专利名称：一种原位联合检测miRNA的表达与细胞凋亡的方法
一种原位联合检测miRNA的表达与细胞凋亡的方法技术领域：
本发明涉及miRNA原位检测方法的改进。特别是一种原位联合检测miRNA的 表达与细胞凋亡的荧光原位杂交检测方法。背景技术：
近年来研究发现， 一类新的微RNA(microRNA或miRNA)是指长度约21 25 nt的某些特殊的小型非编码RNA,这些miRNA能够识别特定的目标 mRNA，并通过完全或者不完全互补的方式与其3'非翻译区结合，实现转录后水平 通过促进靶mRNA的降解和/或抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的作用。据推 测人类近30%的基因表达受到miRNA的精确调节。目前已经确定的miRNA有300 多种，根据miRNA数据库Sanger的推测，其总量可能超过1000个，占据人基因组 的3%。由于miRNA在生物体内广泛存在并且对其下游靶基因调控非常准确，因此， miRNA的研究已经成为了肿瘤、发育、干细胞等领域中新的热点。MiRNA平均长度只有22bp，通过常规方法检测比较困难。近年来开发的 miRNA real-time PCR和Northern blot解决了关于miRNA的扩增检测；但是miRNA 的亚细胞定位，以及miRNA和靶mRNA作用的机制等研究层次上，上述实验方法 所能够提供的信息就显得十分有限。同时部分miRNA的表达与细胞凋亡的关系十 分密切，因此原位联合检测小RNA的表达与细胞凋亡的剂盒及其检测方法需要建■、,:
发明内容本发明的目的是为了克服现有技术的不足，而提供一种原位联合检测miRNA与细 胞凋亡的检测方法，该方法无放射、无污染、使用方便。本发明为实现上述目的所采用的方案公开了一种原位联合检测小RNA的表 达与细胞凋亡方法，其特征在于所述方法包括将根据miRNA成熟体碱基序列设 计的RNA探针进行锁定核酸修饰(LNA， locked nuclear acid modification)，制 成LNA修饰的miRNA特异性探针；在特异性探针3'末端标记地高辛，得到LNA修 饰的miRNA特异性探针液；通过免疫反应放大miRNA表达信号；最后通过荧光标记的亲和素(Avidin)来实现原位检测miRNA的表达。所述miRNA原位表达检测后，通过TUNEL法检测原位细胞凋亡。从而可以同 步检测miRNA的表达与细胞凋亡。本发明的有益效果是本发明将miRNA的原位表达情况转化为可见荧光信 号；同时能够原位联合检测miRNA的表达与细胞凋亡情况；达到直观、良好的原 位检测效果，填补了miRNA原位荧光检测领域的应用空白。
图1为活细胞miRNA原位杂交结果； 图2为石蜡切片miRNA原位杂交结果； 图3为MiR-21原位杂交和TUNEL法检测细胞凋亡。 以下结合本发明的实施例参照附图进行详细叙述。
具体实施方式以下所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限 于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到 的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应 该以权利要求的保护范围为准。本发明的技术方案概述如下一、 LNA-miRNA探针的制备1. 化学合成所需要检测的miRNA反义RNA探针；2. 将上述合成的探针与绝对过量的地高辛在液相环境杂交过夜，通过层析，透析 手段除去过量的地高辛和没有参与反应的RNA探针。将所得溶液标记为杂交 探针液。二、 原位杂交反应系统的制备1. 