>[0024]VL:轻链可变区（li曲tchainvari油leregion)。
[0025]CL;轻链恒定区（^constantregionofli曲tchain)。
[0026]CDR;是英文Complementaritydeterminingregions(CDRs)的缩写，是指抗体的 抗原互补决定区。
[0027]ScFv;单链可变区抗体片段（single-chainvari油lefragment)，又称为单链抗 体。
[002引 化D:细胞系开发（celllinedevelopment)
[0029]FACS;巧光激活细胞分选（Fluorescence-activatedcellsorting)，也称为流式 细胞分选术。
[0030] 本发明针对常规单克隆抗体的不足之处，通过基因工程和抗体工程的方法进行的 新分子-双特异性抗体的创制，在传统单克隆抗体主要通过CDC，ADCC和调亡能力来杀伤肿 瘤细胞的基础上，增加了介导T细胞的免疫疗法，大大提高了免疫系统杀伤肿瘤细胞的功 效。
[0031] 具体地，本发明提供了W下的技术方案：
[0032] 在一种实施方式中，提供一种双特异性抗体，其特征在于，所述该抗体包含；(a) 单价单元，为轻链-重链对，该轻链-重链对针对肿瘤细胞表面抗原具有特异性结合能力， 优选地该肿瘤细胞表面抗原是EGFR、CD20、CD30和CD133,更优选地该肿瘤细胞表面抗原是 EGFR;和化）单链单元，为融合肤，该融合肤包含单链可变片段ScFv和具有较链区、C肥结 构域和C册结构域的化片段，其中该融合肤针对的免疫细胞选自T细胞、NKT细胞或CIK细 胞；优选地，该融合肤对免疫细胞表面抗原CD3具有特异性结合能力。
[0033] 在一种实施方式中，所述双特异性抗体的单链单元的CH2结构域位于ScFv片段和 C册结构域之间。
[0034] 在一种实施方式中，双特异性抗体的单链可变片段由轻链可变区和重链可变区结 构域组成，它们都祀向于抗原表位CD3。
[0035] 在一种实施方式中，在单价单元中，轻链通过二硫键与重链结合；重链通过一个或 多个二硫键与所述融合肤结合。
[0036] 在一种实施方式中，单链单元包括针对人源CD3的抗体抗-CD3,单价单元包括 针对EGFR的抗体抗-EGFR;优选地，所述抗-EGFR重链的氨基酸序列为序列号1所示 的氨基酸序列，抗-EGFR的轻链的氨基酸序列为序列号3所示的氨基酸序列，W及所述 抗-CD3ScFv-化的氨基酸序列为序列号9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重链在222位 点上的半脱氨酸与抗-EGFR的轻链215位点上的半脱氨酸W二硫键的形式连接，所述的 抗-EGFR重链在228和231位点上的半脱氨酸与抗-CD3ScFv-化的255和258位点上的半脱 氨酸分别W二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在394和411位点上与抗-CD3ScFv-Fc 的428和397位点上形成盐桥连接，所述的抗-EGFR重链在368位点上与抗-CD3ScFv-Fc 的436位点上形成隆突-入-穴连接；
[0037] 或所述抗-EGFR重链的氨基酸序列为序列号5所示的氨基酸序列，抗-EGFR的轻 链的氨基酸序列为序列号7所示的氨基酸序列，W及所述抗-CD3ScFv-化的氨基酸序列为 序列号9所示的氨基酸序列；并且抗-EGFR重链在222位点上的半脱氨酸与抗-EGFR的轻 链214位点上的半脱氨酸W二硫键的形式连接，所述的抗-EGFR重链在228和231位点上的 半脱氨酸与抗-CD3ScFv-化的255和258位点上的半脱氨酸分别W二硫键的形式连接，所 述的抗-EGFR重链在394和411位点上与抗-CD3ScFv-化的428和397位点上形成盐桥连 接，所述的抗-EGFR重链在368位点上与抗-CD3ScFv-化的436位点上形成隆突-入-穴 连接。
[003引在一种实施方式中，单价单元中的重链包含人或者人源化的化片段，优选地，该 重链的化片段包含人IgG化片段；所述融合肤的化片段包含人或者人源化的化片段，优 选地，该融合肤的化片段包含人IgG化片段。
[0039] 在一种实施方式中，所述单价单元的人IgG化段和所述单链单元的IgG化通过 盐桥和隆突-入-穴结构连接。
[0040] 在一种实施方式中，提供一种双特异性抗体的制备方法，所述方法包括：
[0041] (1)分别将单价单元的重、轻链分别构建到第一表达载体上，将单链单元构建到第 二表达载体上；
[0042] (2)将第一和第二表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清；
[0043] (3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体；优选地，所述细胞是CHO-S细 胞；或者优选地，所述分离步骤包括：蛋白A亲和层析柱从表达上清中捕获所有带化结构 域的抗体，通过SP阳离子交换层析实现目标双特异性抗体与副产物的分离，再过Q柱，最后 浓缩置换缓冲液PBS。
[0044] 在一种实施方式中，第一表达载体是pCHOl. 0 ;第二表达载体是pCHOl. 0-潮霉素。
