专利名称：一种靶向粘附壳聚糖材料及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤治疗的核酸药物，具体地说是应用一种具有靶向粘附性的天然多
糖材料制备成纳米载体，能有效保护和靶向性运输核酸药物进入细胞，并实现释放。
背景技术：
基因治疗在替代功能障碍基因和肿瘤治疗方面具有良好的应用前景。基因治疗有 3个基本要素目的基因、表达载体和递送载体。以RNA[dsRNA或小RNA(siRNA、 microRNA 或shRNA)]为目的基因介导的RNA干扰(RNAinterference)是特异性结合与其序列互补的 信使RNA(mRNA)，经核酸酶降解mRNA而阻断其编码蛋白质的表达，实现基因沉默，因而在癌 症和流感、肝炎等病毒感染疾病治疗领域有重要的科学意义和应用价值。但裸的小RNA血 液稳定性差、难以进入细胞且可引起非特异性免疫剌激，而限制了其临床应用。同样，以质 粒DNA为表达载体包装siRNA形成的shRNA能否安全有效地运载基因到指定地点决定了基 因治疗在临床上应用的成败。 为解决DNA或RNA的递送这一瓶颈问题，近年来人们开展了基因递送方法和递送 载体的研究。其中基因枪法、电穿孔法、声穿孔法、激光照射法、磁转换法等物理和机械运输 方法存在组织穿透力差、毒性及侵蚀性、潜在副作用、效率低等缺陷。而腺病毒、腺相关病 毒、反转录病毒、慢病毒等病毒载体又有免疫原性强、基因装载量小、制备工艺复杂、价格昂 贵、纯化及质量监控困难、潜在的毒性和致癌性、靶向特异性差、储藏不稳定等弊病。普遍使 用的非病毒载体中的阳离子脂质体经静脉注射进入体内后，首先与血清蛋白结合，易被单 核巨噬细胞作为异物吞噬，很难进入靶细胞，其本身也具有一定毒性，制备产率低。其它非 病毒载体如聚乙烯亚胺、聚赖氨酸等也存在着稳定性差和毒性等不足。通过对比发现，胶
原、壳聚糖等天然材料是优良的基因载体，但转染效率较低的缺点阻碍了其进一步在基因 治疗中的应用。 壳聚糖作为天然多糖中唯一的碱性多糖，除具有生物相容性好、可生物降解，无毒 等特点之外，比胶原还有着潜在的物理化学修饰性，可以通过增加靶向修饰而提高基因的 转染效率。然而通常氨基较羟基的反应活性更高，常被利用作为接枝反应位点，以牺牲壳聚 糖分子链上的部分氨基为代价就是牺牲了壳聚糖独有的生物活性，也影响了它作为载体的
基因容量。 因此，本发明应用一种新型羟基选择性修饰的靶向粘附壳聚糖改性材料作为基因 载体，赋予了壳聚糖载体新的耙向粘附功能，克服同类耙向材料利用EDC、 NHS接枝在氨基， 占用基因容量、影响接枝效率的不足(粘附肽同时具有氨基和羧基，也容易自我连接，增大 空间位阻)；也克服了同类靶向材料作为载体的毒性问题[Nucleic Acids Research, 2004， 32(19) ， e149]。并且通过接枝亲水性肽，增强了壳聚糖在近中性环境下的溶解性。
发明内容
本发明目的在于提供一种新型羟基选择性修饰的靶向粘附壳聚糖材料的应用，本发明把一种易于制备、稳定、生物相容性好、有生物活性、安全(无毒、可降解)、可溶解的靶 向粘附壳聚糖材料，应用作为DNA、 RNA等核酸药物的纳米载体，以增强对其保护作用和靶 向粘附肿瘤细胞的运输，使其更好地实现基因治疗功能。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为； —种靶向粘附壳聚糖材料的应用，首先经光化学激活的基团选择性接枝细胞粘附 性肽得到的改性壳聚糖材料，再与带负电荷的DNA(20bp-10kb)和RNA[dsRNA(500-700bp)、 小RNA (siRNA、 microRNA或shRNA)]等核酸药物通过自组装的方法制备成粒径在 100-500nm、表面荷正电10_30mV的纳米颗粒，转染细胞并实现释放，达到疾病治疗效果。