胃蛋白酶制成10x贮存液备用，得溶液A;2. 40。/。去离子甲酰胺，10。/。硫酸葡聚糖,lxDenhardt液，4xSSC, 1 g/L tRNA， 1 g/L 热变性鲑鱼精子DNA，混合均匀溶液得溶液B;3. 山羊血清白蛋白配制成浓度为20%溶液，得到溶液C;4. 将生物素活化之后，与鼠抗地高辛结合标记，得溶液D;5. 将亲和素活化之后，与Indodicarbocyanine (Cy3)结合标记，得溶液E。 三、原位杂交所需其他试剂/缓冲液的制备1. 原位杂交用磷酸盐缓冲液(PBS):A液Na2HP04 28.4g, Na2HP04H20 31.61g, Na2HP04.2H20 35.6g， Na2HP04.7H20 53.63g, Na2HP04.12H20 71.64g,加双蒸水到1000ml;B液NaH2P04 24.0g, NaH2P04-H20 27.6g， NaH2P04'2H20 31.21g，加双蒸水 到1000ml;按照81: 19比例分别取相应容积A、 B液混合，并加入相当于混合液容积的双 蒸水，混合均匀。按照1%。浓度加入焦碳酸二乙酯(DEPC)，充分混均匀，静置 过夜备用；2. DEPC处理双蒸水双蒸水按照P/。。浓度加入焦碳酸二乙酯(DEPC)，充分混均匀，静置过夜备用；3. 固定液4%多聚甲醛(PFA)/原位杂交用PBS溶液将4g多聚甲醛粉末溶于0.1MPBS溶液中制得；4. 1%PFA/0.1 MPBS溶液 将lg多聚甲醛粉末溶于0.1MPBS溶液中制得；5. 3%柠檬酸溶液 将0.3g拧檬酸溶于10mlDEPC处理水，充分混合均匀备用；6. 0.1。/。Tritoon-100/原位杂交用PBS溶液将lmlTritoon-100加入100ml原位杂交用PBS溶液，混合均匀备用；7. SSC缓冲溶液2xSSC:取NaCl 17.53g;拧檬酸钠8.82g;加水至1000ml，用10mol/L NaOH调PH至7.0;0.5xSSC:取2xSSC溶液50ml，加DEPC处理双蒸水至200ml;0.2xSSC :取2xSSC溶液20ml，加DEPC处理双蒸水至200ml。 四、凋亡原位检测TUNEL凋亡检测试剂盒(Roche公司，瑞士)； 洗涤液0.01 MPBS ( pH7.4);封闭液3% 11202/甲醇；固定液4X多聚甲醛溶于PBS (pH7.4)，新鲜配制； 透膜液0.1% Triton X-IOO，溶于0.1%柠檬酸钠，新鲜配制； TUNEL标记液1管与2管按照1: 9混合后冰浴待用。具体检测实例h 检测试剂和建立过程一、 杂交探针的制备1. 试剂化学合成反义RNA寡聚核苷酸(上海吉玛产品)；地高辛(Sigma产品)；2. 仪器杂交炉(Bio-Rad产品);层析柱(Millipore产品)。3. 方法化学合成寡聚核苷酸探针与绝对过量的地高辛在液相环境杂交过夜，通过层 析，透析手段除去过量的地高辛和没有参与反应的RNA探针。将所得溶液标记为 杂交探针液。二、 miRNA原位杂交反应体系制备1. 试剂胃蛋白酶、去离子甲酰胺、硫酸葡聚糖、Denhardt液，山羊血清白蛋白，生 物素，亲和素，鼠抗地高辛抗体，Indodicarbocyanine (Sigma产品)；tRNA、热 变性鲑鱼精子DNA (SMDNA产品)。2. 仪器杂交炉(Bio-Rad产品)。 3.方法1) 40%去离子甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，lxDenhardt液，4xSSC， 1 g/L tRNA， 1 g/L热变性鲑鱼精子DNA，混合均匀杂交制得溶液B;2) 山羊血清白蛋白配制成浓度为20%溶液，得到溶液C;3) 将生物素活化之后，与鼠抗地高辛结合标记，得溶液D;4) 将亲和素活化之后，与Indodicarbocyanine (Cy3)结合标记，得溶液E。 