专利名称：导入ganp基因的转基因哺乳动物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及导入GANP基因的转基因哺乳动物及其应用。本发明 更详细地涉及可以高表达GANP，并且产生高亲和性抗体的转基因哺 乳动物，利用该转基因哺乳动物产生高亲和性抗体的方法以及所得高 亲和性抗体的利用。
技术背景免疫系统的功能可以分为基于以T细胞作用为主的细胞性免疫反 应功能和基于以抗体作用为主的体液免疫功能。实际上一般是通过这 两种功能的协调来进行免疫应答。抗体是作为在骨髓中产生的B细胞 细胞表面受体而呈现出来的。据说在生物体中形成的最初抗体识别的 抗原多样性可达到109~ IO"个序列(order),这样的抗体(抗原受体) 可以识别能够在环境中存在的所有抗原确定簇。但是该多种抗原受体 相对于抗原的结合能力一般都低，多数情况下产生低亲和性抗体，这 样就不能形成足够的免疫应答。淋巴细胞，特别是B细胞/免疫球蛋白(抗体)，根据其免疫反应， 具有各种用途，例如作为为检测病原体等抗原的试剂盒、诊断药剂和 治疗药剂使用。作为这样的抗原检测药剂，或者是各种疾病的治疗药 剂中的抗体，如果使用对抗原反应性高的抗体，则对于抗原的敏感度 优异，并且作为治疗药剂时，相同施用量的治疗性能优异。但是迄今 为止尚不了解提高抗体亲合性的方法。不过对于生物体，在有病原体或异物侵入时，则可以把它们作为 抗原进行识别，在末稍淋巴组织中，针对与抗原直接结合的抗体V区 域的基因诱导高频率体细胞超突变。 一般认为在该变化中，把T细胞 刺激作为必要条件，在发生中心(Germinal center)区域，接受来自 活化T细胞的刺激。近年来本发明者在该区域的活化B细胞上发现了 有选择性提高表达的分子GANP (国际公开WO00/50611号公报)。 该分子与具有DNA解旋酶活性的、被称之为MCM (微染色体维持 蛋白)的分子直接结合，还具有RNA引物酶活性，由此可见与DNA 的复制相关。但是，还没有弄清楚免疫体系中的GANP的功能。发明公开本发明的目的在于提供作为各种疾病的诊断和治疗药刑有效的高 亲合性抗体，产生该抗体的转基因哺乳动物，使用该高亲和性抗体或 髙亲和性抗体产生细胞的药刑.为了解决上述课題，本发明者进行了锐意研究，结果发现如果制备导入GANP基因的转基因动物，用抗原进行免疫，该转基因动物就 能够产生高亲和性抗体，从而完成了本发明， 也就是本发明的内容如下(1) 导入GANP基因的转基因哺乳动物或其子代.导入的GANP基因可以由B细胞表达.同时本发明的转基因哺乳 动物或其子代，可以由转染了 GANP基因的ES细胞生成，作为哺乳 动物，可以列举如小鼠.(2) 前述转基因哺乳动物或其子代的一部分.(3) 高亲和性抗体的制备方法，其特征是对前述转基因哺乳动物 或其子代施用抗原，从所得的动物或其子代采集抗体.(4) 通过前述(3)中所述方法得到的高亲和性抗体或其片段. 本发明的抗体是亲和性可表示为lxlO'7 (M)或以下的抗体.本发明的抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体.(5) 含有前迷抗体或其片段V区域的人源化抗体或人抗体或其片段，(6) 医药纽合物，其中含有从由前述抗体或其片段，以及前述人 源抗体或人抗体或它们的片段构成的組中选择的至少1种抗体或片 段.(7 )产生高亲合性抗体的细胞，它是从施用了抗原的权利要求1 ~ 4任意一项中所述的转基因哺乳动物或其子代中采集的， 附闺的简单说明困1表示使用抗GANP单克隆抗体和ALP结合抗大鼠Ig抗体进 行免疫組织化学分析的结果，标尺为lOOjim.围2表示在雌NZB小鼠的膝窝淋巴结中GANPM细胞的出现速 度。标尺为100困3表示在雌NZB小鼠脾脏中GANphi细胞的出现速度.标尺为 100 p迈，困4表示用抗GANP单克隆抗体对来源于多系统小鼠的脾脏切片 进行染色的结果.RP;红脾號，F;滤泡.标尺为100pm,困5表示对脾脏红脾殖中的GANPM细胞进行鉴定的结果.困6表示对GANPW细胞中的浆细胞标记物进行鉴定的结果.标 尺为100 nm,困7表示在通过TD-Ag免疫得到的C57BL/6小鼠脾脏红脾貌区 域中GANPhi细胞的表达.标尺为100nm.困8的A ~ C表示Daudi细胞中使小鼠GANP穗定表达的转染子 的体细胞超突变.困9的A ~ C表示制备使GANP在B细胞上过表达的转基因小鼠 的概况.困10表示对GANP过表达的转基罔(Tg)小鼠或野生型小鼠中 体细胞超突变进行分析的结果.困11的A~E表示制备B细胞特异的GANP缺失小鼠(B-GANP-"的概况.困12表示对使用B细胞特异的GANP缺失小鼠(B-GANF"的 细胞进行表面染色的结果(流式细胞测量法).困13表示对B细胞增殖进行测定的结果.几乎没有差别，但是 只有因抗CD40抗体刺激而引起的增殖大约减少至1/2,闺14表示没有进行免疫的Cre"floxZ+小鼠以及B-GANP一小鼠血 清中的抗体价数.各种同种型抗体价数没有差别，困15表示对B-GANP^小鼠中产生的抗体进行測定的结果.困16表示用花生凝集素对GC进行染色的结果.困17表示对B-GANP-、卜鼠中产生的抗原特异性抗体进行测定的 结果.困18表示对用lOO^ig的NP-GC进行免疫，在免疫后第14天以 及笫36天，通过差示ELISA对亲合性的成熟度进行测定的结果.困19表示对GC-B细胞进行流式细胞测量的结果.围20的A~F表示用PCR对Cre-flox/+的VH186.2进行扩增， 并进行序列分析的结果(从A到F按顺序连续进行).困20的G - L表示用PCR对Cre-flox/ +的VH186.2进行扩增， 并进行序列分析的结果(从G到L按顺序连续进行).困21表示在Cre-flox/+以及B-GANP一小鼠中的IgGl的变异频率.困22表示使VH186.2笫33位的W变异成L时的变异频率.困23表示对活化诱导细胞死亡(AICD)进行测定的结果以及对 细胞调亡进行抑制的结果.闺24表示相对于抗CD40以及抗CD95刺激的细胞凋亡感受性测 定结果.闺25表示通过TUNEL測定对细胞凋亡细胞进行;^r测的结果.困26表示通过TUNEL测定对细胞凋亡细胞进行检测的结果.困27表示与抑制细胞凋亡相关的Bcl-2家族的RNA表达水平.图28表示使用GANP转基因小鼠产生髙亲和性抗体的结果.闺29表示使用来源于GANP转基因小鼠的杂交瘤克隆产生髙亲 合性抗体的结果.闺30表示通过使用来源于GANP转基因小鼠的杂交瘤克隆培养 上清通过Biacore测定的结合解离曲线.困31表示通过使用来源于GANP转基因小鼠的杂交瘤克隆培养 上清通过Biacore测定的结合解离曲线.图32表示GANP-GST融合蛋白质结构的概况.困33表示为确定与MCM直接结合的GANP区域，进行引入测 定(Pull-down assay)的结果.左边表示大小的标准位置，困34表示使用经体外翻译的MCM进行引入测定的结果.困35示出用免疫沉淀对GANP各构建体与MCM结合进行分析 情况.图36A ~ B示出用免疫沉淀对GANP各构建体与MCM结合进行 分析的情况.困37表示GANP构建体结构的概况以及构建体在细胞内的分布. 困38表示GANP构建体在细胞内的分部. 困39表示MCM3在核中的定位.困40表示通过GANP表达诱导的MCM3的细胞质定位闺41表示在核中定位的对照蛋白质，图42表示GANP构建体在MCM3变异体定位中的效果.困43表示通过异核体測定检测的MCM3在核-细胞质之间的穿梭情况.困44表示GANP在细胞周期间的定位.实施本发明的最佳方案 以下详细说明本发明的情况.本发明是根据把GANP基因导入到非人哺乳动物中，制备转基因 动物，如果用抗原对这样的转基因动物进行免疫，就可以得到高亲合 性抗体的观点而完成的， 1. GANPGANP被称作发生中心相关核蛋白质(Germinal center-associated nuclear protein),是与酵母Sac3蛋白质同源的210kDa的核蛋白质 (WOOO/50611号公报).SAC3是针对肌动蛋白形成的抑制物质.同 时GANP在被滤胞树状细胞包围的发生中心(germinal center, GC) B细胞中被选择性地进行上调，具有依赖于裤酸化作用的RNA-引物 酶活性，并参与B细胞细胞周期调节(Kuwahara，K,等，,(2000) Blood 95， 2321 - 2328),本发明中，将小鼠的GANP蛋白质的氨基酸序列显示于序列编号 2中；人的GANP蛋白质的^基酸序列显示于序列编号4中.将小鼠 GANP蛋白质编码基因(称为GANP基因)的碱基序列显示于序列编 号l中；人GANP蛋白质编码基因显示于序列编号3中，关于上述氨 基酸序列和碱基序列，在国际公开WOOO/50611号公报中也有介绍，GANP蛋白质可以是变异体，也可以是序列编号2或4中所介绍 氨基酸序列中的1个或多个氡基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列， 并具有RNA引物酶活性的蛋白质，例如可以使用由序列编号2或4 中所示氨基酸序列中，1个或多数个(优逸1个或多个(例如1个~ 10 个，更优选1个~5个)氨基睃缺失、1个或多数个(优选1个或多 个(例如1个~ 10个，更优选1个~ 5个)氨基酸被其它氨基酸取代， 以及添加l个或多数个(优逸l个或多个(例如1个~10个，更优选 1个~5个)其它氨基酸的氨基酸序列组成，并且具有与上述GANP 蛋白质相同RNA引物醉活性的GANP变异型蛋白质.所谓"RNA引物醉活性"，是指合成短引物RNA的酶活性，所述 的短引物RNA在合成与沿5， —3，方向进行的链伸长相反的链(后随 链)的过程中作为链伸长的起点.通常使用与DNA聚合酶a相结合的、被称为ot引物醉的分子.在发生中心B细胞中也可以诱导作为笫 二引物醃的GANP引物酶.GANP蛋白质，除了上述序列编号2或4中所示的氨基酸序列或 其变异型氨基酸序列之外，还包括具有N末端的部分序列(例如序列 编号2中所示氨基酸序列的1~600位、优逸139-566位)或它们的 变异型氨基酸序列的蛋白质.本发明中导入到动物中的GAPN基因，可以列举如对上述GANP 蛋白质、N末端的部分序列或变异型蛋白质进行编码的基因.作为这 样的基因，可以使用如具有序列编号1或3中所示碱基序列的基因. 在序列编号1或3所示的碱基序列中，可以只是编码区域的碱基序列， 也可以使用与上述序列编号1或3所示碱基序列互补的，在严格条件 下杂交，并且编码具有RNA引物醉活性蛋白质的基因序列.所谓"严格条件"是指进行杂交后清洗时的条件，盐(钠)浓度为 150~900mM，温度为55-751C,优选盐(钠)浓度为250~450mM， 温度为68TC.在基因中导入变异，可以采用Kunkel法和缺口双链体法等已知 方法，例如采用导入变异用的试刑盒，该试刑盒是利用特异部位的突 变诱导法制备的，如使用GeneTailor 定点诱变系统(Invitrogen公 司制造)，TaKaRa定点豫变系统(Mutan-K、 Mutan-Super Express Km 等夕力，^4才公司制造)向基因中导入变异.变异基因的详细情况和获取方法，在国际公开WOOO/50611号公 报中也有介绍.如果用抗p抗体和抗CD-40单克隆抗体对B细胞进行体外刺激， 则不仅会引起GANP表达的上调，还会引起GANP蛋白质氨基酸序 列中的特定丝氨酸残基(例如笫502位丝氨酸S502)磷酸化.该反 应对于GANP的RNA-引物醉活性，是很关键的反应(Kuwahara，IC 等"(2001) Proc. Natl.Acad.Sci.USA， 98,10279-10283), GANP蛋白质 的N末端的RNA-引物醉结构城含有丝氨酸残基，其礴酸化在体外中 受Cdk2的催化.通过C末端側结构域的作用，GANP结合在MCM3 许可复制许可因子上(Kuwahara， K.等"(2000) Blood 95， 2321-2328; Abe， E.等.，(2000) Gene 255， 219-227). 2. 导入GANP基因的转基因哺乳动物本发明涉及导入GANP基因的转基罔哺乳动物，该转基因哺乳动 物，优选由B细胞表达所导入的GANP基因. (1) GANP基因及其相关分子在基因中诱导变异过程中，由GANP基因与其相关分子形成的复 合体是直接和间接的必要分子.GANP蛋白质，在修复基因变异的过 程中，具有促进诱导V区域变异的作用，由此可获得高亲和性的抗体， 所以本发明的转基因哺乳动物，通过导入该GANP基因或其变异基因 可以促进获得性免疫高亲和性抗体的产生.同时该基因过表达的转基 因非人哺乳动物，可以迅速产生高抗原结合力的抗体.因此用规定的 抗源，对上述转基因非人哺乳动物进行免疫，能够很简单地获得用过 去的方法所得不到的高亲和性抗体.