实 验方法的建立及其应用。本发明包括双特异性抗体药物研究过程中所介导的免疫细胞杀 伤、双特异性抗体的制备，W及双特异性抗体体外药效模型的建立和检测。双特异性抗体 MSB0DY包括一组单价单元（重轻链组合），另一组则为单链单元（ScFv连接化组合），其中 单价单元特异结合一种人的肿瘤细胞抗原，包括EGFR等一系列肿瘤细胞膜表面抗原，并且 在其重链化区进行一些改造，使其相对野生型，不易自身形成二聚体；而另一组单链单元 特异结合另一种人的T细胞抗原CD3,同样在其重链化区进行另外一些改造，也不易自身形 成二聚体，而该两组单元之间很容易形成异二聚体。与此同时，双特异性抗体能在祀细胞和 功能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广 阔的应用前景。
[0054]令人惊奇的是，本申请证明该种非对称的抗体是稳定的并具有高的抗原结 合效率。该是令人感到意外的，因为已经证实在生理条件下即使是单链抗体的同二 聚体都是不稳定的。例如，Ahmad等的"ScFvAntibody:PrinciplesandClinical Application,"ClinicalandDevelopmentalImmunology, 2012:980250(2012),显示基于 ScFv的IgG类抗体不稳定，并且需要进一步改造W减少聚集并提高稳定性。
[0055] 另外，因为具有非对称性，异二聚体具有与由其中任一抗原结合多肤单元组成的 同二聚体所不同的等电点。基于异二聚体和同二聚体之间的等电点差异，可W容易地将需 要的异二聚体与同二聚体分离，大大减少了双特异性抗体普遍存在的下游工艺开发存在的 困难。
【附图说明】
[0056] 为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的 附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对 于本领域普通技术人员来来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据该些附图获得 其它的附图，其中：
[0化7]图1. CD3分子结构示意图。
[0化引图2.EGFRXCD3双特异性抗体分子示意图。
[0化9]图3.纯化的双抗体非变性SDS-PAGE电泳及纯度检测结果图；M;蛋白分子量标 记；1 ;M1001 ;2 ;M1003。
[0060] 图4.EGFR和CD3双抗原ELISA检测抗体双祀向能力结果图。
[0061] 图5.流式检测热挑战实验处理后双抗体对肥T116细胞的结合情况图。
[0062] 图6.流式检测热挑战实验处理后双抗体对人PBMC细胞的结合情况图。
[0063] 图7.EGFRXCD3MSB0DY与hPBMC对肥T116细胞的体外细胞毒实验结果图。
[0064] 图8.EGFRXCD3MSB0DY与hPBMC对MDA-MB-453细胞的体外细胞毒实验结果图。 [00化]图9.EGFRXCD3MSB0DY与hPBMC对肥K293细胞的体外细胞毒实验结果图。
【具体实施方式】
[0066] 实施例1 ;双特异性抗体的表达载体构建巧GFRXCD3，M1001，M1003)
[0067] 1.双特异性抗体序列设计
[0068]WEGFR和CD3为祀点的双特异性抗体被命名为EGFRXCD3MSB0DY，其中单价单元 为抗EGFR的重链轻链对，可变区氨基酸序列参考单克隆抗体化bi化X的序列（PDB数据库 序列号1YY8)和Vectibix的序列（来源为专利US6235883中的序列号38和49)，包括抗 EGFR重链与轻链，含有F油和化结构域；单链单元为抗CD3的ScFv-化形式，可变区氨基 酸参考单克隆抗体L2K的序列（参考US20070123479序列号2)，包括抗CD3VH、VL、化结构 域。其中单价单元的重链化和单链单元的化（同人IgGl的重链Fc)均进行氨基酸突变改 造，具体化改造过程参见PCT/CN2012/084982,使其各自不易形成同二聚体化omodimer)， 而易于形成异二聚体化eterodimer)，该异二聚体即为双特异性抗体EGFRXCD3MSB0DY，单 价单元来源于化bi化X的EGFRXCD3MSB0DY编号为M1001，单价单元来源于Vectibix的 EGFRXCD3MSB0DY编号为M1003。同时，为了EGFRXCD3MSB0DY能在C册细胞中表达，并能 分泌到培养基中，选择了鼠源抗体kappa链的前导肤序列作为分泌信号肤。各个结构域及 信号肤的氨基酸序列和核酸序列见如下序列号：1-12。信号肤直接连接于抗体可变区的N 玉山 綱。
[0069] 单价单元重链氨基酸序列巧rbitux，序列号1)
[0070] QV化KQSGPGLVQPSQ化SITCTVSGF化TNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTS化SI N邸NSKSQVFFKMN化QSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LV邸YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY化SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KT肌CPPCPAP化LGGPSVFLFPPKP邸TLMISRTPEVTCVVVDVS肥DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP肥EQYNS TYRVVS化 DIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVM肥ALHN肌TQK化化SPGK
