一种多功能靶向异长春花碱脂质体及其制备方法
【专利摘要】一种多功能靶向异长春花碱脂质体，是由异长春花碱、脂材及功能性靶向配体组成的；所述脂质体为双分子层结构，内部为水溶性空腔；所述异长春花碱包封在脂质体水溶性空腔中；所述脂材由卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺组成；所述功能性靶向配体由脂质体表面的修饰物和脂质体双分子层中的靶向材料组成；所述脂质体双分子层中的靶向材料为粉防己碱，粉防已碱包封在脂质体双分子层中；所述脂质体表面的修饰物为伐普肽-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯与胆固醇-聚乙二醇-聚乙烯亚胺。本发明还提供一种多功能靶向异长春花碱脂质体的制备方法，使药物在跨过血脑屏障后靶向到脑胶质瘤部位，增加药物在脑肿瘤部位的分布，提高化疗效果。
【专利说明】-种多功能祀向异长春花碱脂质体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药制剂【技术领域】，尤其涉及一种用于治疗脑胶质瘤的多功能祀向异 长春花碱脂质体及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 脑胶质瘤作为恶性肿瘤之一，已经成为癌症死亡的十大因素之一，严重危及人们 的生命和健康。目前临床上对于脑胶质瘤主要采用手术治疗、放射治疗和化学药物治疗等 方案。脑胶质瘤具有强浸润性的特点，可W快速地浸润和破坏正常脑组织结构，因而，临床 中不可能通过手术切除的方法完全治愈脑胶质瘤。放射治疗由于自身治疗精度的限制也不 能完全清除脑胶质瘤细胞，并且该方法副作用大，对正常细胞的损伤明显。化疗方法失败的 主要原因在于化疗药物很难顺利的跨越血脑屏障，药物通过静脉给药后不能充分的到达脑 实质，据研究大约只有1%的化疗药物能通过血脑屏障到达中枢肿瘤组织。血脑屏障是指脑 毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障，该屏障的生理功能是阻止大 部分的外来物质由血液进入脑组织，从而保持脑组织内环境的基本稳定并更好的保护脑组 织。由此可见，脑胶质瘤的上述特点使得脑肿瘤患者的预后极差，且中位生存期往往少于16 个月。
[0003] 因此，我们需要构建一个多功能祀向载体，该个载体可W携带化疗药物顺利跨越 机体的血脑屏障，然后将药物祀向输送至脑肿瘤组织，该多功能祀向载体的成功构建是脑 胶质瘤综合治疗策略中至关重要的一步。
[0004] 异长春花碱（Vinore化ine，VRB)是从中药长春花中提取并经半合成的一种生物碱 类化合物，能抑制乳腺癌，支气管肺癌，神经母细胞瘤等多种肿瘤细胞增殖，主要通过作用 肿瘤细胞微管蛋白而干扰肿瘤细胞代谢。异长春花碱几乎不溶于水，并且具有明显的毒副 作用，其应用受到极大的限制。脂质体制剂可W明显改善其生物利用度，改变被包封药物的 体内分布，使其具有一定的祀向特性。目前国内已有将长春花属生物碱制成静脉注射用微 乳、长循环脂质体及脂质微球的专利，但未发现有将异长春花碱制备成多功能祀向脂质体 的专利。
[0005] 伐普肤（Vapreotide, VAP)是D-苯丙氨醜-半脫氨醜-酪氨醜-D-色氨醜-赖 氮醜-额氨醜-半脫氨醜-色氨醜胺-环二硫離单醋酸盐，是一种抑制脑垂体分泌生 长激素的神经调节肤，属于生长抑素（SST)的一种。生长抑素受体（SSTR)广泛分布在各种 实体瘤和神经内分泌的肿瘤中。与正常组织相比，肿瘤组织部位的生长抑素受体具有高表 达的特点，生长抑素受体具有与生长抑素的高度亲和的能力，目前生长抑素已经作为肿瘤 治疗的新的祀分子而在研究中被广泛应用。目前国内已有将伐普肤作为祀向配体的专利 (CN101439182A)，但未发现有将伐普肤与聚己二醇1000维生素E玻巧酸醋（TPGSi。。。）通过 醜化反应结合而修饰在脂质体表面的专利。