所述细胞粘附肽为含有细胞粘附因子RGD (Arg-Gly-Asp)序列的多肽GRGDY， RGD 作为整合素的受体，其选择性部分依赖于RGD的构象以及RGD周围的氨基酸残基；其序列 为RGD四肽、五肽、六肽、RGD环肽、双线肽或RGD模拟肽，肽链长度范围在3-12个氨基酸残 基，它们均可以采用所述方法接枝到壳聚糖上，都是采用光敏性交联剂的-NHS酯键断裂与 肽链的_NH2发生反应重新生成酰胺键，可制备出安全、无毒、可降解、生物相容性好、有生物 学功能、在弱酸性条件下溶解的靶向粘附壳聚糖材料；其结构单元为 其中R为去掉Ce-OH的CTS分子。 所述靶向粘附壳聚糖材料与DNA或小RNA通过自组装方式形成稳定、粒径 100-500nm、表面荷正电10_30mV的纳米颗粒，能够保护DNA或RNA等免受相应酶降解，且利 于转染细胞并在胞内释放。 所述自组装方式的操作条件为，靶向粘附壳聚糖质量浓度0.01mg/ml-lg/ml， DNA或RNA摩尔浓度都是lnM-lM，在pH5. 0-6. 0的NaAc-HAc条件下，通过磁力搅拌，在 10min-24h自组装成纳米颗粒。所述核酸药物为20bp-10kb的DNA ;所述RNA为500-700bp的dsRNA或小RNA，包 括19bp-25bp的siRNA、20-24bp的microRNA、或19bp-29bp的shRNA。
所述核酸药物为用于治疗肿瘤的药物。 所述壳聚糖上光化学交联细胞粘附性肽的过程为，在双功能光敏性交联剂的作用 下，通过紫外光化学激活的基团选择性接枝反应，将细胞粘附性肽接枝到壳聚糖的羟基上， 在无需氨基保护和脱保护的繁琐反应条件下可保留氨基活性，通过透析方法分离未反应物 质，冷冻干燥或真空干燥得生物相容性好、可降解、可溶解的靶向粘附壳聚糖材料；
具体步骤如下 1)按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的物质量之比为l : 1-1 : 50计量， 称取光敏交联剂，加入到水、水_乙醇或pH7. 0-9. 0缓冲液中，得光敏交联剂溶液；
随后向光敏交联剂溶液中加入细胞粘附性肽的水溶液或缓冲液，光敏交联剂与细 胞粘附性肽的物质量之比为1 : 1-1 : 50，光敏交联剂终浓度liim-10M，室温下避光反应60-120min，形成细胞粘附性肽_光敏交联剂及未反应的原料的混合液； 所述光敏交联剂为两端分别具有特征基团-NHS与_N3的sulfo-SANPAH、 SANPAH、
ANB-NOS或sulfo-SAND ; 2)按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的物质量之比为l : 1-1 : 50计量， 向上述混合液加入壳聚糖溶液，充分混匀后，光照4min-120min ; 所述壳聚糖溶液为0. 1-4 % w/v壳聚糖溶液，Mw = 10kDa-1500kDa， DD = 40% -98% ; 3)将上述反应后的混合溶液加入到透析袋中，壳聚糖分子量>透析袋的截留分子
量丽CO >肽链和交联剂的分子量，透析至透析出的水溶液在254nm与220nm检测不到紫外
吸收变化时，再将透析袋内得到的溶液冷冻干燥或真空干燥，得到产物。所述缓冲液为pH7. 0-9. 0，无氨基缓冲液20mM磷酸钠缓冲液，0. 15M NaCl ;20mM
HEPES ;100mM碳酸盐/重碳酸盐缓冲液；或者50mM硼酸盐缓冲液； 所述光敏交联剂与细胞粘附性肽的物质量之比l : 1-1 : IO;光敏交联剂终浓度 100 ii m-2M ;400W > UV > 6W， 290_460nm。 本发明应用靶向粘附壳聚糖新材料作为核酸药物载体具有如下优点 1.采用小分子交联剂和细胞粘附肽，便于与反应的中间产物以及未交联的化学交