结果就可以得到能够排除难治病 源微生物以及异物的多克隆抗体或单克隆抗体，同时通过使用本发明 的转基因哺乳动物，制备人源抗体，或者通过制备含有本发明转基因 哺乳动物产生抗体V区域的单链抗体，可以显著提髙抗体疗法的功 效，本发明的转基因哺乳动物，通过导入GANP或其变异基因，可以 促进B细胞产生高亲和性抗体，并且前述高亲和性抗体产生细胞具有 阻挡诱导细胞凋亡信号的性能.为了确认GANP是在产生获得免疫应答抗体方面可以发挥作用的 分子，本发明者首先计划制备了 GANP基因缺失小鼠，选择缺失了 GANP基因的B细胞，结果表明即使GANP基因缺失，也观察不到 对免疫系细胞的成熟、分化、增殖的影响，同时也观察不到所产生抗 体总和的较大变化.这里与抗原反应的B细胞直接增殖，分化为抗体产生细胞的B细 胞，仅限于某些种类的抗原，相对于一般抗原的抗体产生必需有T细 胞同时存在.把即使在没有T细胞存在下也能够产生抗体的抗原称为 非T细胞依賴性抗原.与此相反，把非T细胞依赖性抗原以外的一般 抗原称为T细胞依赖性抗原.对于T细胞依赖性抗原，B细胞向抗体 产生细胞的分化是通过辅助T细胞辅助进行的.多数病原病毒的抗原确定簇(也称作抗原表位)的原始自身免疫 原性弱，通过由T细胞识別栽体蛋白质肽抗原的作用而得到活化.为了检测在导入GANP基因的动物中可以髙频率产生，针对在一般动物中不能产生强抗体的可溶性抗原的高亲和性抗体的情况，制备了由硝基苯基(NP基)与鸡-人免疫球蛋白(丙种球蛋白)相结合的 抗原(又称NP-CG),随后对T细胞依赖性抗原反应进行了研究.其中众所周知，仅在使用单链V区域时C57BL/6小鼠产生针对NP 的高亲和性抗体.该反应仅由抗体IgG重链的V区域(称为VH186.2) 和L链入l基因控制.如果使用该体系，可以通过研究VH186.2的氨 基酸序列，由IgGl同种型抗体来研究髙亲和性抗体的基因突变，并 且有报导指出最强的亲和性是在重链V区域(VH186.2)的氛基酸序 列中，在第33位氨基酸的色氨酸(W)变异(W33-L)形成亮氨酸 (L)时诱导产生的.于是本发明者在GANP基因缺失的小鼠中，研究了使其发生 W33-L变异时，是否产生高亲和性抗体的问题.结果与对照的Cre^flox/ +小鼠相比，几乎观察不到高亲和性抗体产生.因此弄清了GANP基 因是对产生髙亲和性抗体具有重要功能的基因.为了进一步验证这一 结论，制备了使GANP基因过表达的小鼠.GANP基因的过表达是通过把小鼠免疫球蛋白启动子部分和人免疫球蛋白基因内含子增强子部 分连接到GANP基因的5，側上，使其在B细胞上选择性地表达而实现的，上述GANP过表达小鼠也能正常出生，在其淋巴组织的成熟、分 化、増殖方面看不出变化.但是在对NP-CG的反应中，高亲和性型 的V区域基因(W33-L)有明显增加.虽然尚未确定RNA引物酶活 性在该过程中究竟起着怎样的作用，但是从(i)判断GANP分子引 物酶活性指标的笫502位丝氨睃残基的裤酸化程度在发生中心高亲和 性B细胞产生区域的细胞(中'e细胞)中高，(ii)通过向Daudi细胞 中导入^m/1基因的实验诱导V区域的突变频率高两方面分析，可以 认为GANP分子的RNA引物蘇活性或与其有关的笫502位丝氨酸残 基的裤酸化与高亲和性抗体产生是有关联的.该结果表明使GANP分 子高表达以及使RNA引物醉活性活化对于由免疫应答引起的髙亲和 性抗体的产生是必要的. (2)导入GANP基因用的哺乳动物本发明中的"哺乳动物"的意义指的是牛、马、猪、山羊、兔子、 狗、猫、小鼠、大鼠、仓鼠以及土拨鼠等任意的非人哺乳动物，优选小鼠、兔子、大鼠或仓鼠，特别优选小鼠.本发明的转基因哺乳动物，可以通过用礴酸钙法、电泳法、脂质转染法、凝集法、微量注射法、基闳枪法、DEAE-葡聚糖(右旋糖酐) 法等方法向未受精卵、受精卵、含有精子及其原细胞的胚芽细胞等， 优选在非人哺乳动物发生中的胚发生阶段(更优选在单细胞或受精卵 细胞阶段，通常在8细胞期以前)的细胞中导入GANP基因来制备， 通过上述基因导入方法也可以把目的GANP基因转移到体细胞、生物 体的脏器、组织细胞等中，用于进行细胞培养和组织培养.还可以通 过用已知的细胞融合法使这些细胞与上述胚芽细胞进行融合，制备转 基因哺乳动物.在把GANP基因导入到对象动物时，优选以基因构建体的形式导 入该基因，在所述构建体中所述基因连接到可指导该基因在所述动物 中表达的启动子的下游.具体是把在可以表达来源于具有目的GANP 基因的各种哺乳动物的GANP基因的各种启动子的下游，连接GANP基因形成栽体，通过微量注射把该栽体导入到对象哺乳动物的受精卵 (例如小鼠受精印)中，可以制备高表达目的GANP基因的转基因哺乳动物. (3 )表达栽体作为GANP基因的表达栽体，可以使用来源于大肠杆菌的质粒、 来源于枯草菌的质粒、来源于酵母的质粒、X噬菌体等噬菌体、莫洛 尼白血病病毒等的反转录病毒、牛豆病毒或杆状病毒等动物或昆虫病毒.作为对基因表达进行调节的启动子，可以使用如来源于病毒基因 的启动子、来源于各种哺乳动物(人、兔子、狗、猫、豚鼠、仓鼠、 大鼠、小鼠等)和鸟类(鸡等)基罔的启动子.作为来源于病毒的基因起动子，可以列举如来源于巨细胞病毒、 莫洛尼白血病病毒、JC病毒、孔腺癌病毒等基因的启动子.作为来源于各种哺乳动物和乌类基因的启动子，可以列举白蛋白， 胰烏素II，红细胞生长素，内皮素，骨钙素，肌肉肌酸激醉，来源于 血小板的生长因子P，角蛋白Kl、 K10和K14，胶原I型和II型， 心钠利尿性因子，多巴胺P-羟化酶，内皮受体酪氨酸激醉，钠钟腺苷 3裤酸化酶，神经原丝轻链，金属疏因I和IIA，金属蛋白酶1组织抑制刑，MHCI类抗原，平滑肌(x肌动蛋白，多肽链延长因子la(EF-l ot )， P肌动蛋白，ot和P肌球蛋白重链，肌球蛋白轻链1和2，號砩 脂基础蛋白、血清淀粉样P组分，肌红蛋白，肾素等基因的启动子.上述栽体也可以具有在转基因哺乳动物中终止目的信使RNA转 录的终止子.此外，为了达到进一步高表达GANP基因的目的，根据 需要，也可以把各基因的剪切信号、增强子区域、真核生物基因的部 分内含子的一部分连接到启动子区域的5，上游、启动子区域和翻译区 域之间或者是翻译区域的3，下游.本发明的优选方案中，通过在免疫球蛋白启动子下游连接GANP 基因或者在GANP基因的5，側连接人免疫球蛋白基因内含子增强子部 分，可以选择性地由B细胞表达GANP基因. (4)导入GANP基因在受精卵细胞阶段导入GANP基因，优选确保其在对象哺乳动物 的所有胚芽细胞和体细胞中达到过剩存在的状态.在导入基因后制备 动物的胚芽细胞中，存在过多的GANP基因意味着在制备动物所有子 代的所有胚芽细胞和体细胞中具有过多的GANP基因.并且接受承继 基因的此种动物子代，其所有胚芽细胞和体细胞中均有过多的GANP 蛋白质.本发明中，获取在相同染色体的一方具有导入基因的异源接合体， 通过对异源接合体之间进行交配，获取在相同染色体双方都具有导入 基因的同源接合体，再对该雌雄动物进行交配，可以使所有子代都能 稳定保持导入的GANP基因.并且还可以确认具有过多的GANP基 因，能够在一般的饲养环境中进行继代繁殖.在把与转基因对象动物所具有的内源性基因不同的基因、即外源 性GANP基因转移到对象的非人哺乳动物(优选小鼠等)、或其先祖 的受精印回交过程中所使用的受精卵，可以通过对同种型雄哺乳动物 和雄哺乳动物进行交配而获得.受精卵，可以通过自然交配获取，但优逸对雌性哺乳动物的性周 期进行人工调节之后，使其与雄性哺乳动物进行交配的方法.作为人 工调节雌性哺乳动物性周期的方法，优选通过腹腔注射等方法首先施 用卵胞刺激激素(妊娠马血清性性腺刺激激素(PMSG))，接着施用 黄体形成激素(人绒毛性性腺刺激激素(hCG))的方法.在所得的受精卵中，通过前述方法导入外源性GANP基因后，通 过人工移植.植入到雌哺乳动物中，就可以得到具有整合外源性基因 DNA的非人哺乳动物.优选采用人工方法把受精印移植 植入到假妊 娠雌性哺乳动物中的方法，该假妊娠雌性哺乳动物是通过对雌性哺乳 动物施用由能形成黄体的激素所放出的激素(LHRH)后，使其与雄 性哺乳动物交配而诱发受精能力.作为导入基因的全能性细胞，对于 小鼠，可以使用受精卵和初期胚，作为向培养细胞中导入基因的方法， 考虑到转基因哺乳动物个体的产出效率和导入基因向子代的传递效率 时，优选采用DNA的微量注射法.注入基因的受精印接着被移植到受体雌性哺乳动物的输卵管中， 将由受精卵发育成个体的动物放到饲育亲本处进行饲养后，从动物体 的某一部分(小鼠时，是从尾巴的端部)提取DNA，通过Southern 印记分析和PCR法，可以确认导入基因的存在.如果把确认有导入 基因存在的个体作为初代(Founder),则导入基因可以传递到50%的 子代(F1)中.再将该F1个体与野生型动物或其它F1动物进行交配， 就可以制备在2倍体染色体的一方(异源接合)或双方(同源接合) 中具有导入基因的个体(F2).或者GANP蛋白质高表达转基因哺乳动物，还可以通过把上述 GANP基因导入到ES细胞(胚胎干细胞)中进行制备.例如向来源 于正常小鼠胚泡(blastocyst )的HPRT阴性(缺失次黄嚷呤鸟嘌呤'砩 酸核糖基转移酶基因)ES细胞中导入GANP基因.使该GANP基因 在小鼠的内源性基因上引起同源重组，通过HAT选择法对整合的ES 细胞进行分选.接着通过微量注射把分选的ES细胞注入到从其它正 常小鼠身上获取的受精卵(胚泡)中.把所得的胚泡移植到作为临时 母体的其它正常小鼠的子宫内.由临时母体生出嵌合转基因小鼠.再 使出生的嵌合转基因小鼠与正常小鼠交配，可以得到异型转基因小 鼠.并且使异型转基因小鼠之间进行交配，可以得到同型转基因小鼠.本发明中，不局限于上述转基因哺乳动物，其子代以及转基因哺 乳动物或其子代的一部分也属于本发范围.作为转基因哺乳动物的一 部分可以列举该转基因哺乳动物或其子代的组织、器官、以及细胞等， 作为器官或组织，可以列举脾脏、胸腺、淋巴结、骨號或扁桃腺等； 作为细胞可以列举B细胞等.本发明的转基因哺乳动物，还可以再与对B细胞进行活化的哺乳 动物交配，这样，有可能产生高亲和性抗体.最近有报导指出在MRL/lpr小鼠中，B细胞在末梢淋巴结的活化 过程中，经过发生中心后，在T细胞区域，会进一步使V区域的突变 诱导亢进.本发明者也发现了在MRL/lpr小鼠中，在非免疫状态下可 以看到和使GANP基因结合在lg启动子、增强子下游而制备的 转基因小鼠中所看到的相同程度高表达.这一事实揭示了在正常情况 下相对于自身抗原不可能产生髙亲和性抗体，与此相反，在该自身免 疫疾病的小鼠中，由于可以引起GANP分子的异常活化，所以也有可 能产生相对于自身抗原的髙亲和'性抗体.于是，作为使上述B细胞进一步活化的动物，如果使用一般认为 是自身免疫疾病小鼠的MRL/lpr, NZB, (NZBxNZW) Fl等，则可以期待诱导更高的变异.通过制备利用上述情况的MRL/lpr小鼠的GANP转基因小鼠， 有可能制备产生超高亲和性抗体的小鼠.也就是通过使本发明GANP 基因过表达的转基因哺乳动物和有各种自身免疫疾病的模型动物交 配，可以制备能产生高亲和性抗体的哺乳动物. 3.制备高亲和性抗体本发明中所说的抗体，表示具有与抗原进行特异结合活性的蛋白 质，优选B细胞产生的抗体，本发明中把对抗原反应性高的抗体称为 高亲和性抗体.所谓"高亲和性"意味着抗体与抗原结合的结合能力 高，本发明中是指与使用一般小鼠等动物制备的抗体相比，抗体与抗 原的结合能力高，反之，也就是从该抗原解离慢的抗体.这表明相对 于抗原决定簇，进行立体紧密结合的能力高，并且具有特异性，同时 由抗体结合导致抗原确定簇以及抗原结构变化的结果而显示出的强烈 活性(显示生物活性，如毒性中和、阻止病毒等的感染性、使病原体 失活、促进从生物体内排出，引起抗原分子变性等).抗体的结合能力(亲和性)，可以通过Scatchard分析和被称为 Biacore的表面胞质基因共振传感器，測定解离常数(KD )、解离速 度常数(Kdiss)、结合速度常数(Kass), Biacore装置是综合传感器 芯片、微形流路系统和SPR检测系统3种技术，测定分子的结合强度、 速度、逸择性的装置，可以不使用标记，用实时方法进行生物体分的检测、和对多个分子间的相互作用进行监控.作为Biacore装置可 以列举Biacore3000、 Biacore2000、 BiacoreX、 Biacore J、 Biacore Q (均为Biacore公司制造)等.通过上述Biacore装里测定表示抗体亲和性的参数，也就是解离 常数(KD )、解离速度常数(Kdiss) [1/Sce]以及结合速度常数(Kass)l/M.Sec，抗体的解离常数(KD值)越小，亲和性越高，所以优选解离常 数小的抗体，抗体的结合能力(亲和性)，取决于Kdiss和Kass两个 参数，用KDM-Kdiss/Kass 表示，由于抗原种类等多种原因，所得抗体的亲和性不同，但是通常优 选KD值为lxlO-7 (M)或其以下，例如可以列举lxl0'8 (M)或其 以下、lxl0lfl (M)或其以下或1x10" (M)或其以下的抗体.