专利名称：一种人生长素融合蛋白TAT-hGH及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种人生长素TAT-hGH重组融合蛋白，更具体涉及含有人生长素基因的基因工程菌株E. coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)，本发明还涉及所述TAT-hGH重组融合蛋白的制备方法以及该融合蛋白TAT-hGH在促细胞增殖、促动物生长和穿肠中的应用。
背景技术：
人生长素(human growth hormo ne, hGH)是一种由人的脑垂体前叶合成并分泌的蛋白类激素。生长激素先翻译成激素原，即生长激素前提蛋白，生长激素前体蛋白含有217个氨基酸，氨基端f 26个氨基酸为信号肽，若信号肽的不能特异性切除，则该激素无法产生活性。成熟的人生长激素是单一无糖基化多肽链，由191个氨基酸组成，N端和C端均为苯丙氨酸，分子量在 22kDa 左右(ChohHaoLi (1982) Human Growth Hormone 1979一1981.Molecular and CellularBiochemistry,46 :31-41 )。含两个二硫键，由这些半胱氨酸残基形成的二硫键对生长激素生物活性的稳定维持着极其重要的作用。生长素通过介质，间接促进生长期的骨骺软骨形成，促进骨及软骨的生长，从而使躯体增高。生长激素对中间代谢及能量代谢也有影响，可促进蛋白质合成，增强对钠、钾、钙、磷、硫等重要元素的摄取与利用，同时通过抑制糖的消耗，加速脂肪分解，使能量来源由糖代谢转向脂肪代谢。目前在临床上，已被广泛地用于儿童生长激素缺乏症、成人生长激素缺乏症、大面积烧伤、短肠综合症、肠外瘘、急性坏死性胰腺炎、重症感染、扩张性心肌病、呼吸功能衰竭、重症乙肝(肝硬化)、肾衰等治疗领域，在减肥、美容等领域也在迅速增长。值得一提的是现在科学发现hGH减少才会出现人体的衰老。在人的青春期，hGH的分泌量逐步上升，直到青春期后期，达到高峰，之后逐渐下降，60岁以上的老年人，他的hGH的分泌量不到青春期最高峰值的1/6，分泌水平已经不到青春期的一半，从此以后人体开始显露衰老迹象。1996年，美国FDA批准HGH为唯一的抗衰老激素治疗药物。hGH能起作用，绝大部分情况下都是通过胰岛素样生长因子(InsiUinGrowthFactor, IGF)介导。人体有很多组织都能合成并分泌IGF，IGF是一种受hGH调节的单链多肽，包括IGF1、IGF II等，hGH的大多数效应都是由IGF I介导，而血液中的IGF I主要来源于肝(DauhGHaday ff. H., Rotwein P. (1989) Insulin-like growth factors Iand I1:Peptide，messenger ribonucleic acid and genestructures，serum，and tissueconcentrations. Endocrine Review,10:68—91)。在1920年，科学家就发现了 hGH的存在，最初的来源是提取于动物的垂体，但是临床试验发现，在人体中，这种GH是没有活性的。1956年，科学家李和PapkofT首次从人的垂体中提取出hGH，1958年，美国内分泌学家M. Rabem首次将hGH注射到一个缺乏hGH的小孩体内，治愈了第一例侏儒症，使hGH真正开始了在临床上的应用。但是从人体中提取的hGH，不仅受到资源限制，同时成本过高，还存在的病毒污染，美国食品和药物管理局下令停止生产和销售这种从人脑中提取的天然的hGH。而如今hGH大多采用基因工程的方法生产。基因工程方法的生产也可分成两类一类是在原核生物中生产，另一类是在真核细胞中生产。在1979年，Gooddel等就已将化学合成的hGH DNA转录入大肠杆菌表达载体的Iac启动子末端，再将这个质粒转化大肠杆菌，经过发酵，从表达产物中纯化得到Met—rhGH。这是第二代生长激素，也是rhGH的第一代产品。虽然这种hGH的治疗效果与天然的hGH无异，但是由于它比天然的hGH N端多一个Met残基的，使用后，50%-80%的病人会产生抗体，所以N端不带Met的rhGH的出现就备受期待。直到1985年，191个氨基酸的rhGH终于出现，Gray和他的同事在将rhGH基因连接到大肠杆菌碱性磷酸酶的信号肽序列之后，使rhGH分泌到大肠杆菌的周质空间，但是产量很低。此时rhGH的发展，进入了第二代，产量成了 rhGH生产研究上的追求。1986年Becker和Hsiun将ompA作为引导序列，rhGH产量可达10—15 u g/mL, 1987年，Chang等人利用STII作为引导序列，在phoA启动子下，表达的rhGH产量达到了 15 20 yg/mL，产量得到进一步提高，目的基因的表达占了菌体总蛋白的6% 10%，其定位在细胞周质中，且超过90%在菌体中表达的rhGH被正确的引导和加工。同年，Kato等将hGH基因和细菌的kill gene相联，hGH的分泌表达量达到20. 5mg/L，其中可