三活细胞miRNA原位检测1. 常规细胞培养、爬片制备；2. 细胞的固定4n/。PFA/原位杂交用PBS溶液室温固定30min，蒸馏水充分水洗；3.30%过氧化氢1份加50份甲醇混合，室温处理30min，灭活内源性过氧化物酶， 蒸馏水充分水洗；4.3%柠檬酸稀释的浓縮型胃蛋白酶(lml 3%柠檬酸加上2滴溶液A，混匀)， 37'C或者室温孵育10min。原为杂交用PBS溶液洗3x5min， DEPC处理双蒸水 洗一次；5.37。C预热的0.P/c) Triton.X -100/原位杂交用？88溶液孵育301^11，原位杂交用 PBS充分洗涤；6. ly。PFA/原位杂交用PBS溶液室温固定10min， DEPC处理双蒸水洗涤3次；7. 每张细胞加上40^U溶液B，38'C孵育4小时，吸走多余液体，不洗；8. 每张切片加上4(HU杂交探针液，加在细胞上，38'C杂交过夜；9.37°C预热的2xSSC溶液洗涤2xl0min， 37°C预热的0.5xSSC溶液洗涤 lxl5min， 37'C预热的0.2xSSC溶液洗涤lxl5min;10. 滴加溶液C， 37'C孵育30min，甩去多余液体，不洗；11. 滴加溶液D, 37'C孵宵60min，原位杂交用PBS洗涤4x5min;12. 滴加溶液E， 37'C避光孵育2小时，原位杂交用PBS充分洗涤；13. Hochest33258溶液复染细胞核，原位杂交用PBS充分洗涤；14. 抗淬灭剂封片，准备镜检；15. FV-1000激光共聚焦显微镜观察。检测结果图片见附图l所示。图片说明Cy3阳性杂交荧光信号弥散地分布于 U251细胞胞核，直观表示了小RNA在细胞爬片上的亚细胞定位情况。四、凋亡原位检测TUNEL凋亡检测试剂盒(Roche公司，瑞士)洗涤液0.01 MPBS ( pH7.4)。封闭液3% H202/甲醇。固定液4X多聚甲醛溶于PBS (pH7.4),新鲜配制。 透膜液0.1% TritonX-100,溶于0.1%柠檬酸钠，新鲜配制。 TUNEL标记液1管与2管按照1: 9混合后冰浴待用。 凋亡原位检测方法为，接上述步骤三、活细胞miRNA原位检测歩骤12: 玻片在0.01MPBS (pH7.4)缓冲液中浸浴5分钟x2次； 加标记液20-25pl，湿盒内37'C孵育60分钟后4'C过夜； PBS (pH7.4)轻摇洗5分钟x3次，室温；Hochest33258溶液复染细胞核，原位杂交用PBS充分洗涤；抗淬灭剂封片； FV-1000激光共聚焦扫描显微镜观察。具体检测实例2一、石蜡切片miRNA原位检测1. 多聚赖氨酸处理载玻片；2. 常规石蜡切片制备；6-8^1;3. 石蜡切片常规脱蜡至水；4. 30%过氧化氢1份加10份蒸馏水混合，室温处理10min，灭活内源性过氧化物 酶；5. 暴露探针特异性结合miRNA的片段3%柠檬酸稀释的浓縮型胃蛋白酶(lml 3%柠檬酸加上2滴溶液A，混匀)，37T:或者室温孵育3 30min。原为杂交 用PBS洗3x5min， DEPC处理双蒸水洗一次；6. 37'C预热的0.1。/。 Triton X-100/原位杂交用PBS溶液孵育30min，原位杂交用 PBS充分洗涤；7. 1。/。PFA/原位杂交用PBS溶液室温固定10min, DEPC处理双蒸水洗涤3次；8. 预杂交每张切片加上4(Hil溶液B，加在切片上，42"C孵育4小时，吸走多 余液体，不洗；9. 每张切片加上40pl杂交探针液，加在切片上，42。C杂交过夜；10. 37。C预热的2xSSC溶液洗涤2x5min， 37。