本发明中，当制备的抗体是可以发挥上述任意一种作用或性质的 抗体时，都可以判定为是"高亲和性"的.抗体分子的亲和性亢进是由于在抗体基因的可变区域(V区域) 基因中，诱导体细胞超突变(SHM)而产生的.抗体对于抗原的特异 性，从对生物体进行抗原免疫的初期就可以确认，但是初期的抗体多 为IgM级抗体，对抗原的结合亲和性不高，除去或钝化病原体和异物 的能力低，但是，如果对生物体施用抗原，进行数次补充免疫，则可 以提高抗体对于抗原的结合亲合性，在这一过程中，B细胞必需接受 来自T细胞的刺激， 一般认为其活化在末梢淋巴组织的发生中心区域 进行.最近有报导指出，作为诱导V区域基因突变所必需的分子是在 发生中心表达的RNA编辑分子AID.而且有报道称其与尿嘧咬DNA 糖苷酶或作为DNA复制中所必需的聚合醃的，容易产生错误的DNA聚合醉(《)和i相关.但是还没有弄清控制这些功能的分子.目前 巳经弄清了 GANP分子，作为新型SHM诱导分子的功能，该分子的 表达提高掌握着诱导SHM的重要关鍵.特别对为产生高亲和性抗体 是非常重要的这一点已经十分明确.对于C57BL/6小鼠，通过使用硝基苯基-鸡y球蛋白作为半抗原*栽 体的抗原，进行免疫而诱导的抗体，H链使用VH186.2基因座，L链为入l.该过程中众所周知，进行补充免疫所得到的抗体是Ig^抗体，其中特别是在结合亲合性高的抗体V区域序列中诱导的突变是第33 位色氡酸变异为亮氛酸的突变.本说明书实施例中，用该模式系统诱 导高亲和性型V区域突变，可以说这是在分子水平上显示诱导高亲和 性抗体的明显证据.因此通过对上述转基因哺乳动物或其子代施用抗原产生抗体，可 以得到高亲和性抗体.也就是用常规方法对使GANP蛋白质高表达的 动物施用目的抗原，通过致敏动物的血液或脾脏等组织(不局限于这 些组织)的淋巴细胞，可以制备高亲和性抗体.高亲和性抗体可以是 多克隆抗体，也可以是单克隆抗体.作为产生多克隆抗体的方法，例如可以把抗原施用于本发明的转 基因哺乳动物中进行免疫，从免疫的哺乳动物中采集血液，再由采集 的血液对抗体进行分离 纯化，就可以得到多克隆抗体.免疫致敏的方法，在本行业中是已知的，例如可以通过施用1次 或1次以上抗原的方法进行.对于抗原的种类没有特别限定，适合采用具有作为抗原确定簇立 体结构的所有物质，除了蛋白质、醃、肽、糖、脂质、DNA、 RNA、 朊病毒等所有的生物体成分以外，还可以使用癌抗原、病毒抗原、有机、无机合成抗原等任意抗原.施用抗原，可以以7~30天间隔，施用2~3次.施用量，如每次 可以掌握在抗原约为0.05-2mg左右，对于施用途径，没有特別限定， 可以适当选择施用于皮下、皮内、腹膜腔内、静脉内、肌肉内等途径， 优选通过注射方法施用于静脉内、腹膜腔内或皮下.同时还可以把抗 原溶解在适当的緩沖液，例如溶解在含有完全弗氏佐刑或氫氣化铝等 一般常用佐刑的适当緩冲液中使用，但是根据施用途径和条件，有时 也可以不使用佐刑.对经免疫致敏的哺乳动物进行一定时间的饲养后，采集哺乳动物 的血清样，测定抗体价数.当抗体价数升高时，可以采用10(^g~1000 pg的抗原进行补充免疫.从最后施用抗原1~2个月后经免疫致敏的 哺乳动物中采集血液，可以通过蛋白质分离中常用的各种方法，例如 离心分离法、使用碟酸铵或聚乙二醇的沉淀、凝胶过滤层析、离子交 换层析、亲和层析法等，对血液进行分离作为多克隆抗血清得到多克隆抗体，作为产生单克隆抗体的方法，可以列举如杂交瘤法等.首先使构 成目的抗原的肽悬浮在佐刑中，把所得的悬浮液施用到免疫动物(即 本发明的转基因哺乳动物)的皮下或真皮内.抗原的种类与前面叙迷 的相同.作为所用的佐剂，可以列举完全弗氏佐剂、弗氏的不完全佐剂、BCG、海藻糖二審菌酸酯(TDM)、脂多糖(LPS)、明矾佐刑、 二氣化硅佐刑等.从抗体诱导能的关系考虑，优选配合弗氏的完全佐 刑(GFA)和弗氏的不完全佐剂UFA)使用.在单克隆抗体产生中，优选在对免疫动物进行初次免疫后，再进 行数次补充免疫、经过适当天数后，进行部分采血，测定抗体的价数， 用本发明方发产生的抗体，是髙亲和性抗体，所以上述免疫，有可能 只进行笫一次就足够了.抗体的价数，可以通过酵免疫测定(以下称 为"ELISA")法等已知方法进行测定.接着从致敏结束后的免疫动物中取出脾脏，得到B细胞.该过程 中，从能够减轻后面筛选负担的角度考虑，优逸得到与抗原相结合的 B细胞.在这里得到的B细胞是产生高亲和性抗体的细胞，也可以直 接把该B细胞作为免疫激活剂使用.还可以直接由B细胞得到V区 域基因，测定该V区域的体细胞超突变.接着按照常规方法，使B细胞和骨髄瘤细胞融合，制备产生抗体 的杂交瘤.如果是小鼠，则取出脾脏，把取出的脾脏置于Hanks的平 衡盐溶液(HBSS)中，用小银子取出细胞，得到淋巴细胞(B细胞). 用台盼蓝的染色液对所得淋巴细胞进行染色，对活细胞进行计数，使 其与骨號瘤细胞进行融合形成杂交瘤.对用于细胞融合的骨號瘤细胞，没有特别限定，可以使用已知的 骨拔瘤，例如可以列举P3-X63.Ag8(X63)、 P3-X63.Ag8.Ul(P3Ul)、 P3/NSI/l-Ag4-l(NSI)、 Sp2/(KAgl4(Sp2/0)等.在选择骨拔瘤细胞时， 要适当考虑与抗体产生细胞的适应性.细胞融合，可以在不含血清的DMEM、 RPMI-1640培养基等动 物细胞培养用的培养基中，对1 x 106 ~ 1 x 107个/ml的抗体产生细胞 和2 x 105 ~ 2 x 106个/ml的骨後瘤细胞进行混合(抗体产生细胞与骨 败瘤细胞的细胞比优选为5:1),在细胞融合促进刑存在条件下进行 融合反应.细胞的融合方法，可以选择使用本领域中的任意已知方法，如仙 台病毒法、聚乙二醇法、原生质体法等，但是特别优选聚乙二醇法， 闳为它的细胞毒性较小，而且融合操作也简单.作为细胞融合促进刑的聚乙二醇，可以使用平均分子童为1000~6000道尔顿的聚乙二醉. 如果想大量制备抗体时，优选使用通过乙烯基吡啶诱导刑进行刺激的 抗体产生细胞和骨拔瘤细胞进行细胞融合的杂交瘤.对所得的杂交瘤细胞，可以按照常规方法在HAT培养基(含有 次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氣核苷的培养基)中培养适当时间， 对杂交瘤进行筛选。接着筛选产生目的抗体的杂交瘤，进行杂交瘤克 隆.作为筛选方法，可以使用众所周知的抗体检測方法，例如ELISA 法、放射免疫分析(以下称为"RIA")法、噬菌斑法、凝集反应法等， 作为克隆方法，可以采用该领域中的众所周知的方法，例如临界稀释 法、软琼脂法、和FACS法等方法.把所得的杂交瘤在适当的培养液 中进行培养，或者是施用于与杂交瘤具有适应性的小鼠的腹腔内.从 这样得到的培养液或腹水中通过盐析、离子交换色谦、凝胶过滤、亲 和色详法等方法可以对所需要的单克隆抗体进行分离纯化.上述抗体的片段和V区域的单链抗体也属于本发明范闺.作为抗 体片段，是表示前述多克隆抗体或单克隆抗体的一部分区域，具体可 以列举F(ab，)2、 Fab，、 Fab、 Fv(抗体的可变区片段)、sFv、 dsFv(二 硤键稳定的Fv)或dAb(单结构域抗体)等.这里所谓的"F(ab，)2"和 "Fab，"表示分别用蛋白分解酶的胃蛋白醉和木瓜蛋白酶对免疫球蛋 白(单克隆抗体)进行处理而制备，在存在于绞链区域中2条H链间 的二碟鍵的前后被消化生成的抗体片段.例如如果用木瓜蛋白酶对IgG 进行处理，则在存在于绞链区域中2条H链间的二碟鍵上游被切断， 可以制备由VL (L链可变区域)和CL (L链稳定区域)构成的L链 以及由VH (H链可变区域)和ChY1 (H链稳定区域的Yl区域)构 成的H链片段，在C末端区域，通过二碟鍵结合的2个相同的抗体 片段.分别把这2个相同的抗体片段，称为Fab，.如果用胃蛋白醃对 IgG进行处理，則在存在于绞链区域中2条H链间的二碟鍵下游被切 断，可以制备比由前迷2个Fab，在绞链区域相连片段稍大的的抗体片 段.把该抗体片段称为F(ab，)2，单链抗体具有用连接物把Vl把VH连接起来的结构.本发明的髙亲和性抗体，可以是人源抗体和人抗体.这些抗体可 以通过使用把免疫系统和人的免疫系统进行更换的哺乳动物，对该哺 乳动物进行免疫，与一般单克隆抗体一样，直接制备人抗体.制备人源抗体时，可以把互补性确定区域(CDR)由小鼠抗体的 可变区域移植到人可变区域中，制备由构架区域(FR)来源于人，CDR 来源于小鼠构成的重组可变区域.接着把这些经人源化重组的人(抗体)可变区域连接到人(抗体) 稳定区域上.最终来源于经重组的人源抗体中人(抗体)以外的氨基 酸序列部分只有CDR和极少一部分FR. CDR是由超可变氣基酸序 列构成的，它不表示种特异的序列，所以可以使用具有小鼠CDR的 人源抗体.人源抗体的制备方法，在本行业中是众所周知的.人抗体可以采用任何动物制备(小鼠、大鼠)，只是通常对于V 区域的抗原结合部位，也就是超可变区域(Hyper Variable region) 会产生有关特异性和结合亲和性的问趙.另一方面优选V区域的其它 部分和稳定区域的结构具有与人抗体相同的结构.对于人，在共同基 因序列方面，已经确立了通过基因工程法进行制备的方法.对本发明抗体的同种型没有特别限定，例如可以具有IgG(IgG" IgG2、 IgG3、 IgG4)， IgM， IgA (IgA" IgA2)， IgD或IgE的任意同 种型.4.高亲和性抗体的利用本发明的髙亲和抗体，可用以作为诊断、治疗或预防疾病的药刑. (1)诊断疾病使用本发明抗体诊断各种疾病的方法，可以通过把从怀疑有各种 疾病的被检者身上采集试样，例如血清等和本发明的抗体通过抗原体 反应进行结合，通过结合的抗体量检测出试样中目的抗原的量的方法 进行.抗体量的检測可以按照已知的免疫学测定方法进行.例如可以 使用免疫沉淀法、免疫凝集法、标记免疫测定法、免疫散射测浊法、 免疫比浊法等.特别优选标记免疫测定法，因为其搮作简单，并且灵 敏度高.标记免疫测定法中，试样中的抗体价数，除了用标记抗体直 接进行检測的标记量表示以外，还可以以已知浓度或已知抗体价数的 抗体作为标准液进行相对表示.也就是可以用相同检测系统对标准液和试样同时进行測定，以标准液的值作为基准，相对地表示试样中的 抗体价数.作为标记免疫测定法，可以任意利用已知的方法，如ELISA法、 RIA法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等等.所用标记物质 可以根据上述测定方法，对醉、放射性同位素、荧光化合物等进行适 当选择，作为前述酶，可以列举如过氣化物酶、碱性砩酸酶、酸性裤 酸醉、葡糖氧化醉等.上述标记缺质可以通过使用抗生素蛋白-生物素 复合物提高标记物质的检测灵敏度.作为放射性同位素主要是12SI，作 为荧光化合物可以列举异碟氛酸荧光素(FITC)和异硤氛酸四甲基诺 丹明(TRITC)等.作为化学发光化合物，可以列举氣化苦杏素、氨 基苯二酰肼(普米诺)、光泽精等.由上述标记物产生的抗体标记，可 以按照常规方法进行.以下对使用标记抗体的标记免疫测定法进行说 明.作为用标记免疫測定法检测各种疾病的方法，可以使用已知的非 竟争反应系或竟争反应系进行.在非竟争反应系中，必需是固相(固 相法)，在竟争反应系中不一定必需是固相(液相法).优选使用固相 法，因为其测定操作简便.作为固相材质，可以列举聚苯乙烯、尼龙、 玻璃、硅胶、纤維素等，作为固相的形状，可以列举球形、孔形、管 形、片形等.但不局限于这些形状.可以任意使用一般标记免疫测定 法中所用的已知材质和形状，非竟争反应系中，测定操作是对试样或本发明的抗体进行固相化 后，^t之与本发明的抗体或试样反应，接着加入预先标记好的抗免疫 球蛋白抗体(第二抗体)与正在和经固相化处理的试样进行反应的抗 体进行反应.通过该第二抗体标记，可以检測与试样结合的抗体量， 被检测出的经标记的笫二抗体的量，与试样中的目的抗原量成正比关 系，所以由此可以求出试样中目的抗原的量.在竟争反应系中，相对于一定量抗体使试样和一定量的目的抗原 进行竟争性结合，例如，对试样进行固相化后，使其与预先添加目的 抗原进行反应的本发明抗体反应.接着使与经固相化的试样进行反应 的抗体与预先标记好的抗免疫球蛋白抗体(笫二抗体)反应，可以通 过标记物质检测抗体的量.被检测出的标记物量与添加的目的抗原量 成反比(相关)关系.作为其它的竟争反应系，对本发明的抗体进行固相化，使其与试样反应后，再使其与预先标记好的目的抗原反应，被检测出的标记物量和与抗体结合的试样中的GANP蛋白质量成反比 关系.作为对前述抗原或抗体进行固相化的方法，可以使用物理吸附法、 共价结合法、离子结合法、交联法等已知方法.