CCAAGCTGGAGCTGAAAGGTGCGGCCGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACAC ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGT GGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCGGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGT GGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGAAGTCCGACGGCTCCTTCT TCCTCGCCAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAG GCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
[0089] 鼠kappa链的前导肤序列氨基酸序列（序列号11)
[0090] METDIILLWV化LWVPGSTG
[OOW] 鼠kappa链的前导肤序列核酸序列（序列号12)
[0092] atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggt
[0093] 2.双特异性抗体基因克隆
[0094] 选择pCHOl. 0作为表达载体去克隆和表达抗EGFR的重链和轻链基因，pCHOl. 0-潮 霉素表达载体是通过用潮霉素抗性基因替换pCHOl. 0载体中的嚷岭霉素基因改造而来，被 选择用来克隆和表达抗CD3的ScFv-化融合基因。表1中的引物根据克隆方案设计好后， 发送到苏州金唯智生物科技有限公司进行合成。W表1中的引物进行PCR扩增，模板为 由金唯智基因合成并克隆到pUC57上的基因质粒，包括化bitux和Vectibix的可变区，然 后分别将抗-EGFR重、轻链分别构建到pCHOl. 0的表达载体上，将抗CD3ScFv-化构建到 pCHOl. 0-潮霉素的表达载体上。
[0095] 表1.双特异性抗体基因克隆中使用的引物
[0096]
【主权项】
1. 双特异性抗体，其特征在于，所述该抗体包含：(a)单价单元，为轻链-重链对，该 轻链-重链对针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力，优选地该肿瘤细胞表面抗原是 EGFR、⑶20、⑶30和⑶133,更优选地该肿瘤细胞表面抗原是EGFR;和（b)单链单元，为融合 肽，该融合肽包含单链可变片段ScFv和具有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的Fc片段， 其中该融合肽针对的免疫细胞选自T细胞、NKT细胞或CIK细胞；优选地，该融合肽对免疫 细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力。
2. 根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：单链单元的CH2结构域位于铰 链区和CH3结构域之间；不包含CHl结构域；单链单元的铰链区位于ScFv和CH2结构域之 间。
3. 根据权利要求1所述双特异性抗体，其特征在于：所述单链可变片段由轻链可变区 和重链可变区结构域组成，它们都靶向于抗原表位CD3。
4. 根据权利要求1所述双特异性抗体，其特征在于：在所述单价单元中，轻链通过二硫 键与重链结合；所述重链通过一个或多个二硫键与所述融合肽结合。
5. 权利要求1所述双特异性抗体，其特征在于：单链单元包括针对人源CD3的抗体 抗-CD3,单价单元包括针对EGFR的抗体抗-EGFR; 优选地，所述抗-EGFR重链的氨基酸序列为序列号1所示的氨基酸序列，抗-EGFR的轻 链的氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD3ScFV-Fc的氨基酸序列为 序列号9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重链在222位点上的半胱氨酸与抗-EGFR的轻 链215位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在228和231位点上的 半胱氨酸与抗-⑶3ScFv-Fc的255和258位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所 述的抗-EGFR重链在394和411位点上与抗-⑶3ScFv-Fc的428和397位点上形成盐桥连 接，所述的抗-EGFR重链在368位点上与抗-⑶3ScFv-Fc的436位点上形成隆突-入-穴 连接。 或所述抗-EGFR重链的氨基酸序列为序列号5所示的氨基酸序列，抗-EGFR的轻链的 氨基酸序列为序列号7所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD3ScFV-Fc的氨基酸序列为序列 号9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重链在222位点上的半胱氨酸与抗-EGFR的轻链214 位点上的半胱氨酸以二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在228和231位点上的半胱 氨酸与抗-⑶3ScFv-Fc的255和258位点上的半胱氨酸分别以二硫键的形式连接，所述的 抗-EGFR重链在394和411位点上与抗-⑶3ScFv-Fc的428和397位点上形成盐桥连接，所 述的抗-EGFR重链在368位点上与抗-⑶3ScFv-Fc的436位点上形成隆突-入-穴连接。
6. 根据权利要求1所述双特异性抗体，其特征在于：所述单价单元中的重链包含人或 者人源化的Fc片段，优选地，该重链的Fc片段包含人IgGlFc片段；所述融合肽的Fc片段 包含人或者人源化的Fc片段，优选地，该融合肽的Fc片段包含人IgGlFc片段。
7. 根据权利要求6所述双特异性抗体，其特征在于：所述单价单元的人IgGlFc段和所 述单链单元的IgGlFc通过盐桥和隆突-入-穴结构连接。
8. 制备权利要求1-7中任一项所述双特异性抗体的方法，其特征在于，所述方法包括 步骤： (1)分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第二表 达载体上； (2) 将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清； (3) 将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；优选地，所述细胞是CHO-S细胞；或 者优选地，所述分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗 体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后浓缩置 换缓冲液PBS。
9. 根据权利要求8所述方法，所述第一表达载体是pCHOl. 0 ;所述第二表达载体是 pCHOl. 0-潮霉素。
10. 根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述方法的步骤（1)中： 所述单价单元为抗-EGFR抗体，扩增其轻链所用引物为Kozak(EcoRV)F，MK-Leader(EcoRV)F，和hlgK(PacI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切 位点EcoRV与PacI引入轻链；扩增其重链所用引物为Kozak(AvrII)F，MK-Leader(AvrI I)F和hlgGl(BstZ17I)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII 与BstZ17I引入重链；将扩增好的LC基因片段与用EcoRV与PacI酶切过的pCHOl. 0表达 载体进行同源重组，获得装入抗-EGFR轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZ17I酶切后再 和HC进行同源重组，获得抗-EGFR的pCHOl. 0表达载体，带Erbitux抗体基因的质粒命名 为pCHOl. 0-ERB-HL-KKW，或者带Vectibix抗体基因的质粒命名为pCHOl.O-VEC-HL-KKW; 所述单链单元为抗-⑶3ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为Kozak(AvrII)F，L2K-VH(MK)F1 和hlgGl(BstZ17I)R，通过PCR扩增抗CD3ScFv-Fc结构域，并将Kozak序 列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZ17I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段与酶切过的 pCHOl. 0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗⑶3ScFv-Fc的表达载体，质粒命名为 pCHOl. 0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY。
11. 权利要求1-7中任一项所述双特异性抗体或者按照权利要求8-10中任一项制备 的双特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗EGFR 特异抗原表达所引起的肿瘤或相关疾病，或者用于杀死表达EGFR细胞。
12. 权利要求1-7中任一项所述双特异性抗体或者按照权利要求8-10中任一项制备的 双特异性抗体的方法制备的双特异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在肿瘤细胞 系中筛选用于治疗表达EGFR特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物或者评价用于治疗表达 EGFR特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物的药效。
【专利摘要】本发明提供了一种双特异性抗体，本申请的双特异性抗体由单链单元和单价单元组成，其中该单链单元针对免疫细胞的表面抗原CD3具有特异性结合能力，该单价单元针对肿瘤细胞表面抗原EGFR具有特异性结合能力；该单链单元包含与Fc片段融合的单链可变片段(ScFv)，该单价单元包含轻链和重链对。本申请还提供双特异性抗体的制备方法以及这些抗体的药学用途。
【IPC分类】C07K16-30, C07K16-46, A61K39-395, C12N15-85, A61P35-00
【公开号】CN104774268
【申请号】CN201510030519
【发明人】王涛, 方丽娟, 杨锦霞, 戴晴, 刘勇, 周鹏飞
【申请人】武汉友芝友生物制药有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年1月21日