化的融合蛋白溶液装入已经处理好的透析袋，放入透析缓冲液 (50mMPBSPH8. 0,0. 15M化印中4°C过夜，W去除纯化蛋白中含有的咪挫。次日，将透析 后的蛋白过浓缩柱进行浓缩，4 °C、400化pm离屯、1Omin。
[0065] 测量浓缩后的融合蛋白的浓度。
[0066]W下为本发明名称术语的解释：
[0067] 1.T载体；聚合酶链反应产物的克隆运载体，线性化后两侧3'端各多出一个脱氧 胸巧酸订）。由于PCR产物两侧3'端通常含单个脱氧腺巧酸（A)，与T载体之间的A-T互 补性可提高PCR产物克隆的效率。
[006引 2.D册a;拉了名Escherichiacoli,大肠杆菌属，D册a菌株是一种能够摄入外 源DNA的受容菌，D册a菌株是一种经诱变的菌株，其基本特性是；R-、M-、AMP-。R-是 指D册a菌株缺乏DNA修饰，即其自身DNA不会被修饰。M-是指其缺乏"免疫"机制，不会 对导入的外源DNA切割。AMP-是指其对氨节青霉素敏感。D册a菌株可W用于制作基因 库等，除此之外，因其特性，可用作基因工程的受体菌。
[0069] 3.大肠杆菌感受态D册a;细胞处于能够吸收DNA的状态称感受态，处于感受态的 细胞称作感受态细胞。受体细胞D册a经过一些特殊方法（如；CaCl2等化学试剂法）的处 理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。
[0070] 4.大肠杆菌Rosetta;是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白 表达的菌株。经提高稀有tRNA水平，可W提高一些真核基因表达效率。
[0071] 5.LB液体培养基（不含抗性）：是培养细菌的常用液体培养基，配方为：膜蛋白腺 (T;ryptone)10g/L、酵母提取物（Yeastextract) 5g/L、氯化钢 〇JaCl)5g/L。
[0072] 6.LB固体培养基：是培养细菌的常用固体培养基，配制：膜蛋白腺 (T;ryptone)10g/L、酵母提取物（Yeastextract) 5g/L、氯化钢 〇JaCl)5g/L、琼脂粉 15g/L。[007引 7.IPTG;中文品名：异丙基-e-D-硫代化喃半乳糖巧，分子式：C9H1805S，分子 量：238. 30。IPTG是0 -半乳糖巧酶的活性诱导物质。基于该个特性，当pUC系列的载体DNA(或其他带有lacZ基因载体DNA)WlacZ缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13瞻菌体 的载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X-gal和IPTG，由于0 -半乳糖巧酶 的a-互补性，可W根据是否呈现白色菌落（或瞻菌斑）而方便地挑选出基因重组体。此 夕F，它还可W作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。
[0074] 8. 1XSDS凝胶加样缓冲液；先配置2XSDS凝胶加样缓冲液，其组分参考《分子克 隆》第S版如下；Tris-肥1p册.8(100mM) ;SDS(4%);漠酪兰（0. 2%);甘油（20%) ;e-琉 基己醇或二硫苏糖醇（200mM)。再按照比例稀释成2XSDS凝胶加样缓冲液。
[0075] 9.SDS-聚丙締酷胺凝胶电泳（SDS-PAGE);聚丙締酷胺凝胶电泳（英语： polyac巧lamidegelelectrophoresis，简称PAGE)作用；用于分离蛋白质和寡核巧酸。作 用原理；聚丙締酷胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式；非变性聚丙締酷胺 凝胶电泳（化tive-PAG巧及SDS-聚丙締酷胺凝（SDS-PAGE);非变性聚丙締酷胺凝胶，在电 泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所 附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