以直接分泌到培养基中的rhGH达11. 2mg/L，而滞留在周质空间的约有8. 6mg/L。1989年，HsillIlg等利用细菌素释放蛋白的表达和外膜蛋白omp的信号肽，进一步提高了 hGH的表达水平，使其分泌至大肠杆菌培养基中的表达水平提高69. 6 u g/mL。除使用大肠肝菌表达系统之外,在原核表达这方面,枯草杆菌表达系统也是一大热门，比较为大家熟知的是美国的Gencncor和Genentech公司，他们通过详细的比较几种启动子、核糖体结合位点序列、转录终止子和宿主菌株，优化组合，最终rhGH表达量可以达到1. 5g/L。原核表达系统之外，越来越多的研究集中于真核表达系统，真核表达系统中使用最多的是酵母表达系统，土耳其的Plnar Callk研究了 PH对毕式酵母表达rhGH的影响，发现在PH为5.0时，产量达到最高值0. 27g/L。除此之外，Johanna利用中国仓鼠卵巢细胞表达系统表达了 rhGH,经过纯化获得了 35. 8iig/ml的蛋白，K. Kadonookuda等人利用杆状病毒作为表达载体，转入家蚕幼虫，使rhGH的表达量达到每毫升的家蚕幼虫血淋巴中有160 y g蛋白。Lipiiiski D等开发了一种转基因兔的生产系统，即利用家兔作为最终生产系的乳腺反应器。原理是将hGH基因以及鼠的乳腺表达启动子相连后，转入兔的受精卵细胞，人工受精，获得Fl代雌兔，至其哺乳期，从其乳汁中可以纯化出hGH。但是真核表达通常要求技术高、而且表达周期长，产量较原核表达低，而且由于hGH没有糖链，用原核表达也不会存在由于翻译后无修饰造成对生物活性的影响，因此市场中的大部分rhGH原核表达系统为主,而且以大肠杆菌系统表达占多数。近年来发现有一些小分子的多肽可以介导外源物质穿过细胞膜，这种小分子多肽被称之为细胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPP)。许多CPP都是来源于某些直接与宿主细胞相互作用的病毒结构蛋白的蛋白转导结构域(proteintransductiondomains，PTD)。现在研究最多、应用范围最广的细胞穿膜肽来源于人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)的转录激活因子(Trans-activating transcriptionalactivator, Tat)。Tat 蛋白中存在3个功能结构域，分别是位于N-端的酸性区，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之间的DNA结合区，该区域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之间的碱性区，是主要的蛋白转导结构域，参与Tat蛋白的细胞内化作用。Tat蛋白共有86个氨基酸，是HIV复制所必需的调节因子。Schwarze发现位于Tat蛋白中第47_57位之间的11个氨基酸YGRKKRRQRRR不仅能够独立穿过细胞膜，而且其穿膜效率比全长的Tat蛋白还要高。这段多肽即是TAT穿膜肽。不管是单独的TAT穿膜肽，或者是携带其他大分子物质如蛋白质、寡聚核苷酸或脂质体等，在穿膜时都可以表现出较高的穿膜活性。在携带外源物质穿膜时，TAT介导的穿膜似乎与其要携带的分子大小无关，100KD的蛋白质、40nm大小的纳米颗粒、甚至200nm大小的脂质体都可以经TAT运载入细胞内。而且，以这种方式运输到细胞内的脂质体甚至可以在进入细胞内Ih后仍然可保持结构的完整性。相反的，没有与TAT穿膜肽连接的物质在与细胞共同孵育时均不能够进入细胞 内。TAT穿膜肽的序列中由于有6个精氨酸和2个赖氨酸残基，因此是带有高度正电荷的多肽。以不带电荷的丙氨酸替代其中的任何一个碱性氨基酸残基都会使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸残基时穿膜活性则不会发生改变。这说明TAT穿膜肽所带的正电荷是其穿膜功能所必需的，因此推测这些正电荷很可能是能够与真核细胞的细胞膜发生强的静电作用，从而介导了穿膜过程。对TAT穿膜肽的亲和性分析发现，它能够与许多细胞膜表面的阴离子通过静电作用强烈地结合，与之结合的细胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。精氨酸丰富的多肽可以穿过细胞膜，而其他氨基酸如赖氨酸、组氨酸等丰富的多肽却不具有此功能。然而，由精氨酸组成的支链聚合物与直链聚合物具有同样的穿膜效率。此外，研究发现TAT穿膜肽不会因为手性结构的改变而影响其穿膜活性，其手性分子与自然结构具有相同的穿膜活性。这说明这种细胞穿膜肽很可能不依赖于特定的结合位点。然而，多肽的长度是影响穿膜效率的重要因素。