从操作简便的角度考 虑，特别优选物理吸附法.作为抗免疫球蛋白抗体(笫二抗体)，可 以使用如抗IgG抗体、抗IgM抗体等，这些抗体，即可以直接使用 抗体分子，也可以使用含有对抗体进行酶处理所得到抗原结合部位的 抗体片段的Fab、 Fab，、 F(ab，)2.还可以使用对抗体分子中具有特异 亲和性的物质，例如使用对在IgG中具有特异亲和性的蛋白质A等进 行标记，来替代标记的抗免疫球蛋白抗体.作为前述标记免疫测定法的优选例子，可以列举以酶作为标记物 的免疫测定法、ELISA法.ELISA法，例如可以在96孔板上，注入 试样或其稀释液，在4TC ~室温下静止放置一夜，再于371C下静止放 置1~3小时左右，使其吸附应该检测的GANP蛋白质并对其进行固 相化.接着使本发明抗体反应，再与预先结合酶的抗免疫球蛋白抗体 (笫二抗体)进行反应.最后加入与酶发生反应的适当显色性底物(例如，当酶是磷酸蘇时，用p-硝基苯基砩酸等)通过其显色对抗体进行 检测.还可以利用本发明的髙亲和性抗体，对治疗各种疾病药刑的药效 进行评定.利用本发明高亲和性抗体评定药效的方法是通过对患有各 种疾病的患者或患有各种疾病的模型动物施用药剂后，使用本发明抗 体检测这些生物体中病毒等抗原的量，并对该量进行比较，通过生物 体中的抗原量，可以对作为治疗各种疾病药剂的药效进行评定.本发明的高亲和性抗体，可以以诊断各种疾病用的试剂盒形式提 供.该试剂盒，可用于本发明的诊断方法和本发明对药效进行评定的 方法.本发明的试剂盒含有从以下(a)和(b)中选择的至少1种或1种 以上的物质.(a) 本发明的抗体或其标记物(b) 对前项(a)中所述的抗体或其标记物进行固定的固相化试刑.这里所谓的抗体标记物是指通过蘇、放射性同位素、荧光化合物或化学发光化合物进行标记的抗体标记物.作为对本发明试剂盒中的抗体，或者是它们的标记物进行固定的固相材质，可以列举聚苯乙烯、尼龙、玻璃、硅胶、纤维素等；作为 固相的形状，可以列举球形、孔形、管形、片形等，但是不局限于这 些材质和形状，也可以用添加固相和固相化中所必需的固相化试刑的 物质来替代该固相化试刑.作为固相化试刑，例如用物理吸附法进行 固相化时，可以列举50mM破酸盐緩冲液(pH9.6)、 10mM Tris盐酸 緩冲液(pH8.5、含lOOmM氯化钠)、PBS等涂布液，根据需要还可 以使用涂布液中含0.5%明胶等的封闭液.本发明试刑盒中的抗体，也可以是使其溶解在PBS等中的状态， 或者是使其结合在凝胶上的状态(以下简称为"吸收用凝胶").前述 吸收用凝胶，还可以是把适量的凝胶预先包装在通过批量法进行吸收 处理用的0.5 — 2ml微型离心分离管中的状态或者是预先填充到通过色 详柱法进行吸收处理用的柱容量为0.1 ~ 5ml的微型柱中的状态，本发明的试剂盒，除了上述结构要素以外，还可以含有为实施本 发明检测的其它试剂，例如当标记物是酶标记物时，含有醉底物(显 色性底物等)、酶底物溶液，酶反应终止液或者是试样用稀释液.作 为前述试样用稀释液，可以列举如PBS (生理磷酸緩冲液、pH7.4)、 含137mM氯化钠和3mM氯化奸的pH为7,4并且Tris盐酸緩冲液为 20mM的(以下简称为"TBS")、 0.05%Tween20、含0.1 - 1%BSA 的PSB、或TBS等.该试样用稀释液，除了用于试样稀释以外，还 可以用于稀释抗体等方面. (2)治疗或预防疾病的医药组合物本发明的A亲和性抗体，如果是具有能够对形成疾病病原的抗原 活性进行中和作用的抗体，則可以作为治疗或预防疾病的医药组合物 使用.本发明的医药組合物，优选以含有本发明的髙亲合性抗体或其 片段作为有效成分，并且还含有在药学上允许使用的栽体的医药組合 物形态提供.这里，所谓"药学上允许使用的栽体"可以列举赋形刑、稀释刑、 增量刑、分解剂、稳定刑、保存剂、緩冲刑、乳化刑、芳香剂、着色 剂、甜味剂、增稠剂、矫味剂、溶解助剂或其它添加刑等.通过使用 1种或1种以上这样的栽体，可以制备片刑、丸剂、散刑、颗粒剂、注射刑、液剂、胶囊刑、口含片刑、醜刑、悬浮刑、乳化刑或糖浆刑 等形态的医药組合物.这些医药组合物，可以通过经口或非经口方式 施用.作为为进行非经口方式施用的其它形态，还可以以含有1种或 1种以上活性物质，用常规处方配制成外用药刑，还包括向肠内施用 的栓剂和遊孕药剂等等.本发明的药刑施用量，视患者的年龄、性別、体重以及症状、治 疗效果、施用方法、处理时间、或该药剂所含活性成分的高亲合性抗体的种类不同而异，通常成人每人每次的施用量范围可以是10ng~ 1000mg，优选范围是10Mg 100mg，但是，并不限定在此范围内.例如如果是注射剂，可以通过使抗体溶解或悬浮在生理食盐水或 市场上出售的注射用蒸愤水等药学上允许的栽体中，并使抗体浓度达 到0.1 n g抗体/ml栽体~ 10mg抗体/ml栽体进行制备.这样制备的注 射剂，相对于需要进行处置的人患者，1次施用量可以按lkg体重为 lpg-100mg的比率，优选50ng"-50mg的比率， 一天施用l次-数 次的量进行施用，作为施用的形式，可以列举静脉注射、皮下注射、 皮内注射、肌肉内注射或腹腔内注射等形式，但优选取向静脉内注射 的形式.同时注射剂，有时也可以通过非水性稀释刑(例如丙二醇、 聚乙二醇、橄梘油类的植物油、乙醇等醇类等)作为悬浮刑或乳浊刑 进行制备.对这样的注射剂进行灭菌的方法，可以采用通过能保留细行灭菌.注射剂，可以以使用时再调制的形式进行制备，也就是通过 冷冻干燥法等制成无菌的固体组合物，在使用前使其溶解在无菌的注 射用蒸你水或其它溶刑中使用. 5.本发明的应用本发明者在B细胞肿瘸抹上诱导GANP过表达之后，进行分析的 结果表明，B细胞肺瘤林，通过导入GANP基因，具有快速诱导V 区域基因体细胞超突变的效果.当使用不引起对GANP的RNA引物 酶活性必不可少的笫502位丝氨酸裤酸化的变异基因时，看不到这一 效果，因此，要快速诱导V区域基因的体细胞超突变，RNA引物酶 活性是非常必要的.该结果表明作为临床辅助免疫活化剂，GANP具 有增强产生特异抗体的效果.使用反转录病毒栽体作为栽体，并且同时采用通过CD40、 BAFF，或者是通过配合灭菌剂或通过照射方式进等TNF类分子的刺激和GANP，对于临床的辅助免疫活化作用也是 有效的.另外通过在骨號细胞水平导入该基因，也能够期待在T细胞 上诱导高亲和性结合.当得不到艾滋病、C型病毒肝炎、成人T细胞 白血病、疯牛病等的高亲和性抗体时，或者即使得到上述高亲和性抗 体，但是由于马上引起抗原变异的原因，不能持续产生足够的高亲和 性抗体时，可以期待导入该基因发挥优异的效果，本发明的GANP基因过表达的哺乳动物，对于开发对制备生物学 研究试剂、临床检查试剂有效的单克隆抗体是非常有效的.例如简单 制备把相对特定信号传递分子的单克隆抗体和对功能结构域以及功能 基元具有特异性并且结合力高的高亲和性抗体的应用范围相当广.多 数抗体，不能进行很多筛选，所以有时不能用于免疫western分析和 免疫沉淀中.这时如果使用本发明的转基因哺乳动物，可以用较短的 时间从比较少的克隆抗体中筛选高亲和性抗体产生细胞，能有效降低 经费、时间和劳力的消耗.特别是制备磚酸化抗体，相对于基因变异 部分的特异抗体，可以应用于诊断药剂或者是使用抗体的药物选择性 注入法中，还可以产生与基因序列和核苷酸部分有选择性结合的高亲 和性抗体.无机物、碳水化合物、化学合成物等任意物质立体结构的一部分， 都可以作为抗原基元进行识别.髙亲和性抗体，在过去是得不到的， 但是通过与自身免疫疾病小鼠进行交配而制备的小鼠，对于为达到获 得对所有抗原都具有离亲和性抗体的目的，是非常有效的.在该方法 中有可能得到结合力为io-"道尔頓的高亲和性抗体，并且通过引入 ELISA法的技术开发，还有可能开发简单地对微量物质进行检测的技 术.如果按照本发明，也有可能提供含有RNA引物蘇失活型GANP 基因的为治疗过敏性疾病或自身克疫疾病的基因治疗刑.所谓"RNA 引物酶失活型GANP基因"是指RNA引物酶结构域缺失，或者是RNA 引物酶结构域变异的基因，还指通过含有笫502位丝氨酸残基变异的 附近的基因变异而引起GANP分子结构和功能发生变化的基因.本发明的基闳治疗刑，可以通过把含有RNA引物酶失活型GANP 基因的重组栽体和用于基因治疔剂的基刑一起配合进行制备.作为构 建重组栽体过程中所用的栽体，可以列举作为病毒栽体的反转录病毒栽体、腺病毒栽体、腺伴随病毒栽体、杆状病毒栽体、牛疽病毒栽体，或者也可以使用动物表达用的质粒.栽体，优选病毒栽体.当把RNA 引物醉失活型GANP基因整合到病毒栽体中时，制备含有重组体DNA 的病毒粒子，再与基因治疗剂中所用的基刑配合在一起，就可以制备 基因治疗剂.作为用于基因治疗刑的基剂，可以使用一般注射刑中所用的基刑， 例如蒸馏水、氯化钠或氯化钠与无机盐混合物等的盐溶液、甘露醇、 乳糖、葡聚糖、葡萄糖等的溶液，甘氨酸、精氨酸等氦基酸溶液，有 机酸溶液或盐溶液与葡萄糖溶液的混合溶液等.或者还可以按照本行 业的已知方法，在这些基剂中使用渗透压调节剂、pH调节刑、植物 油、或表面活性刑等助剂，作为溶液、悬浮液、分散液制备注射剂. 这些注射刑，可以通过使其形成粉末、冷冻干燥等操作制备成使用时 进行溶解的制刑^本发明基因治疗剂的施用方式，既可以进行一般的向静脉内、动 脉内等的全身施用，也可以进行局部注射或口服施用等局部施用等方 式.本发明基因治疗剂的施用量视年龄、性别、症状、施用途径、施 用次数、剂型不同而异，但是如果是成年人，作为每天的重組基因的 重量范围是1 m g/kg ~ 1000mg/kg左右，优选范围是10^g/kg-100mg/kg左右.对施用次数没有特别限定. 实施例通过以下的实施例进一步具体说明本发明的情况，但本发明不受 实施例的限定.实施例1:自身免疫疾病模型动物中的GANP表达及其功能 (材料及方法)1. 动物NZB、 NZW、 B/WF1、 MRL/lpr以及BXSB小鼠，从日本SLC Co. 购入.CS7BL/6以及BALB/c小鼠，从Charles River Japan购入，NOD 小鼠，由大蘇大学研究生院的宫崎博士提供，2. 抗体及试剂针对小鼠B220(RA3-6B2)、小鼠IgM(AM/3)以及小鼠IgD(CS/15) 的大鼠单克隆抗体，由杂交瘤的培养上清进行纯化.用D-生物素-N-鞋基號珀跌亚胺酯(Roche diagnostics, Branchburg， NJ)进行标记. 生物素标记大鼠抗小鼠Syndecan"以及抗小鼠CD5单克隆抗体，是 购入的(BD PharMingen, San Diego，CA ) 生物素标记花生凝集素 (PNA)是从Vector Laboratories (Burlingame， CA)购入的.3. 免疫三辨基苯基匙孔成血蓝蛋白(Trinitrophenyl keyhole limpet hemocyanin (TNP誦KLH))以及TNP- Ficoll，从Biosearch Technologies (Novato， CA)购入，把在完全弗氏佐剂中乳化的100TNP-KLH或 在PBS中的25jjg TNP-Ficoll注入到小鼠的腹腔内.14天后，取其 淋巴器官，与OCT化合物一起进行冷冻，用于进行免疫组织分析.4. 免疫组织分析用丙酮对6nm的冷冻切片进行5'分钟固定，用3%BSA的PBS 溶液封闭15分钟，与大鼠抗小鼠GANP单克隆抗体(42-23 )[Kuwahara K"等，2000， Blood 95:2321-2328或大鼠抗-pSer柳GANP单克隆抗 体(PG/103) [Kuwahara IC，等，2001， Proc.Natl. Acad. Sci* USA 98:10279 -10283一起孵育1小时，用PBS对栽有切片的栽玻片进行 数次清洗，与碱性礴酸酶(ALP)-结合山羊抗大鼠IgG抗体(ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA )—起进行醉育.采用Vector Blue kit (Vector)进行显色.为了进行双重染色，配合使用生物素标记抗体和 辣根过氣化物蘇(HRP)-结合链審抗生物素蛋白(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg， MD )进行反应，用3-3， -二氨基联苯胺 四氮氯化物(DAB;同仁化学)进行显色后，用1%戊二毪的PBS溶 液对切片进行一分钟固定.为了进行封固，使用了 Aquatex (Merck, Darmstadt, Germany).为了在体内检测具有增殖活性的细胞，在宰 杀之前2小时，把5-溴脱氣尿核苷(BrdU ) (Sigma Chemicals Co" St. Louis， MO; lmg/小鼠)注入到(小鼠的)静脉内.