[0006] 聚己帰亚胺（polyet的Ienimine, PEI)是一种高效的非病毒型递送载体，低分 子量PEI分子表面具有高密度正电荷，可W与肿瘤微血管及肿瘤细胞表面所带的负电荷结 合，从而实现高效、快速的祀向目的。目前，PEI作为非病毒基因载体已经被广泛的研究，但 未发现有将聚己帰亚胺与胆固醇-聚己二醇-NHS (CHOL-阳G-NHS)通过缩合反应结合而修 饰在脂质体表面的专利。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种多功能祀向异长春花碱脂质体及其制备方法，能够使 药物在跨过血脑屏障后祀向到脑胶质瘤部位，从而增加药物在脑肿瘤部位的分布，减小化 疗药物的毒副作用，提高化疗的效果。
[0008] 为实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案。
[0009] 本发明提供一种多功能祀向异长春花碱脂质体，是由异长春花碱、脂材及功能 性祀向配体组成的；所述脂质体为双分子层结构，内部具有水溶性空腔；所述异长春花碱 包封在脂质体水溶性空腔中；所述脂材由卵磯脂（DPPC)、胆固醇（CH0L)、聚己二醇-二 硬脂醜磯脂醜己醇胺（DS阳-PEGw。。）组成；所述功能性祀向配体由脂质体表面的修饰物 和脂质体双分子层中的祀向材料组成；所述脂质体双分子层中的祀向材料为粉防己碱 (tetran化ine, TET)，所述粉防已碱包封在脂质体双分子层中；所述脂质体表面的修饰 物为伐普肤-聚己二醇1000维生素E玻巧酸醋（TPGSww-VAP)与胆固醇-聚己二醇-聚 己帰亚胺（CH0L-PEG-PEI)，所述TPGSww-VAP通过醜化反应修饰在脂质体的表面，所述 CH0L-PEG-PEI通过缩合反应修饰在脂质体的表面。
[0010] 所述 DPPC、CH0L、DS阳-PEG2。。。、TPGSiow-VAP 和 CHOkWG-PEI 的物质的量之比为 (55-65): (18-22): (3-3. 5): (1.3-1. 8): (1.3-1. 8)，所述异长春花碱与脂材的质量比 为1:50-1:70,所述粉防己碱与脂材的质量比为1:10-1:30。
[0011] 所述伐普肤-聚己二醇1000维生素E玻巧酸醋（TPGSww-VAP)是由伐普肤（VAP) 中的氨基与经戊二酸活化的聚己二醇1000维生素E玻巧酸醋的駿基（TPGSiwa-COOH)发 生醜化反应合成的，所述聚己二醇1000维生素E玻巧酸醋（TPGSi。。。）经戊二酸活化；所述 醜化反应的缩合剂为碳二亚胺（邸C)和N-轻基玻巧醜亚胺（N服），所述醜化反应的温度为 20-25°C、时间为20-2化，所述醜化反应在二甲基亚讽（DMSO)溶剂中进行，所述醜化反应中 VAP: TPGSi圆-COOH: EDC:畑S=I: 1:8:8 (摩尔比）。
[0012] 所述胆固醇-聚己二醇-聚己帰亚胺（CH0L-阳G-PEI)是由聚己帰亚胺（PEI)中 的氨基与胆固醇-聚己二醇-N服（OTOkWG-N服）中的N-轻基玻巧醜亚胺（N服）发生缩 合反应合成的；所述缩合反应的温度为20-25C，时间为30-3化，所述缩合反应可W在二甲 基甲醜胺（DMF)溶剂中进行，DMF溶液用N-甲基吗晰调节抑为8. 5-9. 5,所述缩合反应中 阳I: CHOkWG-N服=5:1 (摩尔比）。
[001引所述TPGSiwa-VAP与CH0L-PEG-PEI的合成方法还包括分别将两种化合物的反应液 在去离子水中进行透析(截留值为2000 Da)纯化，然后将透析后的液体冻干得到两种祀向 配体材料。
[0014] 所述TPGSww-VAP与CHOkWG-PEI为两种共辆化合物，均作为主动祀向的祀向配 体，修饰在多功能祀向异长春花碱脂质体的表面，W增加所述脂质体跨越血脑屏障和主动 识别祀向脑胶质瘤细胞的能力。
[0015] 所述粉防己碱修饰在脂质体双分子层中，W克服肿瘤细胞的多药耐药性。
[0016] 所述脂质体经过TPGSww-VAP、CHOL-PEG-PEI和粉防己碱修饰，在顺利跨血脑屏障 后，通过主动识别脑胶质瘤细胞和抑制脑胶质瘤细胞膜上的P-评外排蛋白过度表达而发 挥多重祀向的目的。