联剂、肽分离，使产品纯化的同时，降低化学毒性。 2.采用小分子交联剂和粘附肽，减小空间位阻，通过自组装制备出的纳米颗粒粒 径100nm-500nm之间。并且表面带荷正电10_30mV，易于穿透带负电的细胞膜，进行细胞转 染。 3.接枝位置在壳聚糖的羟基，不占用氨基。使更多的氨基因质子化作用带正电荷， 从而复合更多带负电荷的核酸药物。 4.连接的粘附肽呈亲水性，因此改性材料在弱酸性条件下溶解性更好，便于纳米 载体在生理环境下的应用。 5.用于核酸药物载体的材料，其改性的反应条件温和，快速，其制备纳米载体工艺 简便易行。 6.以壳聚糖为基础材料，靶向修饰后作为基因载体，承袭了壳聚糖载体的优点，功 能却进一步增强。细胞转染结果显示新材料无细胞毒性，便于降解释放，转染效率和保护效 率达到商品化脂质体的水平。
图1为根据实施例1得到GRGD-SANPAH-CTS/miRNA纳米颗粒透射电镜图。证明形 成了粒径在200-300nm的、适合细胞转染的稳定纳米颗粒。 图2为根据实施例2得到的RGD环肽-SANPAH_CTS/siRNA的粒径分布。证明形成 了粒径在100nm-500nm的、适合细胞转染的稳定纳米颗粒。纳米颗粒得粒径分散度好。
图3为根据实施例3得到的GRGDY-SAND-CTS/DNA的聚丙烯凝胶电泳图谱。证明 所载DNA被保护，防止酶的降解(3泳道为DNA对照)。 图4为根据实施例4得到的GRGDY-SANPAH-CTS/siRNA转染效果的激光共聚焦照 片。表明新材料作为基因载体，可保护裸基因并转染细胞，而裸siRNA在进入细胞后会被核
6酸酶降解(3h以上被完全降解)。其效果可达到商品化脂质体的水平。(粒径< 2 i！ m即可 进细胞，< 500nm基因载体效果更好)。另外，细胞状态良好，说明修饰材料透析过程已除去 化学试剂，对细胞安全无毒性。
具体实施例方式
在壳聚糖分子上基团选择性地接枝含细胞粘附因子RGD的多肽GRGDY，具体地说 是利用双功能(N-羟基琥珀酰亚胺/叠氮化物)光敏性交联剂sulfo-SANPAH，在壳聚糖 C6-0H修饰亲水性GRGDY来增加材料的靶向粘附性和水溶性；同时被保留的C厂叫，在弱酸 环境中进行氨基质子化带正电荷，进一步利用静电交联原理复合更多带负电的核酸药物， 形成稳定的纳米颗粒。由于含细胞粘附因子RGD的多肽有靶向肿瘤表面过表达的整合素受 体的特性，因此可以实现对肿瘤细胞的靶向运输。
具体步骤为 1.细胞粘附肽与光敏交联剂在全水体系或水与乙醇或乙醇的体系中，两者连接后 再加入CTS溶液，通过UV光化学激活4-120min，制备得到新材料细胞粘附肽_光敏交联 剂-壳聚糖。 2.将上述反应后的混合溶液加入到透析袋中，壳聚糖分子量>透析袋的截留分子 量丽CO >肽链和交联剂的分子量，透析至透析出的水液体在254nm与220nm检测不到紫外 吸收变化时，再将透析袋内得到的溶液冷冻干燥，得到产物。 3.将产物与小RNA(siRNA、 miRNA)或DNA利用静电作用原理在弱酸性(pH5. O-pH 6. 0)条件下，通过磁力搅拌，自组装成纳米颗粒。 4.将纳米粒进行粒径、电位检测，所得纳米颗粒适合转染；经聚丙烯凝胶电泳检
测其稳定性良好。 5.能有效转染细胞。 6.动物实验取得明显治疗效果。 靶向粘附壳聚糖材料的制备例1 1.室温下，将0. lg壳聚糖(Mw = 1500kDa， DD = 40% )溶解于100mL摩尔浓度 0. 05M的醋酸水溶液中，将溶液pH调整到pH5. 0，形成透明的0. 1 % (w/v)壳聚糖溶液；
2.称取光敏交联剂SANPAH(按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的物质量 之比为l : 1计量)，加入到乙醇中，随后向光敏交联剂溶液中加入SANPAH与RGD环肽物质 量之比为1 : 2的RGD环肽水溶液，光敏交联剂终浓度10 ii M。室温下避光反应90min，形 成RGD环肽-SANPAH及未反应的原料的混合液； 3.按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的物质量之比为1 : 1的量，在RGD