[0076] 10.溶菌酶：又称胞壁质酶（muramidase)或N-己酷胞壁质聚糖水解酶 (N-acet^muramideglycanohy化lase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通 过破坏细胞壁中的N-己酷胞壁酸和N-己酷氨基葡糖之间的0 -1，4糖巧键，使细胞壁不溶 性黏多糖分解成可溶性糖肤，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带 负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具 有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
[0077] 11.Beads;试剂NiSe地aroseTMBreastFlow(GE公司）中的HisMagSe地arose。
[0078] 在获得本发明化CAM-hGM-CSF重组蛋白后，为鉴定其结果的准确性，进行了如下 的鉴定实验：
[0079]Wsternblot对E；pCAM-hGM-CSF重组蛋白进行鉴定；
[0080] 分别取重组蛋白20y1，加入等体积的2XSDS凝胶加样缓冲液，煮沸lOmin，取 20y1进行SDS-聚丙締酷胺凝胶电泳（SDS-PAG巧分离蛋白样品。首先80V恒压电泳30min， 目的使蛋白样品在浓缩胶中压成一条线，待蛋白样品跑出浓缩胶进入分离胶中，提高电压 至150V，待漠酪藍前沿完全跑出胶后，电泳完成。将PVDF膜在甲醇中活化20s，迅速转移 到转移缓冲液（1L转移缓冲液中含Tris3. 03g，甘氨酸14. 4g，甲醇200ml)中，将上下滤纸 和SDS-PAGE胶浸泡在转移缓冲液中。半干转移法转膜；在半干转移器上顺次放滤纸、PVDF 膜、胶及另一张滤纸，22V转膜30-60min，转膜时间依蛋白大小和胶浓度而定。转膜结束后 将膜取出并标记蛋白面，用1XTBST缓冲液（化缓冲液中含Tris4. 84g，化C158. 48g，1ml Tween-20)洗3-5min。将膜放入1XTBST缓冲液配制5 %的脱脂奶粉溶液中，水平摇床上 封闭2小时W上。5%的脱脂奶粉溶液稀释HIS抗体（稀释比例1:1500)，使膜与一抗在室 温结合化r，或4°C结合过夜。1XTBST缓冲液洗4次，每次lOmin。5%的脱脂奶粉溶液配 制相应二抗（稀释比例l:10000)，室温结合l-化r。lXTBST缓冲液洗4-5次，每次10min。 将发光底物（SuperSi即alWest化mto)的A液和B液等体积混匀后，适量加到PVDF膜上 (一张膜100y1)，之后在暗室压X光片曝光，并洗片，然后拍照记录。
[0081] 鉴定结果：
[0082]1、化CAM和hGM-CSF基因的扩增；
[008引 W腺癌细胞株LS174-T的cDNA为模板，用化CAM的上下游引物进行PCR扩增，扩 增的PCR产物其大小为950bp左右；WpORFhGM-CSF质粒为模板，用hGM-CSF的上下游引物 进行PCR扩增，扩增的PCR产物其大小为450bp左右。PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1 所示，产物片段大小与预期结果相符。
[0084] 2、菌体PCR;
[0085] 连接产物转化感受态大肠杆菌D册a，分别用化CAM和hGM-CSF的上下游引物进行 PCR扩增，从而来鉴定阳性菌。从图2中可W看到2-6,8-10,化及11-16为阳性结果，其余 泳道结果为阴性。
[0086] 3、双酶切鉴定；
[0087] 提取阳性菌落的质粒，然后进行酶切鉴定，用限制性内切酶化0I和SalI酶切 化CAM,其大小为950bp左右；用限制性内切酶SalI和化0I酶切hGM-CSF，其大小为45化P 左右；用限制性内切酶化0I和化0I酶切化CAM和hGM-CSF的融合基因，其大小为1400bp 左右；脂糖凝胶电泳结果如图3所示，片段大小与预期结果相符。
[008引 4、重组化CAM-GM-CSF融合蛋白的诱导表达；