穿膜效率与精氨酸的个数有关，含有6个或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5个精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小于15个氨基酸时，穿膜效率会随着多肽大小的增加而增强。大于15个氨基酸的多肽虽然也可具有穿膜活性，但其效率却会明显减小。尽管对于TAT穿膜肽的穿膜功能研究的比较多，但是到目前为止，关于TAT穿膜肽进入细胞的分子机制还没有完全研究清楚。早期研究认为是通过直接转运机制穿过细胞膜，且是不依赖于能量的，但最近的研究也有与这一观点不同的结果。尽管其进入细胞的机制还没有完全研究透彻，但TAT穿膜肽的应用已经十分广泛。hGH作为可以刺激增长的蛋白质激素，现如今已被大量应用于临床上，治疗生长激素缺乏症、大面积烧伤、短肠综合症等疾病，同时伴随着1990年7月5日美国威斯康辛医学院的Daniel Rudman在《新英格兰医学杂志》上发表了他那一篇震惊医学界的论文——Effects of human growth hormone in men over60 years old,人生长激素在抗衰老方面的作用逐渐被人们关注，人生长激素的市场需求已经变的越来越大，但是无论是其在临床上的治疗，还是抗衰老的应用，都因只能通过注射给药，方法繁琐，导致病人的治疗极其不便，而且其抗衰老方面的使用也很难普及。将hGH基因和TAT蛋白转导域序列进行融合，可以使人生长素能够通过口服给药方式进行治疗，这是一种实际可行的新思路。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种TAT-hGH融合蛋白，其氨基酸序列为SEQID NO. 2所示。该融合蛋白可以促进Jurakat细胞增殖，作用Hep3B细胞后影响其IGFmRNA转录水平，同时还可以穿过肠细胞膜而进入血液中，使hGH可以不经注射而直接进入血液中，通过血液在人体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了 hGH的利用效率，同时也提高了药效。本发明的目的是在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌E. coli Origami B(DE3)pLysS (pET-TAT-hGH)，该菌株的保藏号为CCTCC No. M2012348,该菌株能表达TAT-hGH的
融合蛋白。本发明的另一个目的是在于提供了一种融合蛋白TAT-hGH的制备方法，该方法可应用于大规模的工业生产中，表达量大，操作简单，成本低。本发明的再一个目的是在于提供一种融合蛋白TAT-hGH具有穿肠功能，在穿肠中的应用。本发明的还有一个目的是在于提供了一种融合蛋白TAT-hGH在促动物生长中的 应用。为了达到上述的目的，本发明采用以下技术方案重组人生长素与穿膜肽融合蛋白TAT-hGH，其为SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白。本发明还进一步包括编码上述蛋白的基因，优选其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。本发明还包括含有上述基因的载体，以及含有所述基因或所述载体的基因工程菌。本发明优选的一种表达重组人生长素与穿膜肽融合蛋白TAT-hGH的基因工程菌株，该菌株为 E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT_hGH)，已于 2012 年 9 月 14 日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址武汉市武昌珞珈山邮编430072)，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia, coli) Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH),保藏号为CCTCCNo. M2012348。其能够在常规的大肠杆菌培养基中生长，并具有氨苄抗性、卡纳抗性、四环素抗性，经过IPTG诱导后能大量表达TAT-hGH蛋白。本发明还提供一种表达所述融合蛋白TAT-hGH的基因工程菌株的构建方法，它包括下列步骤A.人生长素基因的制备合成人生长素基因，将人生长素基因克隆到PMD18-T载体中，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含hGH基因的大肠杆菌，用于基因的扩增和保藏。B.融合基因的制备通过重叠延伸PCR的方法将TAT 33bp碱基连入hGH的5’端构成TAT-hGH，将PCR产物组插入pMD18-T载体，转化E. coli JM109,挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含TAT-hGH的大肠杆菌E. coli JM109(pMD-TAT-hGH)，用于基因的扩增和保藏。