环肽-SANPAH及其原料混合物中加入壳聚糖溶液，充分混匀后，UV光照4min。 4.将上述反应混合溶液加入到截留分子量=14kDa的透析袋中，透析至透析出的
水溶液在254nm与220nm检测不到紫外吸收变化。 5.将透析袋内得到溶液冷冻干燥，得到产物。 靶向粘附壳聚糖材料的制备例2 1.室温下，将4g壳聚糖(Mw = 10kDa， DD = 60% )溶解于100mL摩尔浓度0. 1M 的醋酸水溶液中，将溶液pH调整到pH5. 5，形成透明的4% (w/v)壳聚糖溶液；敏交联剂SANPAH(按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的物质量 之比为l : 6计量)，加入到乙醇中，随后向光敏交联剂溶液中加入SANPAH与GRGD物质量 之比为1 : 20的GRGD水溶液，光敏交联剂终浓度0. lmM。室温下避光反应120min，形成 GRGD-SANPAH及未反应的原料的混合液； 3.按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的物质量之比为1 : 6的量，在 GRGD-SANPAH及其原料混合物中加入壳聚糖溶液，充分混匀后，UV光照30min。
4.将上述反应混合溶液加入到截留分子量=14kDa的透析袋中，透析至透析出的 水溶液在254nm与220nm检测不到紫外吸收变化。 5.将透析袋内得到溶液冷冻干燥，得到产物。证实此方法适用于同类含RGD的肽
和同类光敏性交联剂。 靶向粘附壳聚糖材料的制备例3 1.室温下，将lg壳聚糖(Mw = 148kDa，DD = 80% )溶解于lOOmL摩尔浓度O. 05M 的醋酸水溶液中，将溶液pH调整到pH4. 5，形成透明的1 % (w/v)壳聚糖溶液；
2. sulfo-SANPAH与GRGDY按物质量之比为1 : 1，分别加入到水中，光敏交联剂终 浓度2M， GRGDY与sulfo-SANPAH在室温下避光反应120min，形成GRGDY-SANPAH及其未反 应的原料的混合液； 3.按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的物质量之比为1 : 2的量，在 GRGDY-SANPAH及其原料混合物中加入壳聚糖溶液，充分混匀后，UV光照15min。
4.将上述反应混合溶液加入到截留分子量=14kDa的透析袋中，透析至透析出的 水溶液在254nm与220nm检测不到紫外吸收变化。 5.将透析袋内得到红色溶液-5(TC冷冻干燥，得到红色絮状产物。
实施例1 1. GRGDY与sulfo-SANPAH在缓冲液体系中，两者连接后再加入CTS溶液，通过UV 光化学激活，制备得到新材料GRGDY-SANPAH-CTS (mCTS)。
具体为 1)室温下，将lg壳聚糖(Mw = 230kDa，DD = 95% )溶解于100mL摩尔浓度0. 1M 的醋酸水溶液中，将溶液pH调整到pH4. 0，形成透明的1 % (w/v)壳聚糖溶液；
2)称取光敏交联剂sulfo-SANPAH(按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的 物质量之比为l : IO计量)，加入缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，0. 15M NaCl)中，随后向光敏 交联剂溶液中加入sulfo-SANPAH与GRGDY物质量之比为1 : 10的GRGDY缓冲液(20mM磷酸 钠缓冲液，O. 15M NaCl)，光敏交联剂终浓度5M。室温下避光反应90min，形成GRGDY-SANPAH 及未反应的原料的混合液； 3)按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的物质量之比为1 : IO的量，在