[0045] 在一种实施方式中，所述单价单元为抗-EGFR抗体，扩增其轻链所用引物为 Kozak巧coRV)F、MK-Leader(EcoRV)F和hi巧(PacI)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、 前导序列及酶切位点EcoRV与化cl引入轻链；扩增其重链所用引物为Kozak(AvrII)F、 MK-Leader(AvrII)F和hIgGUBstZ17I)R，通过重叠PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及 酶切位点AvrII与BstZ17I引入重链；将扩增好的LC基因片段与用EcoRV与化cl酶切 过的pCHOl. 0表达载体进行同源重组，获得装入抗-EGFR轻链的表达载体；然后用AvrII 与BstZ17I酶切后再和肥进行同源重组，获得抗-EGFR的pCHOl. 0表达载体，带化bi化X 抗体基因的质粒命名为pCHOl. 0-ERB-HL-KKW，或者带Vectibix抗体基因的质粒命名为 pCHOl. 0-VEC-HL-KKW；
[0046] 所述单链单元为抗-CD3ScFv-Fc抗体，扩增其所用引物为Kozak(AvrII)F， L2K-VH(MK)F1 和hlgGl@stZ17I)R，通过PCR扩增抗CD3ScFv-化结构域，并将Kozak序 列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZ17I引入ScFv-Fc，将扩增好的基因片段与酶切过的 pCHOl. 0-潮霉素表达载体进行同源重组，获得装入抗CD3ScFv-化的表达载体，质粒命名为 pCHOl. 0-潮霉素-L2K-ScFv-Fc-LDY。
[0047] 在一种实施方式中，上述任一的双特异性抗体或者按照上述任一方法制备的双特 异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗EGFR特异抗原表达所引起的肿瘤或相 关疾病，或者用于杀死表达EGFR细胞。
[0048] 在一种实施方式中，上述任一的双特异性抗体或者按照上述任一方法制备的双特 异性抗体在制备药物中的用途，所述药物用于在人肿瘤细胞系中筛选用于治疗表达EGFR 特异抗原的肿瘤细胞相关疾病的药物或者评价用于治疗表达EGH?特异抗原的肿瘤细胞相 关疾病的药物的药效。本发明还提供了W下的技术方案：
[00例本发明提供了一种新方法制备双特异性抗体MSB0DY(monomerandScFv bispecificantibody)(如图2所示），该双特异性抗体包括两组重轻链组合，其中一组特 异结合一种抗原，并且在其重链化区进行一些改造，使其相对野生型，不易自身形成二聚 体；而另一组特异结合另一种抗原，同样在其重链化区进行另外一些改造，也不易自身形 成二聚体，而该两组重轻链之间很容易形成杂合二聚体。并且其中一组的抗体结构为单 聚体Ab，另一组为ScFv-Fc，该样就避免了各自轻链与对方重链错配的可能性，从而形成 125KD的双特异性抗体蛋白分子。化改造后，单聚体Ab的重链和单链自然异二聚化，同时 化和CH1间自然二聚化，最后形成MSB0DY，MSB0DY各结构域排列顺序及结构示意图见图2。 [0050] 本发明中利用W上制备双特异性抗体的方法，制备双特异性抗体。其中是WEGFR 和人源CD3为祀点的双特异性抗体，被命名为EGFRXCD3,如图2,抗-EGFR该边为IgG形式， 包括抗-EGFR重链与轻链，抗-CD3该边为ScFv-化形式，包括抗-CD3VH、VL、化结构域。W 上双特异性抗体通过抗体基因工程方法进行构建，双特异性抗体MSB0DY的单聚体Ab重链 和单聚体Ab轻链二元表达载体，W及ScFv-Fc表达载体。根据LC，肥，ScFv，化基因序列及 载体中的多克隆位点设计引物。其中LC，HC，ScFv和化分别进行PCR扩增，通过PCR或重叠 延伸PCR法获得基因片段，然后通过同源重组法进行克隆。酶切pCHOl. 0或pCHOl. 0-潮霉 素载体，然后纯化回收PCR产物和酶切后的载体，分二步分别将LC片段，HC片段同源重组克 隆到pCHOl. 0载体上，ScFv-化片段同源重组克隆到pCHOl. 0-潮霉素载体上，并测序。重组 蛋白质MSB0DY在哺乳动物细胞中的表达、检测，使用转染试剂将分别表达单价单元重链、 单价单元轻链和单链单元的质粒共转染至哺乳动物细胞中，再收集上清进行SDS-PAGE和 蛋白质印迹检测MSB0DY的表达情况。将转染表达后的培养液上清离屯、，过滤，用结合缓冲 液稀释，过亲和层析柱，洗脱缓冲液洗脱，SDS-PAGE检测纯化蛋白质。
[0化1] 本发明的技术方案的有益的技术效果有；
[0052] 1.本申请提供了一种异二聚体抗体，该抗体包含两个不同的抗原结合多肤单元。 该异二聚体与其对应的同二聚体分子量大小不同，可利用分子量的大小来区别异二聚体和 同二聚体，从而较方便的确定双特异性抗体的纯度。该两个抗原结合多肤单元之一包含类 似于野生型抗体的轻链-重链对，在整个本申请中，该单元也称为"单价单元"。另一抗原结 合多肤单元包含单链可变片段（ScFv)。该样的ScFv可融合至抗体的恒定片段（Fc)。在本 申请全文中此融合肤也被称为"单链单元"。
[0化3] 2.本发明公开了一种新型双特异性抗体MSB0DY介导的免疫细胞杀伤体外药效