[0017] 本发明还提供一种多功能祀向异长春花碱脂质体的制备方法，包括如下步骤。
[0018] 步骤1、粉防己碱、TPGSww-VAP、CHOL-阳G-PEI及脂材溶解于氯仿中，旋转蒸发除 去氯仿，得到脂膜。
[0019] 步骤2、将所述脂膜用硫酸馈溶液水化，水化液超声lOmin，然后使用脂质体挤出 仪分别挤过400nm、200nm和IOOnm孔径的滤膜各3次，制备空白多功能祀向脂质体。
[0020] 步骤3、将所述空白多功能祀向脂质体密封于透析袋(截留值10000-12000 Da)中， 置磯酸盐缓冲液（PBS)中透析3次，每次12h。
[0021] 步骤4、取处方量的异长春花碱，加至透析后的空白多功能祀向脂质体，置4(TC恒 温振荡器中，lOOr/min振摇30min，得到多功能祀向异长春花碱脂质体。
[0022] 所述脂材由卵磯脂（DPPC)、胆固醇（CH0L)、聚己二醇-二硬脂醜磯脂醜己醇胺 (DS阳-PEG2。。。）组成；所述 DPPC、CHOL、DS阳-PEG2〇w、TPGSiwa-VAP 及 CHOkWG-PEI 的物质的 量之比为（55-65): (18-22): (3-3. 5): (1.3-1. 8): (1.3-1. 8);所述异长春花碱与脂材 的质量比为1:50-1:70,所述粉防己碱与脂材的质量比为1:10-1:30。
[0023] 所述多功能祀向异长春花碱脂质体用于制备脑肿瘤细胞抑制剂。
[0024] 所述脑肿瘤可为脑胶质瘤，具体可为C6胶质瘤。
[00巧]所述多功能祀向异长春花碱脂质体粒径约为lOOnm，Zeta电位接近30mv。
[0026] 与现有技术相比本发明的有益效果。
[0027] 本发明提供的多功能祀向异长春花碱脂质体及其制备方法，通过将抗肿瘤药异长 春花碱包封于脂质体水溶性空腔中，脂质体经过TPGSww-VAP、CHOL-PEG-PEI和粉防己碱修 饰，得到了一种全新的多功能祀向脂质体，该多功能祀向脂质体能够使药物在跨过血脑屏 障后祀向到脑胶质瘤部位，避免了多药耐药现象的产生，从而增加了药物在脑肿瘤部位的 分布，减小了化疗药物的毒副作用，提高了化疗的效果。本发明为脑胶质瘤化疗提供了一个 新的对策，有助于对脑胶质瘤的非侵入性治疗的研究，具有重要的理论意义与临床意义。
【专利附图】
【附图说明】
[002引图1为本发明多功能碑!向异长春花碱脂质体示意图。
[0029] 图 2A 为 TPGSiow-COOH 的 MALDI-TOF-MS 图谱。
[0030] 图 2B 为祀向配体 TPGSiow-VAP 的 MALDI-T0F-MS 图谱。
[0031] 图 3A 为 OlOkWG-N服的 MALDI-T0F-MS 图谱。
[0032] 图 3B 为祀向配体 CHOkWG-PEI 的 MALDI-T0F-MS 图谱。
[0033] 图4A为多功能祀向异长春花碱脂质体的透射电镜照片。
[0034] 图4B为多功能祀向异长春花碱脂质体原子力显微镜二维照片。
[0035] 图4C为多功能祀向异长春花碱脂质体原子力显微镜H维照片。
[0036] 图5A为多功能祀向异长春花碱脂质体的粒径分布图。
[0037] 图5B为多功能祀向异长春花碱脂质体的Zeta电位图。
[0038] 图6为不同脂质体对C6胶质瘤细胞的抗增殖作用。
[0039] 图7为流式细胞仪测定C6胶质瘤细胞摄取异长春花碱的情况。
[0040] 图8为激光共聚焦显微镜共定位测定C6胶质瘤细胞摄取异长春花碱的情况。
[0041] 图9A为体外血脑屏障模型的结构示意图。
[0042] 图9B为透过血脑屏障能力的测定图。
[0043] 图10为不同脂质体对C6胶质瘤细胞细胞色素C释放的影响。
[0044] 图11为不同脂质体对C6胶质瘤细胞细胞调亡的影响。
[0045] 图12A为不同脂质体对C6胶质瘤细胞调亡酶化spase 9的影响。
[0046] 图12B为不同脂质体对C6胶质瘤细胞调亡酶化spase 3的影响。