把进行DNA合成 的细胞和抗BrdU单克隆抗体(BD PharMingen)以及ALP-结合山 羊抗小鼠Ig抗体(Sigma)配合在一起进行染色，通过Vector Red (Vector)使其显色，进行检测.PAS染色，按照已经报导的方法进行. [Jiang Y，等、1977， J.Immunol， 158: 992-997，5. 结果(1) MRL/lpr小鼠淋巴结中GANPW细胞的出现GANP表达是由具有自身免疫倾向的高活性的B细胞进行高表 达，表达高水平GANP的淋巴细胞(GANphi细胞)，在非免疫状态下 自发出现在MRL/lpr小鼠的末稍淋巴结中.使用抗GANP单克隆抗体和ALP结合抗大鼠Ig抗体，对来源于 自身免疫疾病模型MRL/lpr、 NZB和正常CWBL/6雌小鼠膝窝的淋 巴结进行了免疫组织化学分析.把结果表示在困l中.在笫7周，于MRL/lpr小鼠的淋巴结上可 以观察到用Vector Blue (ALP底物)染色的GANpw细胞，与此相反， 在同龄的NZB小鼠中却观察不到，在笫40周才出现该细胞(闺1). 在正常的C57BL/6小鼠中，整个期间内都可以观察到极少数的GANPW细J&。自身免疫疾病模型小鼠，与C57BL/6小鼠相比较，其淋巴细胞增 加明显，在非免疫条件下，不显示GANPhi细胞(困1).在随着年龄 增长逐渐引起自身性免疫状态的NZB小鼠淋巴结中，对这种GANpw 细胞的出现进行了研究，低龄NZB小鼠(7周龄)的膝窝淋巴结中没 有GANPW细胞，在年龄增加的NZB小鼠(40周龄)中，具有多数 GANpw细胞.GANP RNA引物酶活性有可能在B细胞的活化和分化中起着重 要作用.于是，在NZB小鼠中使用抗pSer鄉单克隆抗体，对RNA 引物酶活性的重要砩酸化部位Ser5。2的裤酸化状态进行了比较.对NZB小鼠淋巴结中的GANP和pSerSMGANP的表达进行了比 较.pSer靴GANP，用抗pSer弧GANP ( PG/103 )单克隆抗体(蓝) 进行检测，用生物素标记抗B220单克隆抗体对整个切片进行染色后， 对HRP结合链莓抗生物素蛋白和DAB (茶色)进行组合检测.图中 表示2次独立实验的数据(围2).困2中，下困(图表)表示在年龄增长期间，滤胞外区域的GANPhi (黑色柱)和pSer502 GANPhi (斜线柱)的细胞数.GANP的表达在笫8周明显，在到达笫32周的整个期间内都可 以检测出GANPM细胞(闺2;上困).对照之下，pSer^-阳性细胞数 在笫8周达到最大，然后阳性细胞明显减少(困2;中围)把以峰值 年龄为基准通过显微镜观察到的反应性细胞数表示在困中(困2;下 困).由这些结果分析可知GANP表达在最初伴随有RNA引物酶活性，该活性在长时间内得不到调节.(2 )在自身免疫倾向小鼠脾脏红脾拔上GANPhl细胞的自发出现对于在自身免疫倾向NZB小鼠的膝窝淋巴结处检测出的GANPhi 细胞是否出现在非免疫状态下的脾脏中，进行了研究.免疫染色按照与前述(1)相同的操作(图2)进行，闺3表示由 3次独立实验得到的数据(图3).第4周在脾脏上出现GANPhi细胞，细胞数在笫12周达到最大值， 但是在24周后消失(困3;上困).第8周和12周也检测出pSerSMGANP 的表达(围3;中闺).与红脾拔的相对细胞数进行比较的结果表明在 脾脏上出现的GANPhi细胞，在12周后转移到末梢淋巴结上，GANPhi 的增加与先于自身免疫疾病发病的自身抗体的产生量成比例(闺2和 困3; Theofilopoulos A. N.，等、1985， Adv. Immunol. 37:269-390),由于GANPhi细胞的出现可能与自身免疫倾向小鼠中的B细胞异 常相关，所以对非免疫条件下，各种自身免疫倾向小鼠(8周龄)中 DANPhl细胞的出现进行了研究.把结果表示在困4中.GANpw细胞在MRL/lpr、 NZB以及B/WF1 的红脾殖上明显出现，GANPM细胞的数量在SLE-模型小鼠的BXSB以及NOD的脾脏 中增加得不是很多，但是如果与对照的BALB/c小鼠(困4)以及 C57BL/6小鼠(闺1)相比，是増加的.脾脏切片，作为GC型结构， 显示出PNA+B细胞的联想和未熟的締合.通过与GANP在对正常 C57BL/6小鼠以及BALB/c小鼠，进行T细胞依赖性抗原(T cell-d印endent Ags: TD-Ags)免疫制备的在GC上的表达相比较，GANP 在GC型区域中的表达不高.但是GANPW细胞在自身免疫倾向小鼠 的红脾號区域明显地出现(困4)。还进一步通过淋巴系细胞标记(物)分析对GANPW细胞群进行 了分析.使用生物素标记抗B220单克隆抗体、生物素标记抗Syndecan-l 羊克隆抗体、生物素标记抗lgM单克隆抗体以及抗IgG抗体，对NZB 小鼠的脾脏切片进行双重染色，对GANP"细胞进行了鉴定.把结果表示在闺5中.闺5所示困的左側一列，由上到下顺序是 使用生物素标记抗IgM单克隆抗体、抗IgG抗体、生物素标记抗B220单克隆抗体以及生物素标记抗Syndecan-l单克隆抗体时的困.中间 一列表示GANP在与分別使用上述各抗体情况相同切片上的表达.右 側一列是把左側一列和中间一列相重叠的困.右側一列经双重染色的 细胞，显示GANPhi细胞是B220Syndecanl+IgM+, GANP表达，在 IgM、 IgG以及B200的情况下用红色表示；在Syndeeanl情况下用 绿色表示，标记(物)，IgM、 IgG以及B200用绿色表示；Syndecan-l用红色表示.GANPM细胞表达B220Syndecanr的表现型，在细胞中表达大量 的IgM (困5),对于CR1、 Thyl、 GL-7、 CD23以及PNA为阴性， 这些结果表明，GANPM细胞在B系细胞的后期成熟阶段，大概是浆 细胞.为了研究该GANphi细胞是否是增殖性原浆细胞，对NZB小鼠 施用BrdU (lmg/小鼠)(注入到静脉内)，为了在体内整合BrdU，进 行2小时孵育.然后由小鼠制备脾脏切片.用抗GANP单克隆抗体(蓝)以及抗BrdU单克隆抗体(红)对 切片进行双重染色.按照常规方法，进行PAS染色.把结果表示在闺6中，GC表示发生中心(左).GANP单一阳性 GANPW细胞，用箭头表示，用箭尖表示PAS单一阳性细胞(中间).用生物素标记抗CD-5单克隆抗体对切片进行染色.PALS区域表 示淋巴结动脉周围的鞘(右).困6表示3次独立实验的代表性数据.GANPW细胞对引入BrdU不显示阳性(闺6)，表明这些细胞不 是增殖性的，比原浆细胞阶段要成熟.作为B-l细胞的异常分化，在自身免疫倾向小鼠中可以观察到Mott 细胞形成.Mott细胞是浆细胞的异常形态，是大量IgM分子积蓄在 通过PAS染色作为细胞质内Russell小体而被检测出的粗面小胞体结 合小胞上[Jiang Y"等、1997， J. Immunol. 158: 992-997，GANP^细 胞不被PAS-染色而染色(困6)，由此可以把GANPM细胞和来源于B-1 细胞浆细胞的Mott细胞进行区別.脾脏GANP^群的CD5表达是阴 性(困6)，由NZB小鼠(12周)冉到的腹膜细胞对GANphi细胞是 阴性，这表明B-l细胞没有大量表达GANP.该结果揭示了 GANPM 细胞在自身免疫状态下属于高活性B细胞，该群与B-l细胞起源属于 不同的起源体系.(3)在用TD-Ag进行免疫的正常小鼠中诱导GANphi细胞对次级淋巴器官中的GANPh'浆细胞出现是否只局限于自身免疫 倾向小鼠中的问題进行了研究.用TNP-Ficoll (TI-2-Ag)或TNP画KLH (TD-Ag)对雌C57BL/6小 鼠(7周龄)进行了腹腔内免疫，14天后取得脾脏.用TNP-Ficoll免 疫的小鼠，当用生物素标记抗IgD单克隆抗体进行对比染色时，在红 脾拔区域，没有显示出GANP"细胞(闺7左).用TNP-KLH进行免 疫的小鼠，在红脾it区域显示出GANphi细胞(闺7右).困7中，GANPW 细胞用箭头表示，WP表示白脾ft区域.GANPW浆细胞群，其数量非常少，但是在通过用TD-Ags进行免 疫，即使在正常C57BL/6以及BALB/c小鼠的脾脏中也能进行诱导(围 7).通过非T细胞依赖性Ag(TI-Ag)进行的免疫，在这种细胞谤导中 的效果较小.GANPhi细胞群显示出与B2201。 IgMhi IgD1。 GL，。 PNA1。 CD5kCD40'。相同的表现型，但是显示出Syndecan-r.该结果表明，自身免疫倾向小鼠中的GANPM浆细胞生成，是通 过与为了对TD-Ag免疫应答而提供的相同刺激而被诱导的。经过在 GC进行増殖和分化的Ag驱动B细胞，有可能一面表达GANP， 一 面在更长的时间内处于浆细胞阶段，定位于红脾败区域.实施例2: GANP的过表达 (方法)1. 向Daudi细胞的稳定转染采用Gene Pulser II (Bio-Rad)，在Daudi细胞中对10 |i g经线性 化的pCXN-2小鼠GANP或GANPS /A502 cDNA进行电穿孔.48小 时后，利用G418 (Promega; lmg/ml)开始进行筛选，可以得到穗定表 达小鼠GANP的Daudi细胞.2. Daudi转染子的IgVH转录物的分析使用Trizol (Invitrogen)从所有细胞中提取总RNA,用已经报导 的方法制备cDNA (Kuwahara， IC等"Blood 95, 2321-2328 (2000)), 采用以下的引物及反应液对LVH3-CHlCji转录物进行扩増.扩增采用 Pfu Turbo (Stratagene).5，画LVh3引物5'-CTATAACCATGGACCATGGACATACTTTGTTC03'(序 列编号5)3，-XbaI-CHl-CM引物5，-TGCATGCATTCTAGAGTTGCCGTTGGGGTGCTGGAC-3，(序列编号6) 反应液组成dH20 19.5 pi反应条件941C 1分钟941C l分钟；621C 1分钟；72TC l分钟x35周期72 TC 10分钟41C用Ncol以及XbaI消化PCR产物，用凝胶纯化，与用Ncol-Xbal 消化的质粒进行连接反应.转化感受态细菌后，通过自动測序仪 (Applied Biosystems)确定由QIAprep试剂盒(QIAGEN)制备的少量质 粒DNA的碱基序列. 3. GANP-转基因(Tg)小鼠的制备导入基因，通过在pLG栽体的XhoI側，导入5.6kb的小鼠GANP 基因而制备.该栽体是具有人免疫球蛋白内含子增强子区域(2kb EcoRI片段)，可以在B细胞中强表达的特异栽体.对该基因进行线 性化处理后对小鼠进行基因导入。用微量注射法把含有小鼠GANP全 长cDNA的线性化的pLG栽体(Koike， M.等.Int.Immunol. 7， 21-30(1995))注入到C57BL/6小鼠的受精卵中，用小鼠尾的基因组DNA 以及以下的引物及反应液对导入基因的存在进行筛选.1-5，引物5'-TCCCGCCTTCCAGCT GTGAC.3'(序列编号7 )1-3，引物5'-GTGCTGCTGTGTTATGTCCT'3'(序列编号8 ) 反应液组成<formula>formula see original document page 31</formula>DNA (50 ng/ ul) 1 yl10x buffer 2.0 jj12.5边M dNTP迈ix 2.0 pll'5' primer (10 pM) 0.8 jil1-3， primer (10 |iM) 0.8 >ilZ'Taq DNA polymerase_0.1 ^1dH20_13,3 nl反应条件981C 5秒钟；591C 5秒钟；721C 10秒钟x35周期 41C4. RT-PCR用Trizol (Invitrogen)从脾脏或脾脏B细胞中提取总RNA;用2 种引物l-5，以及l曙3，进行RT-PCR，合成cDNA ( Kuwahara， K.等" Blood 95， 2321-2328(2000)).通过琼脂糖凝胶电泳检测GANP转录物.p-肌动蛋白转录物作为对照使用.5. 结果(1)使小鼠GANP在Daudi细胞上稳定表达的转染子V区域 基因的体细胞超突变(SHM)把GANP基因导入到在体外进行SHM分析所使用的各种人B淋 巴细胞中(Rogozin， 1. B"等，Nat. Immunol. 2， 530-536 (2001); Kuwahara，K.等"Blood 95， 2321-2328 (2000);以及Denepoux， S.等,， Immunity 6， 35-46 (1997)),在^艮多B细胞林上，不能进行转染，但 是可以在维持中把GANP基因导入到表达AID的Daudi B细胞中， 而AID —般不生成SHM.与野生型或假转染的细胞相比，该克隆在V区域可以显示出高频 率的SHM (5xl0々bp).用PCR对VH3-CHlCM的片段进行扩增，在质粒上进行亚克隆， 并进行测序.细胞变异的模式田示于困8A-C中.