一种双特异性抗体egfr×cd3的构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫学的技术领域。具体地说，设及双特异性抗体的构建和制备方法。
【背景技术】
[0002] 双特异性抗体化ispecificantibody,BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的 人工抗体，能在祀细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb在 生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用 杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关 抗原和免疫效应细胞上的祀分子，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。W下 是针对所研究的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，W及相关技术发展的一些【背景技术】介绍。
[0003] 1.CD3
[0004] CD3分子由4个亚基组成；5、e、丫、C，其分子质量分别为18. 9kDa、23.IkDa、 20. 5kDa、18. 7kDa，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肤链， 常与T细胞受体（Tcellrec巧tor，TCR)紧密结合形成含有8条肤链的TCR-CD3复合体，结 构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定TCR结构的功能。CD3胞质段含免 疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif,ITAM)，TCR 识别并结合由MHC(majorhisto-compatibilitycomplex)分子提呈的抗原肤，导致CD3的 ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p561ck磯酸化，然后可募集其 他含有甜2(Scrhomology2)结构域的酪氨酸蛋白激酶（如ZAP-70)。ITAM的磯酸化和与 ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子 的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。
[000引 2.EGFR
[0006] 表皮生长因子受体巧GFR，EpidermalGrowthFactorReceptor)是表皮生长 因子巧G巧细胞增殖和信号传导的受体。EGFR属于化bB受体家族的一种，该家族包括 EGFR巧rbB-1)，肥R2/c-neu巧rbB-2)，Her3 巧rbB-3)和Her4 巧rbB-4)。EGFR也被称作 肥R1、化bBl，突变或过表达一般会引发肿瘤。EGFR是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受 体，细胞膜贯通，分子量17〇KDa。EGFR位于细胞膜表面，靠与配体结合来激活，包括EGF和 TGFa(transforminggrowthfactora)。激活后，EGFR由单体转化为二聚体，尽管也有 证据表明，激活前也存在二聚体。EGFR还可能和化bB受体家族的其他成员聚合来激活，例 如&rbB2/Her2/neu。
[0007] 在配体与EGFR结合后，受体发生了二聚作用，二聚作用既包括两个同种受体分子 的结合（同源性二聚作用），也包括人类EGF相关性受体（HER)酪氨酸激酶家族中的不同成 员的结合（异源性二聚作用）。二聚作用后是酪氨酸残基的自磯酸化作用。该些磯酸化的 残基是募集适配蛋白和额外的酪氨酸激酶底物的结合位点。蛋白质在激活的受体复合物中 相互作用刺激ras蛋白，导致磯酸化级联反应的发生和丝裂原激活蛋白（MA巧激酶的激活。 或者转录信号传导和激活、磯脂酷肌醇激酶-3(PI3K)-Akt和应激活化蛋白激酶（SAPK)信 号传导通路将被激活。该些信号通路依次触发基因转录，同时控制细胞增生、分化和生存的 通路被激活。
[000引EGFR介导信号通路的特异性和强度取决于激活蛋白的性质和四种EGFR家族成员 的水平。与肥R2结合的配体不详，但当肥R2和EGFR共表达时，前者经常与配体激活的后 者结合形成二聚体。该种异源性二聚体与EGFR同源性二聚体相比，往往具有更高的再利用 率、稳定性和传导信号的能力。EGFR也能与肥R3和肥R4发生二聚作用，其产物具有更高的 持久性和更强的PI3K活性。EGFR信号传导通路一旦配体结合的EGFR被内吞入细胞，信号 将终止，受体将被降解或再循环到细胞膜表面，该取决于配体的性质。例如，EGF结合的受 体将被降解，而TGF-a结合的受体则进入再循环。不同的生长因子会影响EGFR信号通路 的数量和持续时间。
[0009]EGFR信号通路有多重的生物学作用。例如，ras-MAPK信号转导通路刺激细胞的分 裂和迁徙。EGFR也是多种受体通路的重要介体，起到信号会聚点的作用，能够将信号整和 与多样化。例如，在应激、膜解聚作用和一些非生理性刺激物（包括氧化剂、放射线和烧化 剂）的反应中，反向激活能诱导EGFR酪氨酸激酶的磯酸化并随后发生信号的转导。EGFR家 族的成员在正常发育中起了重要的作用，但在人类肿瘤中经常过度表达并失去控制。