GRGDY-SANPAH及其原料混合物中加入壳聚糖溶液，充分混匀后，UV光照60min。 4)将上述反应混合溶液加入到截留分子量=14kDa的透析袋中，透析至透析出的
水溶液在254nm与220nm检测不到紫外吸收变化。5)将透析袋内得到红色溶液-501:冷冻干燥，得到红色絮状产物。 2.耙向粘附壳聚糖质量浓度O. 01mg/ml，siRNA摩尔浓度lnM在pH5. 5的NaAc-HAc
条件下，通过磁力搅拌，在5h自组装成200-300nm左右的纳米颗粒。(siRNA序列见
8Biomaterials， 2008， 29， 506-512)。 将纳米粒进行透射电镜观察。证明形成了粒径在100nm-500nm的、适合细胞转染
的稳定纳米颗粒。 3. mCTS/siRNA细胞培养和转染，体外在无血清培养液中进行转染。 1)mCTS/siRNA， siRNA序列见[Biomaterials， 2008， 29， 506-512]，转染步骤见。 2)脂质体TKO转染(其步骤依照Mirus TransIT-TKO transfection ReagentProtocol、Biomaterials， 2008， 29， 506-512进行)作为阳性对照。
3)裸siRNA转染(上海吉玛制药，B01001、B02001产品)为阴性对照。
4.动物试验，将纳米粒溶液进行小鼠尾静脉注射，在过表达整合素受体的肿瘤 细胞表面，利用RGD序列靶向识别，进行受体介导的细胞内吞作用，释放到细胞质中发挥 作用。(参照脂质体动物试验和CTS载体动物试验，[MOLECULAR THERAPY，2006,14(4)， 476-484] ;Genetic Vaccines andTher即y， 2008， 6 :7)，证实肿瘤明显縮小，治疗效果良好。
实施例2 1. GRGDY与sulfo-SANPAH在缓冲液体系中，两者连接后再加入CTS溶液，通过UV 光化学激活，制备得到新材料GRGDY-SANPAH-CTS (mCTS)。
具体为 1)室温下，将3g壳聚糖(Mw = 90kDa，DD = 90% )溶解于100mL摩尔浓度0. 05M 的醋酸水溶液中，将溶液pH调整到pH4. 5，形成透明的3% (w/v)壳聚糖溶液；
2) sulfo-SANPAH与GRGDY按物质量之比为1 : 2，分别加入到相同体积的乙醇和 水中，然后混合，光敏交联剂终浓度lmM，GRGDY与sulfo-SANPAH在室温下避光反应60min， 形成GRGDY-SANPAH及其未反应的原料的混合液； 3)按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的物质量之比为1 : 5计量，向上述 反应混合液加入壳聚糖溶液，充分混匀后，UV光照45min。 4)将上述反应混合溶液加入到截留分子量(丽C0) 14kDa透析袋中，透析至透析出 的水溶液在254nm与220nm检测不到紫外吸收变化，再将透析袋内得到的溶液真空干燥，得 到产物。 2.靶向粘附壳聚糖质量浓度0. lg/ml， miRNA(上海吉玛制药，M05产品)摩尔浓 度O. 1M，在pH5.0的NaAc-HAc条件下，通过磁力搅拌，在24h自组装成400nm左右的纳米颗 粒。 将纳米粒进行纳米粒度仪检测。证明形成了粒径在100nm-500nm的、适合细胞转 染的稳定纳米颗粒。粒径分散性良好。