[0047] 图13为不同脂质体在C6胶质瘤干细胞球中的穿透能力情况。
[0048] 图14为不同脂质体对C6胶质瘤干细胞球破坏的影响。
[0049] 图15A为药物在ICR荷瘤小鼠活体状态下的组织分布情况。
[0050] 图15B为药物在ICR荷瘤小鼠离体状态下的组织分布情况。
[0051] 图16为C6胶质瘤小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。
【具体实施方式】
[005引一、仪器与试药。
[005引 1. 1、仪器；电子分析天平（AY220,日本岛津公司）；电热恒温水浴锅师-4,上 海医疗器械五厂）；旋转蒸发器（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂）；超声波细胞捣碎机 (JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司）；脂质体挤出仪（LF-1，加拿大AVESTIN公 司）；聚碳酸脂膜(孔径400皿、200皿、100皿，德国Whatman公司）；恒温振荡器（S监-82,上 海仪纯实业有限公司）；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MLDI-T0F-MS，日本岛津公 司）;激光散射粒径测定仪狂etasizer 3000HS，英国马尔文公司）；透射电子显微镜（Tecnai G220ST，美国阳I公司）;原子力扫描探针显微镜（SPI3800N，日本精工株式会社);扫描电子 显微镜（JSM-5600 LV,日本电子株式会社）；WJ-80B- II二氧化碳细胞培养箱（WJ-80B- II， 上海新苗医疗器械有限公司）；超净工作台（AirTECH，中国苏净安泰公司）；倒置显微镜 狂DS-1B，中国重庆光学电学仪器公司）；酶标仪（MR-96,深圳迈瑞生物医疗电子股份有限 公司）；激光共聚焦显微镜（SP8,德国LEICA公司）;流式细胞仪（FACSCalibur，美国Becton Dickinson公司）；多功能小动物活体成像系统（巧，美国柯达公司）。
[0054] 1. 2、试剂与试药；聚己二醇-二硬脂醜磯脂醜己醇胺（DSPE-PEG2。。。）、胆固醇-聚 己二醇-NHS (CH0L-PEG-NHS)、卵磯脂（DPPC)(日本油脂株式会社）；聚己二醇1000维生素 E玻巧酸醋（TPGSi。。。)、聚己帰亚胺（PEI)(美国Sigma公司）；戊二酸（国药集团化学试剂北 京有限公司）；胆固醇（cholesterol, CHOL)(美国Avanti公司）；异长春花碱、粉防己碱(美 仑生物技术有限公司）；碳二亚胺（EDC)(上海Me化巧公司）；二甲基甲醜胺（DMF)、N-轻基 玻巧醜亚胺（N服）（北京腾达科技有限公司）;伐普肤（VAP)(上海楚肤生物科技有限公司）。 [00巧]二、多功能祀向异长春花碱脂质体的制备与表征。
[0056] 请参阅图1，图1为本发明多功能祀向异长春花碱脂质体示意图。本发明提供一种 多功能祀向异长春花碱脂质体，是由异长春花碱、脂材及功能性祀向配体组成的；所述脂质 体为双分子层结构，内部为水溶性空腔；所述异长春花碱包封在脂质体水溶性空腔中；所 述功能性祀向配体由脂质体表面的修饰物和脂质体双分子层中的祀向材料组成；所述脂质 体双分子层中的祀向材料为粉防己碱，所述粉防已碱包封在脂质体双分子层中；所述脂质 体表面的修饰物为伐普肤-聚己二醇1000维生素E玻巧酸醋（TPGSww-VAP)与胆固醇-聚 己二醇-聚己帰亚胺（CHOL-PEG-PEI )，所述TPGSww-VAP通过醜化反应修饰在脂质体的表 面，所述CHOL-PEG-PEI通过缩合反应修饰在脂质体的表面。
[0057] 2. 1、TPGSiw〇-VAP 和 OTOkWG-PEI 的合成与表征。
[0058] 2. 1. 1、TPGSiw〇-VAP 和 CHOkWG-PEI 的合成。