[0010]研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的 增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞调亡的抑制有关。其可能机制有；EGFR的高表达引 起下游信号传导的增强；突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化；自分 泌环的作用增强；受体下调机制的破坏；异常信号传导通路的激活等。EGFR的过表达在恶 性肿瘤的演进中起重要作用，胶质细胞、肾癌、肺癌、前列腺癌、膜腺癌、乳腺癌等组织中都 有EGFR的过表达。对胶质细胞瘤的研究发现EGFR的高表达主要与其基因扩增有关。但有 时EGFR表达水平的调节异常也存在于翻译及翻译后。EGFR在肿瘤中的高表达还可能与活 化后降解减少有关，一些研究指出c-Src可通过抑制受体泛素化和内吞作用而上调EGFR水 平。许多肿瘤中有突变型EGFR存在，现已发现许多种EGFR突变型。突变型EGFR的作用可 能包括；具有配体非依赖型受体的细胞持续活化；由于EGFR的某些结构域缺失而导致受体 下调机制的破坏、异常信号传导通路的激活、细胞调亡的抑制等。突变体的产生是由于EGFR 基因的缺失、突变和重排。EGFR的配体对细胞内信号传导有很大影响。EGFR的配体通过自 分泌形式激活EGFR促进细胞增殖，他们的共表达往往预示肿瘤预后不良，例如，在乳腺浸 润性导管癌的研究中发现，TGFa与EGFR共表达，且该种共表达与病人的生存率显著相关。 Kopp等人对结/直肠癌的研究表明肿瘤的自分泌生长是EGFR的过表达及其配体表达共同 作用的结果。
[0011]此外，对EGFR与肿瘤的血管生成、高侵袭性及转移关系的研究发现EGFR可W通过Ang-1及VEGF等因子水平的调节而影响肿瘤血管生成。
[0012] 3.双特异性抗体技术发展
[0013] 双特异性抗体，一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原 表位的抗体。
[0014] 抗体药物是W细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物 大分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定祀点定向制备等优点。单克隆抗体在临 床上主要应用于W下=个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗W及抗感染治疗。其中肿瘤的治 疗是目前单抗应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和上市的单抗产品中，用于肿 瘤治疗的产品数量占比大概为50%。单克隆抗体治疗肿瘤是一种针对病变细胞特异祀点刺 激免疫系统来杀伤祀细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能，特别是杀伤肿瘤细胞的 效果，人们尝试多种方法改造抗体分子，双特异性抗体是改善抗体治疗效果的发展方向之 一，现已成为抗体工程研究领域的热点。
[0015] 用于免疫治疗的双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在 祀细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗 中具有广阔的应用前景。
[0016] 4.双特异性抗体制备
[0017] 双特异性抗体可通过多种途径获得，其制备方法主要有：化学偶联法、杂交一杂交 瘤法和基因工程抗体制备法。化学偶联法是将2个不同的单克隆抗体用化学偶联的方式连 接在一起，制备出了双特异性单克隆抗体，该是最早的双特异性单克隆抗体概念。杂交一杂 交瘤法是通过细胞杂交法或者=元杂交瘤的方式产生双特异性单克隆抗体，该些细胞杂交 瘤或者=元杂交瘤是通过建成的杂交瘤融合，或者建立的杂交瘤和从小鼠得到的淋己细胞 融合而得到的，只能生产出鼠源的双特异性抗体，它的应用受到了极大的限制。而随着分子 生物学技术的迅速发展，出现了基因工程人源化双特异性抗体的多种构建模式，并主要分 为双特异性微抗体，双链抗体，单链双价抗体，多价双特异性抗体四类。目前，国际上已有 数种基因工程双特异性抗体药物进入临床试验阶段，并显示有较好的应用前景。
[001引 5.肿瘤的过继免疫治疗
[0019] 肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者 体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、TIL细胞、激活 的T淋己细胞和CIK细胞的免疫治疗。而免疫疗法只能清除少量的、零散的肿瘤细胞，对于 晚期的实体肿瘤疗效有限。故常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规方法联合 应用。先用常规方法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，可提高肿 瘤综合治疗的效果。其中，过继免疫治疗作为肿瘤综合治疗中的一个新方法，已经与常规手 术治疗、放疗、化疗及其他细胞和分子治疗得到广泛配合，在多种肿瘤的治疗中展示了广泛 的应用前景。然而，一种更理想的方式应该是，双特异性抗体一端可W结合培养好的免疫细 胞的表面抗原CD3,并随之一起输入体内，而双特异性抗体的另一端能很好地结合肿瘤细 胞的表面抗原；该样，双特异性抗体就能在体内架起肿瘤细胞和免疫细胞之间的桥梁，使免 疫细胞集中在肿瘤细胞周围，进而对肿瘤细胞进行杀伤。通过该种方法可有效解决肿瘤细 胞的转移和扩散，克服了手术、放化疗S大传统治疗方式后的"不彻底、易转移、副作用大" 等弊端。
【发明内容】
[0020] 术语和缩略语
[0021] BiAb:双特异性抗体化ispecificantibody)
[0022] TA:肿瘤抗原（tumorantigen)
[002引 VH:重链可变区化eavychainvari油leregion)。