3.mCTS/miRNA细胞培养和转染。 4.动物试验，将纳米粒溶液进行小鼠尾静脉注射，在过表达整合素受体的肿瘤 细胞表面，利用RGD序列靶向识别，进行受体介导的细胞内吞作用，释放到细胞质中发挥 作用。(参照脂质体动物试验和CTS载体动物试验，[MOLECULAR THERAPY，2006,14(4)， 476-484] ;Genetic Vaccines andTher即y， 2008， 6 :7)，证实肿瘤明显縮小，治疗效果良好。
实施例3 1. GRGDY与sulfo-SANPAH在缓冲液体系中，两者连接后再加入CTS溶液，通过UV光化学激活，制备得到新材料GRGDY-SANPAH-CTS (mCTS)。
具体为 1)室温下，将lg壳聚糖(Mw = 50kDa， DD = 80% )溶解于lOOmL摩尔浓度0. 1M 的醋酸水溶液中，将溶液pH调整到pH6. 0，形成透明的1 % (w/v)壳聚糖溶液；
2)称取光敏交联剂sulfo-SANPAH(按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的 物质量之比为1 : 50计量)，加入到乙醇中，随后向光敏交联剂溶液中加入sulfo-SANPAH 与GRGDY物质量之比为1 : 50的GRGDY水溶液，光敏交联剂终浓度1 P M。室温下避光反应 90min，形成GRGDY-SANPAH及未反应的原料的混合液； 3)按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的物质量之比为1 : 50计量，向上述 反应混合液加入壳聚糖溶液，充分混匀后，UV光照120min。 4)将上述反应混合溶液加入到截留分子量(丽CO) 14kDa透析袋中，透析至透析出 的水溶液在254nm与220nm检测不到紫外吸收变化，再将透析袋内得到的溶液冷冻干燥，得 到产物。 2.耙向粘附壳聚糖质量浓度lg/ml， DNA摩尔浓度1M，在p朋.0的NaAc-HAc条件 下，通过磁力搅拌，在lh自组装成500nm左右的纳米颗粒。质粒DNA为pGFP、 pCX-EGFP、 pSUPER RNAi system (pSuperior. puro、pSUPER皿neo、 pSUPERIOR、 pSUPER皿neo+gfp)。 过程参考南方医科大学学报，2007， 27 (5) ， 595-598。 进行聚丙烯凝胶电泳检测，凝胶成像系统成像。证明所载DNA被保护，防止酶的降 解(3泳道为DNA对照)。 3.mCTS/DNA细胞培养和转染，(过程参考壳聚糖载基因纳米粒子的研究，2005， 22(6) :1171-117)。 4.动物试验，将纳米粒溶液进行小鼠尾静脉注射，在过表达整合素受体的肿瘤 细胞表面，利用RGD序列靶向识别，进行受体介导的细胞内吞作用，释放到细胞质中发挥 作用。(参照脂质体动物试验和CTS载体动物试验，[MOLECULAR THERAPY，2006,14(4)， 476-484] ;Genetic Vaccines andTher即y， 2008， 6 :7)，证实肿瘤明显縮小，治疗效果良好。
实施例4 1. GRGDY与sulfo-SANPAH在缓冲液体系中，两者连接后再加入CTS溶液，通过UV 光化学激活，制备得到新材料GRGDY-SANPAH-CTS (mCTS)。
具体为 1)室温下，将2g壳聚糖(Mw = 230kDa，DD = 95% )溶解于lOOmL摩尔浓度0. 1M 的醋酸水溶液中，将溶液pH调整到pH4. O，形成透明的2% (w/v)壳聚糖溶液；
2)称取光敏交联剂sulfo-SANPAH(按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基 的物质量之比为l : 20计量)，加入缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，0. 15M NaCl)中，随后 向光敏交联剂溶液中加入sulfo-SANPAH与GRGDY物质量之比为1 : 5的GRGDY缓冲液 (20mM磷酸钠缓冲液，0. 15M NaCl)，光敏交联剂终浓度IOM。室温下避光反应90min，形成 GRGDY-SANPAH及未反应的原料的混合液； 3)按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的物质量之比为1 : 20的量，在