[0059] TPGSww-VAP由经戊二酸活化的聚己二醇1000维生素E玻巧酸醋上的駿基 TPGSww-COOH和伐普肤上的氨基通过醜化缩合而成，W EDC和N服为反应缩合剂。将 1011111〇1了口081圆一〇)地、8011111〇1￡0(：和8011111〇1畑8溶解在211110150溶液中，方口人1011111〇1 伐普肤，将反应液在20-25C下揽拌20-2化得粗产物，该粗产物转移到透析袋(截留分子量 2000化)，在去离子水中透析4她，除去未反应的原料。接下来将透析后的产物冷冻干燥，得 到干燥的产物混合物白色粉末。
[0060] CHOL-PEG-PEI由CH0L-PEG-NHS上的N服和PEI上的氨基通过缩合而成，将 40 y mol阳I和8 y mol OlOkWG-N服溶解在2ml DMF溶液中，将反应液用N-甲基吗晰调 节pH至9. 0,将反应液在20-25C下揽拌30-3化得粗产物，该粗产物转移到透析袋(截留分 子量2000化)，在去离子水中透析4她，除去未反应的原料。接下来将透析后的产物冷冻干 燥，得到干燥的产物混合物白色粉末。
[0061] 2. 1. 2、TPGSi圆-VAP 和 CHOkPEG-PEI 的表征。
[0062] 所述TPGSww-VAP和CHOL-PEG-PEI均为共辆化合物，分别将两种共辆化合物 通过基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行检测，如图2A、2B、3A、3B所示，图2A为 TPGSiow-COOH 的 MALDI-T0F-MS 图谱，图 2B 为祀向配体 TPGSiw〇-VAP 的 MALDI-T0F-MS 图 谱，图3A为CHOL-PEG-N服的MALDI-TOF-MS图谱，图3B为祀向配体CHOL-PEG-PEI的 MLDI-TOF-MS图谱。请参阅图2A与图2B，TPGSiaw-COOH的加轴质谱峰1710. 02 Da,终产 物中TPGSww-VAP的加钟平均分子质量为2859. 65 Da,两者分子量的差值接近VAP的分子 质量1131. 37 Da。请参阅图3A与图3B，CHOL-PEG-N服的分子量为2463. 72 Da,终产物中 CHOL-PEG-PEI的加钟平均分子质量为3062. 96 Da,两者分子量的差值接近PEI的分子质量 600. 00 Da。
[0063] 2. 2、不同脂质体的制备。
[0064] 2. 2. 1、多功能碑!向异长春花碱脂质体的制备。
[0065] 步骤1、粉防己碱、TPGSww-VAP、CHOL-PEG-PEI及脂材溶解于氯仿中，旋转蒸发除 去氯仿，得到脂膜。所述DPPC、CHOL、DS阳-PEG2。。。、TPGSiwa-VAP和CHOkWG-PEI按物质的 量之比为60:20:3:1.5:1.5溶解在氯仿中，氯仿液中加入粉防己碱，粉防已碱与脂材的质 量比为1:20,超声使其溶解，旋转蒸发除去氯仿，在4(TC、100巧m条件下旋蒸形成薄膜，即 得脂膜。
[0066] 步骤2、将所述脂膜用5ml硫酸馈溶液水化，水化液超声lOmin，使脂膜分散在水化 液中，然后水化液使用脂质体挤出仪分别挤过400nm、200nm和IOOnm孔径的滤膜各3次，制 备空白多功能祀向脂质体。
[0067] 步骤3、空白多功能祀向脂质体密封于透析袋(截留值10000-12000 Da)中，置磯酸 盐缓冲液（PBS)中透析3次，每次12h。
[0068] 步骤4、取异长春花碱，异长春花碱与脂材的质量比为1:60,加至透析后的空白多 功能祀向脂质体，置4(TC恒温振荡器中，lOOr/min振摇30min，得到所述多功能祀向异长春 花碱脂质体。
[0069] 2. 2. 2、不同祀向配体修饰的脂质体的制备。
[0070] 为与本发明多功能祀向异长春花碱脂质体进行比较，制备了伐普肤修饰的异长春 花碱脂质体（VAP修饰异长春花碱脂质体)、聚己帰亚胺修饰的异长春花碱脂质体（PEI修饰 异长春花碱脂质体）及粉防己碱修饰的异长春花碱脂质体（TET修饰异长春花碱脂质体）作 为对照组，进行功能效果比对。