竖线"i"表示沉默突变(氛 基酸不变化)，另一个符号(竖线中带有*标记的符号)表示氨基酸 取代的变异.在Daudi/mock中几乎没有变异，但是Daudi/GANP-14， -15，-17，-21的4种克隆中，可以看到许多变异，虽然在程度上有 差别.在导入把与控制DNA引缺蘇活性相关的笫502位丝氡酸取代为丙氨酸的变异体(GANPS/A)转染子中变异出现的效率降低.SHM在恒定区基因上不产生诱导(图8A~C). GANP的RNA 引物酶活性通过S502的砩酸化进行调节，这一作用可以通过特异的 单克隆抗体进行检测(Kuwahara， IC等.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98， 10279-10283 (2001)).因为在体外以及体内的B细胞刺激都可以诱导 S502的碑酸化(Kuwahara, IC等.，Proc. Natl. Acad, Sci. USA 98， 10279-10283 (2001))，所以对于这种该砩酸化是否与Daudi B细胞中 的SHM生成有关系，进行了研究，当导入非砩酸化GANP变异体(GANP-S502A)时，不诱发SHM (图8A)，由此可见S502的裤酸化对在GC-B细胞中的SHM生成是非常重要的.(2)使GANP在B细胞中过表达的转基因小鼠 为了对免疫应答中GANP的参与情况进行研究，制备了在人Ig 增强子和启动子控制下使小鼠GANP过表达的GANP-转基因(Tg) 小鼠(图9A和B).用RT-PCR对GANP mRNA的表达亢进进行了 确认.该小鼠，显示在B细胞上GANP表达提髙(围9C)、在对骨號、 脾脏以及淋巴结的细胞表层标记分析中，显示B系细胞的一般分化.为了对SHM中GANP在体内的作用进行研究，对于TD-Ag的 NP-CG免疫后的VH186.2区域进行了研究，也就是每隔2周对GANP 过表达转基因(Tg)小鼠进行3次50NP-CG免疫，通过PCR对 VHl86.2进行扩增，并分析了体细胞超突变的情况.结果表示在困10中，变异救量在Tg中稍有增加，但是表示高亲 和性的笫33位W变化为L的变异(SHM)在Tg中约增加到3倍. CDR表示互补链确定区域.VH186.2基因座对高亲和性IgG(yl入l)NP-应答显示特有方式的 SHM.通过对用NP-CG进行免疫后的所有脾脏B细胞的序列进行分 析，表明与野生型小鼠相比，在GANP-Tg小鼠中，SHM频率只有少 量增加(困10).以前曾经报导过该变异对半抗原特异B细胞的亲和性成熟是重要 的(AHen， D.等"EMBO J. 1995-2001 (1988) ) 实施例3:制备B细胞特异的GANP缺失小鼠(B-GANP一小鼠) (方法)1. 建立CD19-Cre/+GANP flox小鼠使用GANP基因组DNA，通过在外显子II的下游插入抗新霉素 的基因(neo)制备靶向栽体.在neo3，側邻接区域和外显子I以及II 之间的内含子中导入lox P位点.也就是制备在外显子II中插入了 loxP序列的flox小鼠，使其与 CD19-Cre小鼠交配，建立B细胞中缺失GANP的小鼠(困11A以及 B),通过电穿孔法把经过线性化处理的靶向栽体转染到TT2 ES细胞 (Yagi， T.等"Anal. Biochem. 214， 70-76 (1993))中 用G418进行 选择后，提取出ES克隆，与蛋白蘇K一起进行孵育.通过使用下述 neo2引物以及CGK3，-2引物，对同源重组体进行筛选.neo引物5'*GCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT'3'(序列编号9)CGK3，陽2引物5'-QGCACCAAGCATGCACGGAGTACACAGA-3'(序列 编号IO)同源重组，通过使用探针A对用BamHI消化的ES克隆的DNA 进行DNA印记分析加以确认.使用显示4kb带的3个阳性克隆，通 过向ICR胚泡进行微量注射，制备嵌合体初代小鼠.通过DNA印记 法、RT-PCR以及细胞染色可以确认看不到GANP在B细胞中表达 (困11C、 D以及E),GANP flox+小鼠与C57BL/6小鼠至少进行10次回交.为了使B 细胞中的GANP基因缺失，使GANP-floxed小鼠与CD19-Cre敲除 小鼠(Rickert， R. C.，等.，Nucleic Acids Res. 25， 1317-1318 (1997)) 进行交配，2. FACS分析用各种生物素标记单克隆抗体，在冰上对来源于淋巴器官的单一 细胞悬浮物进行1小时的染色.用染色緩冲液清洗后，用FITC结合 链審抗生物素蛋白(Amersham Bioscience)以及PE结合单克隆抗体 对细胞进行1小时孵育.使用CellQuest软件通过FACScan(Becton Dicki加on)对淋巴细胞进行分析.3. B细胞的純化从Cre-floxZ+小鼠以及B-GANP 、鼠(7~8周龄)分离脾脏细 胞，用0.15M氯化铵援冲液进行处理，去除红细胞.在塑料盘上于37 1C孵育30分钟后，以未粘附细胞作为淋巴细胞进行回收，按照所附 的添加方案，使用Dynabeadsaiitimouse Thyl.2单克隆抗体(Dynal) 去除T细胞.通过使用FITC结合抗B220单克隆抗体(BD Pharmingen )的细胞表层染色确认B细胞的纯度(90°/。以上).4. 体外的增殖测定在含有10%热灭活的FCS ( JRH Biosciences), 2迈M的L-谷氨 酸以及5xlOsM的2-巯基乙醉的RPMI-l640培养基(含分裂促进剂 和不含分裂促进刑)中，在96孔的微量滴定板上，以2x10s细胞/孔， 对纯化的B细胞孵育48小时.用0.2pCi/孔的fH]-胸腺嘧啶脱氣核 苷(ICN)进行16小时脉冲后回收细胞，用闪烁扫描计数器对整合后 的放射活性进行测定.分裂促进剂，使用经亲合性纯化的山羊抗小鼠H链特异抗体(10 jig/ml)F(ab，)2(ICN)，大鼠抗小鼠CD40单克隆抗体(LB429; 10 lig/ml)以及LPS (Sigma; 10pg/ml),5. 抗原及免疫TNP-KLH、 TNP-Ficoll以及确基苯基-鸡Y球蛋白(NP-CG)(23 : 1)，是从Biosearch Technologies购入的.向Cre-flox/十小鼠以及B-GANP:小鼠的腹腔内注入50pg的TNP-KLH以及NP-CG (用铝沉 淀)，或25 n gTNP-Ficoll (溶解于PBS中).6. 抗原特异抗体产生的测定在施用抗原10天后和14天后，从免疫小鼠中回收血清.在ELISA 平板上褒盖5pg/孔的TNP-BSA(Biosearch Technology).用3%BSA 的PBS溶液对各孔进行封闭，与阶段稀释的血清一起进行孵育.用 PBS-0.1%Tween20进行清洗后，与生物素结合同种型特异的单克隆 抗体以及碱性裤酸酶(ALP)结合链審抗生物素蛋白(Sou他ern Biotechnology) —起进行孵育.显色，在有底物存在的条件下进行.为了求出血清中NP结合抗体的亲合性，通过在覆盖抗原中使用 NP2-BSA (每一个分子中有2个NP结合在BSA上)以及NP25-BSA (每一个分子中有25个NP结合在BSA上)(Biosearch Technology)的差示ELISA计算出NP2结合抗体相对于NP25结合抗体的比率.7. 免疫组织化学用丙酮对从免疫的小鼠中取出的8jLini脾脏切片稍微进行固定. 用3%BSA的PBS-Tween20的溶液对试样进行封闭，与抗IgD单克 隆抗体和ALP-结合大鼠IgG(ICN)抗体一起进行孵育.第一显色使用 Vector Blue试刑盒(Vector)进行.笫二显色是把试样与生物素结合 花生凝集素(PNA)(Vecor)以及辣根过氣化物醉结合链審抗生物素 蛋白(Kirkegaard & Perry) —起进行觯育，接着与3，3，-二氨基联苯 胺四盐酸盐(Dojindo) —起进行孵育.使用1%谷氨搭的PBS溶液 对试样进行固定后，用Aquatex(Merck)进行封固.8. Vh186,2基因的序列分析使用(4-羟基-5-碘-3-硝基苯基)乙Bit (NIP)，通过FACS Vantage(Becton Dickinson Biosciences)对来自用NP-CG免疫的Cre-flox广以及B-GANP-'-小鼠的NP曙结合IgGl加1 CD38" B细胞进行分 级，与蛋白酶K 一起在37TC下孵育一夜.利用裂解物，按照已经报 导的方法(Takahashi， Y"等Immunity 14， 181-192 (2001))实施2次 PCR.把Vh186,2基因DNA连接到pBluescript上，通过自动测序仪测定序列.9. 调亡细胞的检测用各种试剂对从Cre-floxZ+以及B-GANP-A小鼠纯化的B细胞进 行40小时的刺激(Watanabe，N.等"(1998) Scand.J.Immunol.47，541-547).进行AICD时，在24孔板上固定抗M抗体(5(>Mg/ml),在其 它情况下，用各种刺激物质对纯^ffc的B细胞进行48小时刺激，接着 用抗Fas单克隆抗体(Jo2;BD Pharmingen )进行4小时孵育(Wang， J.等"(1996) J,Exp.Med.l84，831-838 ),使用碘化丙锭(PI)溶液(50 Hg/mlPI，0.1% Triton X-100,0.1柠檬酸钠)，在室温下对细胞孵育1 小时，用FACS Gan作为Gl以下区域对细胞凋亡的细胞(％)进行 计算，调亡细胞还可以通过用台盼蓝进行染色后，在显微镜下进行确 认.10. TUNEL测定用SRBC (羊红细胞细胞)对Cre-floxZ+以及B-GANP-A小鼠进 行免疫后，分别制备脾脏切片，用4%多聚甲》的PBS溶液对冷冻切片进行固定.用MEBSTAIN Apoptosis KitII(MBL)对切片试样进行处 理，用PI进行对比染色.为了与TdT传递质dUTP-生物素-终端标记(TUNEL)检测一起进行实验，也可以对切片使用抗IgG，单克隆抗 体(BD Phar迈ingen)以及Alexa546结合山羊抗大鼠IgG抗体(Molecular Probes)进行染色.检测阳性信号，通过荧光显微镜(BX51;01ympus)对结果进行确认. 11.结果(1) RNA引物醉GANP的作用为了研究RNA引物醉GANP的作用，使用Cre^loxP系统制备成 为CD19+B细胞缺失GANP基因的B-GANP"小鼠(困11A和B). B-GANP;小鼠基因缺失大部分外显子II (困11C). B-GANP"-细胞不 表达GANPmRNA (困IID)，同时通过免疫染色，几乎不表达蛋白 质(困11E), B-GANP"-小鼠可以正常生长发育，并且在骨號、脾脏、 胸腺、淋巴结处显示正常数量的淋巴细胞，在流式细胞测量法分析中， B-GANP"-在骨號、脾脏以及淋巴结的细胞中，显示与对照的Cre-flox/+ 小鼠相同的表面标记轮廓(闺12 )，与Cre-flox/+ (对照)没有差別.在B-GANP"-的淋巴结处，表达slgM^sIgD1^的成熟B细胞 (IgM+IgD+)的数量减少.来源于B-GANP-"小鼠的B细胞在体外通 过抗H抗体、抗n抗体+抗CD40单克隆抗体、或脂多糖进行刺激后， 显示一般的增殖应答(困13: B-GANP"为白色柱，0^1( /+为黑 色柱).另一方面，来源于B-GANP:小鼠的B细胞，通过抗CD40单 克隆抗体(5, 10Mg/mL)刺激后，增殖活性降低(