GRGDY-SANPAH及其原料混合物中加入壳聚糖溶液，充分混匀后，UV光照90min。 4)将上述反应混合溶液加入到截留分子量=14kDa的透析袋中，透析至透析液在
10254nm与220nm检测不到紫外吸收变化。
5)将透析袋内得到红色溶液-s(rc冷冻干燥，得到红色絮状产物。 2.革E向粘附壳聚糖质量浓度0.01g/ml， siRNA摩尔浓度10iiM，在pH5.5的
NaAc-HAc条件下，通过磁力搅拌，在lOmin自组装成300nm左右的纳米颗粒。 3. mCTS/siRNA细胞培养和转染，体外在无血清培养液中进行转染。 1)mCTS/siRNA， siRNA序列见[Biomaterials， 2008， 29， 506-512]，转染步骤见。 2)脂质体TKO转染(其步骤依照Mirus TransIT-TKO transfection ReagentProtocol、Biomaterials， 2008， 29， 506-512进行)作为阳性对照。
3)裸siRNA转染(上海吉玛制药，B01001、B02001产品)为阴性对照。
用激光共聚焦显微镜观察。结果靶向修饰CTS纳米粒与商品化脂质体阳性对照一 样保护siRNA转染进入细胞，而裸siRNA在进入细胞后会被核酸酶降解(3h以上被完全降 解)。另外，细胞状态良好，说明修饰材料透析过程已除去化学试剂，对细胞安全无毒性。
4.动物试验，将纳米粒溶液进行小鼠尾静脉注射，在过表达整合素受体的肿瘤 细胞表面，利用RGD序列靶向识别，进行受体介导的细胞内吞作用，释放到细胞质中发挥 作用。(参照脂质体动物试验和CTS载体动物试验，[MOLECULAR THERAPY，2006,14(4)， 476-484] ;Genetic Vaccines andTher即y， 2008， 6 :7)，证实肿瘤明显縮小，治疗效果良好。
1权利要求
一种靶向粘附壳聚糖材料，其特征在于所述壳聚糖上光化学交联细胞粘附性肽的过程为，在双功能光敏性交联剂的作用下，通过紫外光化学激活的基团选择性接枝反应，将细胞粘附性肽接枝到壳聚糖的羟基上，在无需氨基保护和脱保护的繁琐反应条件下可保留氨基活性，通过透析方法分离未反应物质，冷冻干燥或真空干燥得生物相容性好、可降解、可溶解的靶向粘附壳聚糖材料。
2. 按照权利要求1所述的壳聚糖材料，其特征在于所述壳聚糖上光化学交联细胞粘 附性肽的具体步骤如下，1) 按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的物质量之比为i : i-i : 50计量，称取光敏交联剂，加入到水、水-乙醇或PH7. 0-9. 0缓冲液中，得光敏交联剂溶液；随后向光敏交联剂溶液中加入细胞粘附性肽的水溶液或缓冲液，光敏交联剂与细胞粘附性肽的物质量之比为l : 1-1 : 50，光敏交联剂终浓度liim-10M，室温下避光反应 60-120min，形成细胞粘附性肽_光敏交联剂及未反应的原料的混合液；所述光敏交联剂为两端分别具有特征基团-NHS与-N3的sulfo-SANPAH、 SANPAH、 ANB-NOS或sulfo-SAND ;2) 按光敏交联剂与壳聚糖中氨基葡萄糖残基的物质量之比为l : 1-1 : 50计量，向上 述混合液加入壳聚糖溶液，充分混匀后，光照4min-120min ;所述壳聚糖溶液为0. 1-4% w/v壳聚糖溶液，Mw = 10kDa-1500kDa， DD = 40% -98% ;3) 将上述反应后的混合溶液加入到透析袋中，壳聚糖分子量>透析袋的截留分子量 丽CO >肽链和交联剂的分子量，透析至透析出的水溶液在254nm与220nm检测不到紫外吸 收变化时，再将透析袋内得到的溶液冷冻干燥或真空干燥，得到产物。