[0071] VAP修饰异长春花碱脂质体采用上述相同的方法制备，其中祀向配体 CHOL-PEG-PEI用CHOL-PEG-N服代替，且不加入粉防己碱。
[0072] PEI修饰异长春花碱脂质体采用上述相同的方法制备，其中祀向配体TPGSiwa-VAP 用TPGSi。。。代替，且不加入粉防己碱。
[0073] TET修饰异长春花碱脂质体通过上述相同的方法制备，其中祀向配体 CHOkWG-PEI 和 TPGSww-VAP 分别用 CHOkWG-N服和 TPGSi。。。代替。
[0074] 2. 2. 3、英光探针脂质体的制备。
[0075] 为了考察多功能祀向脂质体在荷瘤小鼠体内外祀向性及其祀向机理，选择香豆 素、柔红霉素和DiR作为英光探针，分别制备不同的英光探针脂质体。其中香豆素脂质体、 VAP修饰香豆素脂质体、PEI修饰香豆素脂质体、TET修饰香豆素脂质体及多功能祀向香豆 素脂质体(香豆素与脂材的质量比1:200);柔红霉素脂质体、VAP修饰柔红霉素脂质体、PEI 修饰柔红霉素脂质体、TET修饰柔红霉素脂质体及多功能祀向柔红霉素脂质体(柔红霉素与 脂材的质量比1:20) ;DiR脂质体、VAP修饰DiR脂质体、PEI修饰DiR脂质体、TET修饰DiR 脂质体及多功能祀向DiR脂质体（DiR与脂材的质量比1:300)分别按照上述相同的方法制 备，其中异长春花碱分别用香豆素、柔红霉素和DiR代替。
[0076] 2. 3、脂质体的表征。
[0077] 将所制备的各种脂质体分别通过Se地adex G-IOO柱分离游离异长春花碱，并按照 W下公式计算异长春花碱的包封率；EE= (Wi/XnJ X 100%，其中，Wi是过Se地adex G-IOO柱 后被甲醇破坏的脂质体中异长春花碱的质量，WtMdi是相同体积的脂质体直接经过甲醇破坏 后的异长春花碱质量。
[0078] 脂质体表面及形态使用透射电子显微镜及原子力扫描探针显微镜进行观察。请参 阅图4A、图4B与图4C，其中，图4A为多功能祀向异长春花碱脂质体的透射电子显微镜的照 片，图4B为多功能祀向异长春花碱脂质体的原子力扫描探针显微镜的二维照片，图4C为多 功能祀向异长春花碱脂质体的原子力扫描探针显微镜的H维照片。
[0079] 采用激光散射粒径测定仪测定各种脂质体的粒径和Zeta电位。请参阅图5A与图 5B，其中，图5A为多功能祀向异长春花碱脂质体的粒径分布图，图5B为多功能祀向异长春 花碱脂质体的Zeta电位图。
[0080] 脂质体的表征结果见表1。
[008。 表1 ;脂质体的表征结果。
【权利要求】
1. 一种多功能靶向异长春花碱脂质体，其特征在于，包括：异长春花碱、脂材及功能性 靶向配体；所述脂质体为双分子层结构，内部具有水溶性空腔；所述异长春花碱包封在脂 质体水溶性空腔中；所述脂材由卵磷酯（DPPC)、胆固醇（CHOL)、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰 乙醇胺（DSPE-PEG 2_)组成；所述功能性靶向配体由脂质体表面的修饰物和脂质体双分子 层中的靶向材料组成；所述脂质体双分子层中的靶向材料为粉防己碱，所述粉防已碱包封 在脂质体双分子层中；所述脂质体表面的修饰物为伐普肽-聚乙二醇1000维生素 E琥珀酸 酯（TPGS_-VAP)与胆固醇-聚乙二醇-聚乙烯亚胺（CHOL-PEG-PEI)，所述TPGS_-VAP通 过酰化反应修饰在脂质体的表面，所述CHOL-PEG-PEI通过缩合反应修饰在脂质体的表面。
2. 如权利要求1所述的多功能靶向异长春花碱脂质体，其特征在于：所述DPPC、CHOL、 DSPE-PEG^^TPGSh^-VAP 及 CHOL-PEG-PEI 的物质的量之比为（55-65): (18-22): (3-3. 5): (1. 3-1. 8) : (1. 3-1. 8)。