[0089] 将已经构建好的祀T-EpCAM-hGM-CSF重组质粒转化大肠杆菌Rosetta菌株，培 养祀T-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta，由IPTG诱导表达。经SDS-PAGE鉴定（图4a)，可见 化CAM-hGM-CSF融合蛋白表达。为了进一步确定融合蛋白的可溶性，诱导后的菌体超声破碎 后，经SDS-PAGE鉴定，化CAM-hGM-CSF融合蛋白在上清中和包涵体均表达（图4b)，上清表 达的可溶性蛋白将用于融合蛋白的纯化实验。
[0090] 5、重组化CAM-GM-CSF融合蛋白的纯化、浓缩及鉴定；
[0091] 为获得纯化的EPCAM-hGM-CSF融合蛋白，我们对祀T-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta菌 体破碎上清采用NiSe地arose? 6化stFlow进行纯化。经SDS-PAGE鉴定，结果显示（图 5)，经纯化后能够获得较纯的化CAM-hGM-CSF融合蛋白。为了便于储存和使用，将纯化后获 得的EPCAM-hGM-CSF融合蛋白经浓缩柱浓缩，最终通过westernblot进一步对融合蛋白进 行鉴定（图6)。
[009引应用；
[0093] 本发明的化CAM-GM-CSF基因重组蛋白，具备了化CAM的抗原特征，同时具备了 GM-CSF的免疫辅助功能，可应用于治疗型DC疫苗的制备，W及腺癌特异性CTL效应细胞的 制备，因而，是细胞免疫治疗中绝好的肿瘤特异性抗原选择。应用该基因重组蛋白制备的治 疗型DC疫苗，具有高效率的T细胞活化效应，能有效提高临床疗效。
[0094]W下通过实验数据说明本发明的治疗用途：
[0095] 1、实验设计和方法；
[0096] (1)外周血单状核细胞的获取；应用血液成分分离机，或抽取结肠癌病人外周血 100ml，经梯度密度离屯、获取单状核细胞。
[0097] 口)贴壁法获得DC细胞和T细胞，分别培养。
[009引樹DC疫苗的制备；DC细胞培养基中分别加入GM-CSF和比-4扩增培养5天。第5天 分别加入LST-174细胞裂解物、EpCAM、及化CAM-GM-CSF重组蛋白，在TNF-a参与下培养2 天，分别收获S种DC疫苗；①、lysate-DCVAC;②、EpCAM-DCVAC;⑨、EpCAM-GM-CSF-DCVAC。 分别流式检测=种疫苗细胞表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达。
[0099] (4)抗原特异性CTL的制备；T细胞培养基中加入IL-2扩增培养至第7天，分别与 上述S种DC疫苗共培养2-4天，收获S种抗原特异性CTL效应细胞；①、lysate-CTL;②、 化CAM-CTL;⑨、EpCAM-GM-CSF-CTL。
[0100] 脚invitro细胞杀伤实验：应用MTTassay,取LST-174腺癌细胞株作为祀细 胞，分为4组进行细胞杀伤实验。①、对照组；不加任何效应细胞；②、细胞裂解物组；加入 lysate-CTL;⑨、EpCAM蛋白组；加入化CAM-CTL;④、重组蛋白组；加入化CAM-GM-CSF-CTL;观察杀伤效率。
[0101] 做invivo杀伤实验；取裸鼠，行人体免疫重建；皮下接种LST-174细胞株造 模；肿瘤生长到0. 5cm时，分别瘤旁注射生理盐水（对照）、lysate-CTL、化CAM-CTL和 化CAM-GM-CSF-CTL;观察肿瘤消退情况。
[0102] 仍统计学处理。
[0103] 2、结果；
[0104] (1)invitro实验结果：效祀比为10 ;1时，裂解物负载DC诱导的CTL、化CAM负载 DC诱导的CTL、及化CAM-GM-CSF负载DC诱导的C化，对LST-74祀细胞的杀伤效率分别为 34. 1%、58. 4%、68. 1% (P<0. 05respectively;图 7)。效祀比为 20 ;1 时，裂解物负载DC诱 导的CTL、化CAM负载DC诱导的CTL、及化CAM-GM-CSF负载DC诱导的C化，对LST-74祀细 胞的杀伤效率分别为 68. 5%、76. 4%、87. 4% (P<0. 05respectively;图 8)。化CAM蛋白负 载DC诱导的CTL，杀伤效率显著高于裂解物负载DC诱导的CTL(P