3. 按照权利要求2所述的壳聚糖材料，其特征在于所述缓冲液为pH7. 0-9. O，无氨基 缓冲液20mM磷酸钠缓冲液，O. 15M NaCl ;20mMHEPES ;100mM碳酸盐/重碳酸盐缓冲液；或 者50mM硼酸盐缓冲液；所述光敏交联剂与细胞粘附性肽的物质量之比1 : i-i : io;光敏交联剂终浓度 100 ii m-2M ;400W > UV > 6W， 290-460nm。
4. 一种权利要求1所述靶向粘附壳聚糖材料的应用，其特征在于利用在壳聚糖上光 化学交联细胞粘附性肽的方法得到的靶向粘附壳聚糖材料，可用于制备DNA或RNA等核酸 药物的纳米载体。
5. 按照权利要求4所述的应用，其特征在于所述细胞粘附肽为含有细胞粘附因子RGD 序列的多肽GRGDY， RGD作为整合素的受体，其选择性部分依赖于RGD的构象以及RGD周围 的氨基酸残基；其序列为RGD四肽、五肽、六肽、RGD环肽、双线肽或RGD模拟肽，肽链长度 范围在3-12个氨基酸残基，它们均可以采用权利要求1所述方法接枝到壳聚糖上，都是利 用光敏性交联剂的-NHS酯键断裂与肽链的_NH2发生反应重新生成酰胺键河制备出安全、 无毒、可降解、生物相容性好、有生物学功能、在弱酸性条件下溶解的靶向粘附壳聚糖材料； 其结构单元为<formula>formula see original document page 3</formula>其中R为去掉C6-0H的CTS分子。
6. 按照权利要求4所述的应用，其特征在于所述靶向粘附壳聚糖材料与DNA或RNA通 过自组装方式形成稳定、粒径100-500nm、表面荷正电10_30mV的纳米颗粒，靶向粘附壳聚 糖材料作为纳米载体能够保护DNA或RNA免受相应酶降解，且利于转染细胞并在胞内释放。
7. 按照权利要求6所述的应用，其特征在于所述自组装方式的操作条件为，靶向粘 附壳聚糖质量浓度0. 01mg/ml-lg/ml， DNA或RNA摩尔浓度都是lnM-lM，在pH5. 0-6. 0的 NaAc-HAc条件下，通过磁力搅拌，在10min_24h自组装成纳米颗粒。
8. 按照权利要求4或6所述的应用，其特征在于所述核酸药物为20bp-10kb的DNA ; 所述RNA为500-700bp的dsRNA或小RNA，包括19bp_25bp的siRNA、20-24bp的microRNA、 或19bp-29bp的shRNA。
9. 按照权利要求4所述的应用，其特征在于所述核酸药物为靶向肿瘤细胞表面整合 素受体的核酸药物，其为用于治疗肿瘤的药物。
全文摘要
本发明涉及一种靶向粘附壳聚糖材料的应用。在双功能(N-羟基琥珀酰亚胺/叠氮化物)光敏性交联剂的作用下，通过UV光化学激活的接枝反应，将细胞粘附性肽接枝到壳聚糖上，得到的安全(无毒、可降解)、生物相容性好、有生物学功能、在弱酸性条件下溶解性明显增强的靶向粘附壳聚糖材料，通过自组装方式可形成稳定、粒径100-500nm、表面荷正电10-30mV的纳米颗粒，可作为DNA(20bp-10kb)或RNA[dsRNA(500-700bp)、小RNA(siRNA、microRNA或shRNA)]等核酸药物的载体，在保护所载DNA或RNA免受相应酶降解的同时，可靶向肿瘤细胞表面过表达的整合素受体，利于转染细胞并在胞内释放以治疗肿瘤。
文档编号A61K48/00GK101747451SQ20081022927
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月3日 优先权日2008年12月3日
发明者于炜婷, 刘袖洞, 杨艳, 马小军 申请人:中国科学院大连化学物理研究所