C预热的0.5xSSC溶液洗涤lxl5min， 37X:预热的0.2xSSC溶液洗涤lxl5min;11. 滴加溶液C， 37。C封闭30min，甩去多余液体，不洗；12. 滴加溶液D， 37'C封闭60min，原位杂交用PBS洗涤4x5min;13. 滴加溶液E， 37t避光孵育2小时，原位杂交用PBS充分洗涤；14. Hochest33258溶液复染细胞核，原位杂交用PBS充分洗涤；15. 抗淬灭剂封片，准备镜检；16. FV-1000激光共聚焦显微镜观察。检测结果图片见附图2。图片说明Cy3阳性杂交荧光信号弥散地分布于肿瘤细 胞胞浆。二、凋亡原位检测接上述歩骤一、石蜡切片miRNA原位检测歩骤13后 玻片在0.01MPBS (pH7.4)缓冲液中浸浴5分钟x2次； 加标记液25pl，湿盒内37'C孵育60分钟后4'C过夜， M PBS (pH7.4)轻摇洗5分钟x3次，室温；Hochest33258溶液复染细胞核，原位杂交用PBS充分洗涤；抗淬灭剂封片； FV-1000激光共聚焦扫描显微镜观察。检测结果图片见附图3。图片说明小RNA的表达与细胞凋亡有直接的关系，二 者的阳性信号在石蜡切片上具有明显差异性的亚细胞定位表现。
权利要求
1、一种原位联合检测miRNA的表达的方法，其特征在于所述方法包括将根据miRNA成熟体碱基序列设计的RNA探针进行锁定核酸(LNA)修饰，制成LNA修饰的miRNA特异性探针；在特异性探针3’末端标记地高辛，得到LNA修饰的miRNA特异性探针液；通过免疫反应放大miRNA表达信号；最后通过荧光标记的亲和素实现原位检测miRNA的表达。
2、 根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述miRNA原位表达检测后，通 过TUNEL法检测原位细胞凋亡。
3、 根据权利要求l所述的方法，其特征在于包括如下主要组分LNA修饰 miRNA特异性探针液，生物素化鼠抗地高辛与亲和素-荧光标记系统LNA修饰的 miRNA特异性探针液由化学合成miRNA反义RNA寡核苷酸，纯化后作为探针；所 述合成的探针再与过量的地高辛在液相环境杂交过夜，通过层析，透析手段除i^ 过量的地高辛和没有参与反应的RNA探针，所得溶液标记为杂交探针液。
4、 根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述方法的miRNA原位杂交反应 体系为a) 胃蛋白酶制成10x贮存液，得溶液A;b) 40。/。去离子甲酰胺，10。/o硫酸葡聚糖，lxDenhardt液，4xSSC, 1 g/L tRNA， 1 g/L热变性鲑鱼精子DNA，混合均匀溶液得溶液B:c) 山羊血清白蛋白配制成浓度为20%溶液，得到溶液C;d) 将生物素活化之后，与鼠抗地高辛结合标记，得溶液D;e) 将亲和素活化之后，与Indodicarbocyanine (Cy3)结合标记，得溶液E。
全文摘要
本发明公开了一种原位联合检测小RNA(miRNA)的表达与细胞凋亡的荧光原位杂交检测方法。该方法包括LNA修饰miRNA特异性探针的合成、对探针标记地高辛、纯化、生物素化鼠抗地高辛与亲和素-荧光标记系统的构造等基本步骤。可同时原位联合检测小RNA的表达与细胞凋亡。本发明的检测方法将miRNA的表达情况转化为可见荧光信号，达到良好的原位检测效果，填补了miRNA原位荧光检测领域的应用空白。
文档编号C12Q1/68GK101240345SQ200810052368
公开日2008年8月13日 申请日期2008年3月4日 优先权日2008年3月4日 公开号200810052368.发明者旋 周, 康春生, 浦佩玉 申请人:天津医科大学总医院