3. 如权利要求1所述的多功能靶向异长春花碱脂质体，其特征在于：所述异长春花碱 与脂材的物质的量为1:50-1:70,所述粉防己碱与脂材的物质的量为1:10-1:30。
4. 如权利要求1所述的多功能靶向异长春花碱脂质体，其特征在于：所述伐普肽-聚 乙二醇1000维生素 E琥珀酸酯（TPGS_-VAP)是由伐普肽（VAP)中的氨基与经戊二酸活 化的聚乙二醇1000维生素 E琥珀酸酯的羧基（TPGS^^COOH)发生酰化反应合成的；所述 TPGS1(I(I(I-VAP为共轭化合物，所述酰化反应的缩合剂为碳二亚胺（EDC)和N-羟基琥珀酰 亚胺（NHS)，所述酰化反应的温度为20-25°C、时间为20-24h，所述酰化反应在二甲基亚砜 (DMS0)溶剂中进行，所述酰化反应中VAP: TPGS^a-COOH: EDC: NHS=1:1:8:8 (摩尔比）。
5. 如权利要求1所述的多功能靶向异长春花碱脂质体，其特征在于：所述胆固醇-聚 乙二醇-聚乙烯亚胺（CHOL-PEG-PEI)是由聚乙烯亚胺（PE I)中的氨基与胆固醇-聚乙 二醇-NHS (CHOL-PEG-NHS)中的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)发生缩合反应合成的；所述 CHOL-PEG-PEI为共轭化合物，所述缩合反应的温度为20-25°C，时间为30-36h，所述的缩合 反应可以在二甲基甲酰胺（DMF)溶剂中进行，DMF溶液用N-甲基吗啉调节pH为8. 5-9. 5， 所述缩合反应中PEI:CH0L-PEG-NHS=5:1 (摩尔比）。
6. 权利要求1-5所述的多功能靶向异长春花碱脂质体的制备方法，其特征在于：包括 如下步骤： 步骤1、粉防己碱、TPGS1(I(I(I-VAP、CHOL-PEG-PEI及脂材溶解于氯仿中，旋转蒸发除去氯 仿，得到脂膜； 步骤2、将所述脂膜用硫酸铵溶液水化，水化液超声10min，然后使用脂质体挤出仪分 别挤过400nm、200nm和100nm孔径的滤膜各3次，制备空白多功能祀向脂质体； 步骤3、将所述空白多功能靶向脂质体密封于透析袋(截留值10000-12000 Da)中，置磷 酸盐缓冲液（PBS)中透析3次，每次12h ; 步骤4、取处方量的异长春花碱，加至透析后的空白多功能靶向脂质体，置40°C恒温振 荡器中，100r/min振摇30min，得到多功能祀向异长春花碱脂质体。
7. 如权利要求6所述的多功能靶向异长春花碱脂质体，其特征在于：所述脂材由卵 磷脂（DPPC)、胆固醇（CH0L)、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG 2_)组成；所 述 DPPC、CHOL、DSPE-PEG2Q(IQ、TPGS1(I(I(I-VAP 及 CHOL-PEG-PEI 的物质的量之比为（55-65): (18-22): (3-3.5): (1.3-1. 8): (1.3-1. 8);所述异长春花碱与脂材的质量比为 1:50-1:70， 所述粉防己碱与脂材的质量比为1:10-1:30。
8. 如权利要求7所述的多功能靶向异长春花碱脂质体的制备方法，其特征在 于：所述 DPPC、CHOL、DSPE-PEG2Q(IQ、TPGS1(I(I(I-VAP 及 CHOL-PEG-PEI 的物质的量之比为 60:20:3:1. 5:1. 5〇
9. 如权利要求7所述的多功能靶向异长春花碱脂质体的制备方法，其特征在于：所述 异长春花碱与脂材的质量比为1:60,所述粉防己碱与脂材的质量比为1:20。
10. 权利要求1所述的多功能靶向异长春花碱脂质体的应用，其特征在于：所述多功能 革巴向异长春花碱脂质体用于制备脑胶质瘤细胞抑制剂。
【文档编号】A61K47/42GK104224718SQ201410526731
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月9日 优先权日:2014年10月9日
【发明者】李学涛, 程岚, 姜英, 吕佳, 袁子民, 刘玉强, 赵琳 申请人:辽宁中医药大学