图13).该结果 表明在B-GANP,小鼠的B细胞增殖中，对CD40/CD145相互作用的 反应，只受到很少的损害.血清Ig量与Cre-floxAH、鼠相同(困H),(2) B-GANP一小鼠中抗原特异的抗体产生 本发明者研究了通过TI-Ag以及TD-Ag进行免疫后B-GANP"-小鼠的免疫应答.在进行TI抗原的硝基苯基(TNP) -Ficoll免疫14天 后，通过ELISA测定了抗TNP抗体价数.结果表明(TNP) -Ficoll 在B-GANP"小鼠以及Cre-flox/如J、鼠中，可以诱导相同的应答，没有 特别差异(困15).小鼠相比，变异体小鼠显示滞后的GC形成.关于GC形成的峰应答，Cre-flox/+，在笫10天显示出用GC-B 细胞标记物花生凝集素进行染色的很成熟的GC (困16的箭头).在 进行免疫10天后，B-GANP一一方的GC形成较少.但是在14天后与 Cre-floxZ+相比，B-GANP々形成的GC数量增多，即使是在20天后 GC形成仍在延续(困16箭头).B-GANP-M、鼠，在笫14天显示出形成了清晰的GC，所以测定 了抗原特异的抗体应答(图17).在用TD抗原的TNP-KLH进行的 免疫中，到第10天为止，B-GANP一小鼠仍不显示清晰的GC，抗体 价数几乎没有差别，但是在用TNP-KLH进行免疫后的第14天，在 B-GANP"-中显示出GC的阶段性增加和扩大(图17).变异体小鼠对 于TNP-KLH，显示出与Cre-floxAH、鼠相同的抗体应答. (3) B-GANF"小鼠中亲和性成熟的障碍为了进一步研究B-GANP一小鼠中GC的特征(抗体应答是低亲 和性的)，用NP-CG对抗原特异的IgGl+GC-B细胞免疫后进行了研 究.通过使用具有不同分子量NP半抗原/蛋白质结合的差示EUSA 与相对于多半抗原NP25-BSA结合的应答进行了比较.B-GANP"-小鼠中，对于NP2-BSA结合的抗体应答，在NP-CG 免疫后第35天，是低亲和性(13%)的.该值与Cre-floxZ+小鼠的值 (42°/*)相比，抗体反应明显降低(困18).此外如困19所示，NP-特异的IgGld""CD38^B细胞，在B-GANP"-小鼠中明显减少(困18).也就是在免疫后第10天，在Cre-floxZ+小 鼠中，为1164细胞/106细胞，相对在B-GANP-M、鼠中，为88细胞/106 细胞.此外在第14天，在Cre-flox/十中，为8179细胞，相对在B-GANP'-中，为83细胞.在第20天这一倾向也是相同的，与此相比，IgGlh妙CD38畊记忆B细胞没有减少，这些结果表明 GANP无表达变异在IgGl一CD38^GO细胞阶段会使B细胞分化中 产生缺陷.为了确认B-GANP-M、鼠中抗体亲和性成熟减少，对用NP-CG免 疫后的脾脏B细胞VHl86.2区城的序列进行了研究.由于SHM是在B细胞分化的该阶段产生的，所以对于VH186.2基因座的SHM,研究了各种纯化的B细胞.并且VH186.2基因座可 应用于高亲和性IgG(yl入l)NP-应答(Cumano， A. & Rajewsky， K (1985) Eur. J. ImmunoU5， 512-520 ) 与Cre^flox/+;fB比，IgM位点没 有差异，接着对Cre-floxZ+或B-GANP"-进行NP-CG免疫，对于显示NP-结合IgG,弱阳性CD38弱阳性的GC-B细胞(Ag-结合IgG,B细胞) 进行分类(困19),从分类后的细胞中提取出基因组DNA，对Val86.2 进行PCR扩增，并进行测序分析，对VH186.2序列进行了比较(困20A ~ L).困20A ~ F是对Cre-floxZ+的VH186.2序列，困20G ~ L是对B曙 GANP-a的VH186.2序列进行比较的情况.B-GANP一小鼠中，IgV区域序列的所有变异为14xl03，与Oe-flox/十小鼠(21 x 10-3)相比，变异的数量减少(困21 ) 由W33到L 的高亲和性型变异(在C57BL/6小鼠中，可以清楚看到从第33位氨 基酸残基色氨酸到赖氨酸的变异，)为13% (2/15V区域)，在变异型 小鼠中，与Cre-floxZ+小鼠的值(71%， 10/14V区域)相比较，减少 得更明显，亲合性下降到1/3 (困22).以上结果表明GANP对于抗体亲合性成熟是必要的. (4 ) B-GANP一小鼠B细胞中不受细胞凋亡影响的保护功能可以认为，B-GANP;小鼠中，髙亲和性抗体产生减少是由于抗原 刺激后的B细胞不穗定所致.于是为了对B细胞的感受性进行研究， 对在体外B细胞的细胞拥亡进行了研究.正常的B细胞是通过强力交联的B细胞抗原受体而诱导活化诱导 细胞凋亡(AICD)的.通过CD40的刺激作用，可以阻止AICD.在 B-GANP"-B细胞中，对于AICD刺激的感受性程度与正常B细胞(对 照)是相同的，但是关于通过抗CD40的细胞凋亡的抑制程度，比 Cre^lox/十对照B细胞还要低(闺23).该结杲表明，B-GANP 、鼠 在GC形成期期间，缺乏对抗原反应性B细胞的保护功能.在GC中，通过经抗原刺激的B细胞和CD40/CD154的相互作用， 诱导Fas/CD95的表面表达，使Fas诱导性细胞凋亡具有感受性.于 是本发明者对B-GANP-'-B细胞对于在体外诱导细胞凋亡的抗CD95刺激的感受性进行了测定.首先，用抗CD40羊克隆抗体(LB429)、抗n抗体+抗CD40单克隆抗体、il-4抗cd糾单克隆抗体以及抗m抗体+il-4+抗cd40单 克隆抗体对脾脏B细胞进行48小时刺激,接着向培养基中添加抗CD95 单克隆抗体.结果表明B-GANP"小鼠B细胞的细胞凋亡应答与06^1( /+小鼠 B细胞的应答相同，细胞凋亡应答在B-GANP-"小鼠和Cre-flox/十小鼠 中没有差别(困24).如上所示，即使在CD40 ( LB429 )处理后，用抗CD95进行刺激， 表达诱导在B-GANP 、鼠和Cre-floxAH、鼠中也没有差別，该结果表 明在B-GANP;小鼠B细胞中，在体内，通过gc-B细胞作用，对于 一般接受的细胞凋亡刺激具有感受性.于是作为TD-Ag，使用SRBC 进行免疫后的组织切片进行了 TUNEL测定.结果TUNEL阳性细胞，在B-GANP'"小鼠的GC区域增加，大 部分细胞都显示为表达IgGl(困25、 26).这些结果表明B-GANP一 小鼠的凋亡细胞大部分是GC-B细胞.(闺25、 26).接着对各种恶性淋巴瘤细胞以及被识别为对抑制正常B细胞CD糾 介导性细胞^亡所必要的分子Bcl-2家族成员的RNA表达进行了研 究.如果用抗M抗体+IL-4进行刺激，诱导Cre-flox/+B细胞中的bel-2转录的明显增加，抗CD40mAb进一步对其表达进行上调(困27). 另外在B-GANP一B细胞中，显示了与由抗ii抗体引起的bcl-2转录物 相同的上调，但是对于抗CD40mAb (单一的抗CD40mAb或抗p Ab+IL4+抗CD40mAb )的应答却没有Cre-flox/十的B细胞那样髙(图 27),也就是参与抑制细胞凋亡的Bcl-2家族的RNA表达水平，在用 抗CD40抗体进行刺激时的B-GANP"-细胞中，比对照物的表达水平 还要低(困27),关于变异B细胞中的bcl-XL、 bax以及bad与Cre-flox/+B细胞 中的水平程度相同(困27).以上结果表明GANP在B细胞中，控制与通过CD-40的Bcl-2诱 导有关的信息传递，有助于在体内的高亲和性BCR+B细胞的生存. (5)总结B-GANP小鼠和GANP-Tg小鼠的结果证实，GANP与用YD-Ag 进行免疫后高亲和性B细胞的生成有关.作为GANP的作用有可能是在GOB细胞中，介导对DNA聚合蘇的有效补充(y夕A—卜) 和调节.如果具有V-区域SHM的GC-B细胞取得髙亲和性BCR，就 应该能够对它们进行筛选，并且还可以使B细胞V区域的SHM得到 抑制，在体内就应该可以保证产生高亲和性抗体.在gc-B细胞上的 AID表达有可能不断生成DNA变异，所以为了在B细胞中维持高亲 和性BCR，也许AID活性调节是有必要的.在B-GANP'M、鼠中的结 果表明GANP对于SHM加工是必要的.实施例4:使用GANP转基因小鼠制备高亲和性抗体1. 通过差示ELISA进行的抗体价数比较分别对野生型(WT)小鼠和GANP转基因(Tg)小鼠各2只进 行np-cg100 m g的免疫，28天后采集血清，进行elisa.用20 n g/ml 的NP2-BSA和NP17-BSA对ELISA平板在4t!下包被过夜.用 3%BSA/PBS-0,1% Tween 20固定l小时，使血清反应1小时.用PBS-0.1% Tween 20清洗3次，以生物素标记抗小鼠IgG,抗体(Southern Biotechnology)反应1小时.用PBS- 0.1%Tween 20进行3次清洗， 以碱性礴酸酶标记的链審抗生物素蛋白(Southern Biotechnology)反 应30分钟.用PBS-0.1% Tween20清洗3次，用TBS清洗1次，以 砩酸对硝基苯酯作为底物使其显色，在405nm处测定吸光度，结果示于闺28中.图28的结果表明，通过使用GANP转基因小 鼠可以产生髙亲和性抗体.2. 使用ELISA以及Biacore的抗原-抗体结合亲和性分析 对野生型(WT)小鼠和GANP转基因(Tg)小鼠，使用NP-CG作为免疫抗原进行免疫，分別使用各小鼠进行细胞融合，在得到的阳 性杂交瘸培养上清中，使用ELISA法以及Biacore，得到抗原抗体反 应的结合曲线.从所得的结合曲钱，推导出Tg小鼠的可用性，(1)材料(a) 动物野生型(WT)小鼠和GANP转基因(Tg)小鼠.(b) 抗体及试刑使用NP16-CG (每一个分子中16个NP结合在CG鸡免疫球蛋 白上)、NP2-BSA (每一个分子中2个NP结合在BSA (牛血清白蛋白)上)、NBH-BSA (每一个分子中17个NP结合在BSA上)、HRP 标记抗小鼠IgG、 IgA以及IgM. (2)方法及结果以NP16-CG作为免疫抗原，每隔2周对野生型(WT )小鼠和GANP 转基因(Tg)小鼠各5只进行3次免疫，3次免疫后采集血样，使用 抗血清对抗体价数进行比较，与前述1項中所述的结果相同，可以确 认GANP-Tg小鼠的可用性.其中，使用效价髙的小鼠脾细胞，与P3U1骨號瘤细胞实施细胞 融合，根据G ANP-Tg小鼠的脾细胞数(6.0xl(T个)、WT的脾细胞 数(4,8xl(T个)，进行整合，使细胞达到lxl0V孔，在HAT培养基 中对来源于GANP-Tg小鼠的细胞600克隆，来源于WT小鼠的细胞 480克隆进行培养,使用HAT培养9天后的培养上清，以NP2-BSA (lpg/迈L)作 为固相化抗原，实施ELISA法.分别从GANP-Tg小鼠和WT小鼠 的培养上清中，筛选出在ELISA吸光度结果中显示高亲和性抗体的 产生高出2.5%的克隆，用HT培养基克隆.使用HT培养9天后的培养上清，以NP2-BSA (1 ng/mL)作为 固相化抗原，实施ELISA法的结果，GANP-Tg，建立了 6种克隆(克 隆名称G2-6、 G2-9、 G2-12、 G2-14、 G2-15、 G2-16)、 WT建立了 l种克隆(克隆名称W2-7)的杂交瘤.把GANP-Tg小鼠、WT小鼠的各克隆在RPMI培养基中进行培 养，确保每种克隆中有1迈L适用于以下实验的培养上清，使用该培 养上清，进行以下评定分析. (a ) ELSA法在评定抗体价数的过程中，使用抗原性质不同的物质，即所谓每 分子CG中NP含有比率不同的物质，以其ELISA反应性的比率进行评定.本方法是可用于对NP亲合性进行测定的方法，简便并且可以进 行多种检查，所以作为一次性筛选是适宜和可靠的.首先，分别以NP2-BSA (l|ig/mL)和NP17-BSA (lpg/mL) 作为固相化抗原，在4TC下进行一晚的固相化，用PBS-Tween20对固 相化平板进行清洗后，用脱脂乳-PBS-Tween20实施封闭.再用PBS-Tween20对平板进行清洗后，使用GANP-Tg小鼠的6种克隆(克隆 名称G2-6、 G2-9、 G2-12、 G2-14、 G2-15、 G2-16)以及WT小鼠 的l种克隆(克隆名称W2-7)的RPMI培养上清(原液~256倍稀 释液)在室温下使其与固相化抗原反应1小时.接着用PBS-Tween20 对平板进行清洗后，使HRP标记抗小鼠IgG、 IgA以及IgM在室温 下反应1小时.再用PBS-Twee迈20对平板进行清洗后，用邻苯二胺 (OPD)进行5分钟显色，采用2N硫酸终止反应.采用ELISA READER,在490nm处测定吸光度.把ELISA的结果表示在图29中.由困29的结果分析可知，通过 使用GANP-Tg小鼠可以产生高亲和性抗体. (b)使用Biacore的髙亲合性分析采用Biacore对上述ELISA的结果中，被认为是亲和性最高的克 隆的物理化学结合能力进行了研究，用Biacore进行分析是在以NP2-BSA (ljig/mL)作为配位体而 结合在Biacore顶部的克隆中，采用一般认为作为分析(7*大，4卜) 溶液亲和性最高的Tg(G2-9)，亲合性最低的Tg(G2-15)以及WT (W2-7) 3种克隆的RPMI培养上清，分别计算出结合速度常数(k ass)、解离 速度常数(Kdiss)以及作为亲合性指标的解离常数KD(KD-kdiss/k ass)， 一般认为KD越小，亲和性越高.作为结果，把G2-9 (ELISA: 82.9% NP2/NP17比)的Biacore 图形表示在围30中。图30所示曲线(a) - (e)是抗体浓度分别为 26.6、 13.3、 6,65、 3.33以及1.66nM的困形,从上述结果可以了解到，结合速度常数(k ass) -1.48x10s，解 离速度常数(k diss )-9.63x104，作为亲和性指标的解离常数KD( KD=k diss/kass) =6,50xl(T9,另一方面，把由ELISA的结果中，认为亲和性比较低的G2-15 (ELISA: 33.9% NP2 / NP17比)的Biacore困形表示在困31中. 