C.表达载体的构建首先双酶切重组质粒pMD-TAT-hGH和质粒pET_22b ( + )，胶回收含TAT-hGH基因的片段和开环pET-22b ( + )片段，16°C连接后转化到感受态E. coliJM109中，所得到的阳性克隆子为包含TAT-hGH的E. coli JM109 (pET-TAT-hGH)。D.基因工程菌的构建和鉴定将质粒pET-TAT-hGH转化感受态E. coliOrigamiB(DE3)pLysS, PCR鉴定筛选出阳性转化子，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，阳性克隆为表达TAT-hGH的大肠杆菌基因工程菌株E. coli OrigamiB (DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)。。
本发明还进一步提供所述重组人生长素与穿膜肽融合蛋白TAT-hGH的制备方法，该方法包括以下步骤培养所述的基因工程菌，在能表达所述融合蛋白的条件，其中所述条件包括诱导或非诱导条件下，表达所述的融合蛋白TAT-hGH，然后分离、纯化该融合蛋白TAT-hGH。具体地，该方法包括如下步骤A.挑取所述的基因工程菌 E. coli Origami B (DE3)pLysS (pET-TAT-hGH)的单菌落，接种于5ml选择性LB液体培养基中，370C，250rpm/min振摇培养过夜；B.次日将培养过夜的菌液200iU再接种于20ml 2YT液体培养基中，37 °C，250rpm/min振摇培养至光密度OD 600=0 . 6时，加入IPTG于菌液中，使IPTG终浓度为ImM，37°C，250rpm/min振摇培养4小时；
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C.采用柱亲和层析法纯化获得融合蛋白TAT-hGH。本发明利用大肠杆菌表达TAT跨膜域和hGH的融合蛋白，意在利用hGH进行疾病治疗以及美容驻颜。通过基因工程生产的TAT-hGH融合蛋白可以仍然保持hGH的活性，仍然可以促进Jurkat细胞进行增殖。本发明另一个创新之处在于，将TAT穿膜肽和hGH融合表达，由于TAT穿膜肽可以携带外源蛋白穿过细胞膜，因此将TAT-hGH 口服后，该融合蛋白可以穿过肠细胞膜而进入血液中，使hGH可以不经注射而直接进入血液中，通过血液在人体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了 hGH的利用效率，同时也提高了药效。TAT穿膜肽目前还没有直接应用于工业生产，但其独特的穿膜效率十分具有吸引力。而且本发明公开的基因工程菌株的构建方法可以应用于大规模的工业生产中，表达量大，操作简单，成本低。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果(I)本发明制备TAT-hGH融合蛋白可以穿过肠细胞膜而进入血液中，使GH可以不经注射而直接进入血液中，通过血液在人体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了 hGH的利用效率，同时也提高了药效。(2) 口服人生长素可以取代注射人生长素，减少病人的痛苦。(3)本发明提供的融合蛋白TAT-hGH的制备方法，该方法可应用于大规模的工业生产中，表达量大，操作简单，成本低。
图1为重组表达质粒pET-TAT-hGH的构建过程图。图2为重组表达质粒pET-TAT-hGH酶切及PCR鉴定图。泳道1:D15000DNA Maker ;泳道 2 Xho I 单酶切产物；泳道 3 Xho I 及 Nde I 双酶切产物；泳道4 hGH PCR产物；泳道5 TAT-hGH PCR产物；泳道6 =DNAMaker III。图3SDS-PAGE检测TAT-hGH表达的图谱。泳道1:蛋白 Marker ;泳道 2 :加入 IPTG 诱导的 E. coli OrigamiB(DE3)/pET-22b (+)菌液；泳道 3 :加入 IPTG 诱导的 E. coli Origami B (DE3) pLysS (pET-TAT-hGH)菌液；泳道4 :加入IPTG诱导的E. coli OrigamiB (DE3) /pET-22b (+)上清；泳道5 :加入IPTG 诱导的 E. coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)菌液上清；泳道 6 :加入 IPTG诱导的 E. coli OrigamiB(DE3)/pET-22b (+)菌液沉淀；泳道 7 :加入 IPTG 诱导的 E. coliOrigami B (DE3) pLysS (pET-TAT-hGH)菌液沉淀。图4为SDS-PAGE检测TAT-hGH纯化图谱。