权利要求1所述靶向性WWOX基因重组腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种靶向性WWOX基因重组腺病毒及其制备方法和应用，该重组腺病毒含有一个WWOX基因表达盒，所述WWOX基因表达盒包含Survivin启动子、WWOX基因和终止子，所述WWOX基因的表达由Survivin启动子调控；本发明的重组腺病毒能够有效并且特异地诱导肿瘤细胞的凋亡并抑制肿瘤细胞的克隆，能够有效抑制肿瘤细胞的生长，同时能够延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率；该重组腺病毒还具有转染效率高，稳定性好，肿瘤治疗谱广，制备方法简单等优点，可用于制备抗肿瘤药物，在肿瘤基因治疗领域有着良好的开发应用前景。
文档编号C12N15/85GK101805724SQ20091025089
公开日2010年8月18日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者吴玉章, 杨曌 申请人:中国人民解放军第三军医大学