[0071] 单价单元重链棱酸序列巧rbitux，序列号2)
[0072] C过ggtgc过gctg过过过C过g过gcggcccgggcctggtgc过gccg过gcc过g过gcctg过gc过tt过cctgc过CC 咨t咨a咨C咨咨cttta咨cct咨accaactat咨咨C咨t咨catt咨咨咨t咨C咨cca咨a咨CCC咨咨咨caaa咨咨cct咨咨aat咨咨ct咨咨咨 cgtg过tttgg过gcggcggc过过C过ccg过tt过t过过C过ccccgttt过CC过gccgcctg过gc过tt过过C过过过g过t过过C过gc过 过过过gcc过ggtgtttttt过过过过tg过过C过gcctgc过g过gc过过eg过t过ccgcg过ttt过tt过ttgcgcgcgcgcgctg过CC t过tt过tg过tt过tg过过tttgcgt过ttggggcc过ggge过ccctggtg过ccgtg过gcgcggcgtcg过CC过过gggccc过tc ggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactact tccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacag tcctcaggactctactCCCtcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaa cgtg过过tc过c过过gccc过gc过过c过CC过过ggtgg过c过过g过过过gttg过gccc过过过tcttgtg过c过过过过etc过c过c过tgee caccgtgcccagcacctgaactcctg gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcat g过tctcccgg过cccctg过ggtc过c过tgcgtggtggtgg过cgtg过gcc过eg过过g过ccctg过ggtc过过gttc过过ctggt 过cgtgg过cggcgtgg过ggtgc过t过过tgee过过g过c过过过geegeggg过gg过gc过gt过c过过c过gc过cgt过ccgtgtggtc 过gcgtcctc过ccgtcctgc过CC过gg过ctggctg过过tgge过过gg过gt过c过过gtgc过过ggtctcc过过c过过过gccctccc agcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtctacaccctgcccccatccc ggg过tg过gctg过CC过过g过过CC过ggtc过gcctgtggtgcctggtc过过过ggettet过tccc过geg过c过tcgccgtgg过g t咨咨咨a咨a咨caat咨咨咨ca咨CC咨咨a咨aacaactac咨ataccac咨cctccc咨t咨ct咨咨actcc咨ac咨咨ctccttcttcct ct过c过geg过tctc过ccgtgg过c过过g过gc过ggtggc过gc过gggg过过cgtcttctc过tgctccgtg过tgc过tg过ggctc tgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
[0073] 单价单元轻链氨基酸序列巧rbitux，序列号3)
[0074] DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSP化LIKYASESISGIPSRFSGSGSGT DFUSINSVE沈DIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASW化LNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNS犯SVTE孤S邸STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT册化SSPVTKSFNRGEC
[0075] 单价单元轻链核酸序列巧rbitux，序列号4)
[0076] gatattctgctgacccagagcccggtgattctgagcgtgagcccgggcgaacgcgtgagctttagctgc egegeg过gcc过g过gc过ttggc过CC过过c过ttc过ttggt过tc过gc过gege过CC过过egge过gcccgcgcctgctg过tt过过 过t过tgcg过geg过过过gc过tt过gegge过ttccg过geegettt过gegge过gegge过gegge过ccg过tttt过ccctg过gc过 tt过过C过gcgtgg过过过geg过过g过t过ttgegg过tt过tt过ttgee过gc过g过过C过过C过过ctggccg过CC过cctttggc