泳道1:蛋白 Marker ;泳道 2 :加入 IPTG 诱导的 E. coli Origami B(DE3)pLysS (pET-TAT-hGH)菌液上清；泳道3 :纯化的TAT-hGH蛋白。图5-1为30min时融合蛋白TAT_hGH_GFP和hGH_GFP穿膜结果图谱。(a)蓝光下hGH-GFP作用30min肠组织切片；(b)可见光下hGH_GFP作用30min肠组织切片；(c)蓝光下TAT-hGH-GFP作用30min肠组织切片；(d)可见光下TAT_hGH_GFP作用30min肠组织切片。图5-2为60min时融合蛋白TAT_hGH_GFP和hGH-GFP穿膜结果图谱。 (a)蓝光下hGH-GFP作用30min肠组织切片；(b)可见光下hGH-GFP作用30min肠组织切片；(c)蓝光下TAT-hGH-GFP作用30min肠组织切片；(d)可见光下TAT-hGH-GFP作用30min肠组织切片。图5-3为120min时融合蛋白TAT-hGH-GFP和hGH-GFP穿膜结果图谱。(a)蓝光下hGH-GFP作用30min肠组织切片；(b)可见光下hGH-GFP作用30min肠组织切片；(c)蓝光下TAT-hGH-GFP作用30min肠组织切片；(d)可见光下TAT-hGH-GFP作用30min肠组织切片。图6-1为终浓度500ng/ml TAT-hGH对Ifep3B细胞中IGF I转录水平影响图谱。图6-2为终浓度5ng/ml TAT-hGH对H印3B细胞中IGF I转录水平影响示意图谱。
具体实施例方式本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。实施例1重组质粒pMD-TAT-hGH的构建和鉴定1. PCR根据hGH的序列(GenBank:V00520.1)以及TAT PTD中11个氨基酸的碱基序列设计引物，引物设计如下上游引物1:5'-AAACGTCGTCAGCGTCGTCGITTCCCAACCAITCCC-3'上游引物2 5' -GAATCCCATATGTATGGCCGTAAGAA-3' (划线处为 Nde I 酶切位点)下游引物1:5' -TTACTCGAGGAAGCCACAGCTGCCCT-3' (划线处为 XhoI 酶切位点)以上引物由英俊公司合成。分3次PCR合成TAT-hGH 以pMD18T_hGH质粒(Generay公司合成)为模板，上游引物I，下游引物I，退火温度55°C，做PCR扩增目的片段hGH，电泳并作回收；以上一步回收产物为模板，上游引物2，下游引物1，退火温度51°C做PCR，电泳并作回收，即得到TAT-hGH基因片段。50 U I体系采用如下条件进行PCR反应
权利要求
1.一种人生长素与穿膜肽的融合蛋白TAT-hGH，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.一种分离的DNA分子，其特征在于该DNA分子编码权利要求1所述的融合蛋白TAT-hGH。
3.根据权利要求2所述的所述的DNA分子，其特征在于所述的DNA分子的核酸序列如 SEQ ID No.1 所示。
4.一种载体，其特征在于包含权利要求2或3所述的DNA分子。
5.—种宿主细胞，其特征在于包含权利要求4所述的载体。
6.重组基因工程菌株万·Origami B (DE3) pLysS (pET-TAT-hGH)，该菌株的保藏号为CCTCC No. M2012348。
7.—种产生权利要求1所述的融合蛋白TAT-hGH的方法，其特征在于该方法包括以下步骤培养权利要求5所述的宿主细胞或权利要求6所述的基因工程菌，在能表达所述融合蛋白的条件，其中所述条件包括诱导或非诱导条件下，表达所述的融合蛋白TAT-hGH，然后分离、纯化该融合蛋白TAT-hGH。
8.权利要求1所述融合蛋白TAT-hGH在促细胞增殖中的应用。
9.权利要求1所述融合蛋白TAT-hGH在促动物生长中的应用。
10.权利要求1所述融合蛋白TAT-hGH在穿肠中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种人生长素与穿膜肽TAT的融合蛋白TAT-hGH及其制备方法和应用，编码该融合蛋白TAT-hGH的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该融合蛋白TAT-hGH的方法。融合蛋白TAT-hGH具有促Jurkat细胞增殖活性，以及影响下游因子IGFⅠ转录水平的功能。同时，融合蛋白TAT-hGH具有穿肠功能。本发明融合蛋白TAT-hGH可以口服，通过穿过肠细胞膜而进入血液中，通过血液循环到达不同的组织，增加了hGH的利用效率，同时也提高了药效。此外本发明制备方法可应用于大规模的工业生产中，表达量大，操作简单，成本低。
文档编号C12P21/02GK102993309SQ20121039848
公开日2013年3月27日 申请日期2012年10月18日 优先权日2012年10月18日
发明者徐进平, 孟小林, 王健, 倪雅雯 申请人:武汉大学