困31所示的曲线(a) ~ (e)是抗体浓度分別为23.0、 11.5、 5.75、 2.28以及1.44nM的困形.结合速度常数(k ass) =5.33 xlO4，解离速度常数(k diss) =1.56xl0-2，作为亲和性指标的解离常数KD (KD-k diss/k ass) =2.92xlO_7.该值近似于在ELISA法中也显示相同亲和性的W2-7(ELISA: 31.6% NP2/NP17比)所具有活性的KD值=1.67乂10-7,从以上述情况分析，通过使用GAPN转基因(Tg)小鼠，可以产 生高亲和性抗体这一点是很明确的.实施例5: GANP和MCM3的締合、细胞周期中的核/细胞质之间的 移动1. 概况本实施例中，本发明者通过使用部分断裂型变异体GANP，确定 GANP的MCM3结合区域，采用GANP特异区域中相对于笫502位 氨基酸的礴酸化丝氨酸(pSe产2)特异的单克隆抗体，使NIH-3T3细 胞中的GANP具有定位的特征.引物醉和MCM的结合，是一个连动的功能，二者结合的分子复 合体具有从双链中解开DNA的作用，因此可以认为如果GANP部分 片段与MCM结合，則该GANP片段也可以发挥引物酶的活性，具有 产生高亲和性抗体的作用.于是采用cDNA转染和细胞融合实验对GANP及其部分片段、 Map80及MCM3的核/细胞质区域的定位进行了分析，通过所得数据，可以表明GANP和MCM3结合，还可以表明GANP 的定位受MCM3表达的影响.GANP是通过与Map80结合机理不同 的结合机理与MCM3締合的.这些结果表明结合在MCM3上的GANP 是通过与Map80 / MCM3AP功能完全不同的独特功能而结合的 2. 材料及方法2. 1.细胞及细胞培养把NIH-3T3、 COS7、 Hela以及Swiss-3T3细胞在10%热灭活FCS(大日本制药)、2mML-谷氡酸(Biowhittaker )、 100 p g/ml链審素、 100U/ml青審素以及补充50 jiM 2-巯基乙酵的D-MEM培养基(Invitrogen)中，于371C、 5% C02的条件下进行维持(Takei， Y. 等.，(1998)J. Biol. Che迈，273， 22177-22180 、 Sakaguchi， N, 等"(1988)EMBO J. 7， 3457-3464、 Kimura，H.等,(1995) Nucl. Acids Res* 23， 2097-2104). BAL17在RPMI-1640培养基(Invitrogen)中进行培养.2. 2.礴酸化GANP及MCM3的细胞内定位在PBS(pH7,4)中，用3.7。/。多聚甲^对NIH-3T3固定5分钟，再 使用0,2% Triton X-100进行渗透(Kimura， H.等.，(1994) EMBO J.13, 4311-4320 ) 使用大鼠抗pSer狐GANP单克隆抗体(Kuwahara, K.等" (2001) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 98， 10279-10283)以及兔抗MCM3 抗体(Kimiira， H.等"(1994) EMBO J, 13， 4311-4320)作为一次抗体， 接着对于GANP使用Alexa 488结合山羊抗大鼠IgG抗体(Molecular Probes)作为笫二抗体；对于MCM3使用Alexa546结合山羊抗兔IgG 抗体(Molecular Probes)作为第二抗体，用碘化TOTO-3 (Molecular Probes)进行对比染色，并且用共焦激光扫描显微镜(FV500; OLYMPUS )进行观察. 2. 3.用于表达的cDNA构建体关于pSRct-MCM3-HA，在文献中已有介绍(Kimura， H.等.，(1995) Nucl. Acids Res23， 2097- 2104),栽有SV40T-Ag的3个核定位信号(NLS)的pECFP-Nue栽体，从Clontech购入.把利用以下组合的 3，和5，引物所得到的PCR片段导入到pGEX-4T-l (A迈ersham)，利 用所得的质粒使不同型小鼠g朋P cDNA表达为与谷光甘肽-S-转移酵(GST)融合的融合蛋白质.GANP1.5' : 5'.GGGGATCCATACCCGG TGAACCCCTT.3' 沐列编号1 1) GANP1.3' : 5''GGGTCGACGCGCACAGACTTTCCCCTGA'3，沐列编号1 2) GANP2.5' : 5',GGGAATTCTCCCGCCTTCCAGCTGTGAC-3'伴列编号1 3) GANP2'3': 5''GGGTCGACGTGCTGCTGTGTTATGTCCT-3，沐列编号14) GANP3-6' : 5，-GGGAATTCCATQAGCT GAGACCCTCAGC-3，沐列编号1 5) GANP3'3': 5,.GGGTCGACTGAGGATGCAGGAGGCGGCT .3， 列编号1 6) GANP4.5, : 5'.GGGAATTCTACGTTGGAGAGAGCCTGGC.3'沐列编号1 7 ) GANP4-3， 5'.GGGTCGACCATGCTGTCATCTCCTGTGA.3'沐列编号1 8)GANP5.5, GANP5'3' GANP6.5' GANP6.3， GANP7-5, GANP7'3'5'-GGGAATTCGAGAA CCTGGCCAAGGGTCT-3，5'-GGGTCGACGAAAAACCGACGGCTGAACT'3'5,'GGGAATTCAAGCCCTTCCAGCCTGCCCT.3，5，-GGGTCGACCGAGGGAACGTGGTATTTTC-3，5'.GGCCCGGGCC CGTGGGATGACATCATCA.3'5,■GGCTCGAGCATGTCCACCATCTCCAGCA.3,沐列编号l 9) 沐列编号2 0) 沐列编号2 1) 沐列编号2 2) 沐列编号2 3) 沐列编号2 4〉cDNA构建体，是通过把PCR片段导入到pSVEGFPpA中，作 为对绿色荧光蛋白质(GFP)进行标记的Ganp变异体而制备的 (Kuwata， N.等.，(1999) J. Immunol. 163， 6355-6359 ) 接着把这些 构建体导入至pCXN2哺乳动物表达栽体中(Niwa， H.等"(1991) Gene 108， 193-200).引物序列按照如下序列进行设计，以对Ganp进行编 码.Gp诊5':5'-GGGGATCCGAATTCCACCATGGCAGTCTTCAAACCGATA CC'3'(序列编 号2 5)5'.GCAGGGGCTCCTCCTGATCT'3' 沐列编号2 6)5,.GGGGATC CGAATTCCACCATGTCCGAGGGCCTTGGTTCTTG.3' G^列 编号2 7)5'-CTGTCTT GTTTCTAAGCCGC.3' 沐列编号2 8 )5'-GGGGATCCGAATTCCACCATGGAGA ACCTGGCCAAGGGTCT-3,沐列 编号2 9)5'.GAGGACTTGTAGATGTTTTCACCATGG.3，沐列编号3 0)使用以下引物通过PCR得到的cDNA片段导入到pCXN2中，由此构建FLAC标记的Ganp变异体.5'-GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGG CAGTCTTCAA CCGATACC'3'沐列编号3 1)5'-GGGAATTCCTCCGGGTCTCCCTCAAGTA'3'沐列编号3 2)5，'GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGTCCGAGGGCC TTGGTTCTTG-3'沐列编号3 3)5，'GGGAATTCGCTGTCTTGTTTCTAAGCCG-3' (^f列编号3 4) KMG'GinaW :5'.GGGAATTCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGG AGAACCTGGC.CAAGGGTCT'3，沐列编号3 5)5'.GGGAATTCTGAGGACTTG TAGATGTTTT'3'沐列编号3 6 )关于内部缺失变异体GpANLS-GFP以及13变异体(MCMA NLS-HA)，按照文献中所介绍的方法进行制备(I迈ai， Y.等.，(l外l) Nucl. Acids Res. 19， 2785-2785).所有的构建体，通过确定核苷酸序 列来确认其具有正确的方向以及作为带有标记的融合蛋白质表达时具 有正确的密码阅读框.由此控制其品质，具有变异体RNA/DNA引物 酶结构域(PD )的表达栽体在文献中已有介绍(从Ser鄉到 Ala[GpS502A或GIu[GpS502E的Gp变异体)(Kuwahara， K.等" (2001). Proc. Natl. Acad. Sci, USA 98,10279-10283 ) 2. 4.用共焦显微镜检查转基因产物用FuGENE 6( Roche Diagnostics )，以pCXN2画ganp-gfp和/或pSR a-MCM3-HA转染NIH-3T3细胞.在进行固定的16小时之前，向培 养的培养基中添加细審素B (LMB;(Kudo， N,等.，(1999) Proc. Natl. Acad, Sci, USA 96， 9112 - 9117 )，共转染时，使用兔抗HA抗体(SantaCruz)以及AlexaS46结合山羊抗兔IgG抗体；当进行单独转染时， 使用Alexa488结合山羊抗兔IgG抗体(Molecular Probes),对外源 MCM3蛋白质进行染色.核酸，在共转染实验中采用棟化TOTO-3; 单独转染实验中采用硤化丙锭(PI; Sigma)进行对比染色. 2. 5. GST引入測定按照文献中所介绍的方法对GST融合蛋白质进行纯化(Kuwahara， K.等"(2000) Blood 95， 2321-2328),对固定在谷胱甘肽-S印harose微 珠(Amersham)上的各种GST融合蛋白质(Sjig)与使用TNE緩 沖液(10 mM Tris-HClpH 7.8、150 mM NaCl、 1 mM EDTA、 1% Nonidet P-40、 10 ;ig抑肽酶、1 mM苯基甲基-磺酰象PMSF))制 备的BAL17裂解物一起孵育.通过8%SDS-PAGE对结合蛋白质进行 分离，转到硝酸纤维素过滤膜上，进行封闭.接着将滤膜与兔抗小鼠 MCM3抗体(Kimura，H.等.，(1994) EMBO J.13, 4311-4320)以及过 氣化物酶标记蛋白质A (Amersham)进行连续孵育，最后采用ECL 检测试刑盒(Amersham),对信号进行可视化处理.为了直接对结合 进行检测，使用"S-甲硫氨酸(Amersham),按照制造厂家的说明书 使用体外转录以及翻译结合装置(Novagen)合成放射性标记MCM3， 通过放射自显影术对产S-标记MCM3进行检测. 2. 6.转基因产物的免疫沉淀及免疫印迹法用FuGENE6，通过pCXN2-FLAG-ganp和/或pSRa-MCM3-HA 对COS7进行转染.26小时后，使用TNE緩冲液对细胞进行裂解， 对所得的裂解物和与蛋白质A-Sepharose (Amersham)组合的抗HA 抗体一起进行醉育.通过8%SDS-PAGE对免疫沉淀物进行分离，转 到硝酸纤维素过滤膜上，进行封闭.接下来，所述滤膜与抗小鼠FLAG M2抗体(Stratagene) —起进行孵育，接着与过氣化物蘇标记山羊抗 小鼠IgG(H+L)抗体(Zymed) —起进行孵育.为了检测Gp-GFP及 其变异体，通过兔抗GFP抗体(Santa Cruz)以及过氧化物醃结合蛋 白质A (Zymed)钓(probe)经印迹的过滤腹. 2. 7.异核体检测使用FuGENE6，通过pSRa-MCM3-HA对Hela细胞进行转染. 20小时后，对转染的Hela细胞以及没有转染的小鼠Swiss-3T3细胞 进行胰蛋白醉处理，以1 : 1的比率同时接种到培朱m中.24小时后，在室温下，使用聚乙二醇1500 (Roche diagnostics)对细胞进行2分 钟融合(Schmidt-Zachmann， M. S.等"(1993) Cell 74， 493-540).用 培养基对培养皿进行4次清洗后，添加含有环己亚胺的培养基，(最 终浓度为20pg/ml)，在C02醉育箱中，于371C下对细胞进行5小时 醉育.接着在2S0mM HEPES-NaOH (pH 7.4)中，用4。/o多聚甲搭 对细胞进行20分钟固定，使用0.5%Triton X-100的PBS溶液处理30 分钟，使细胞具有渗透性，用PBS进行清洗.使用抗HA抗体(12CA5; Covence Research Products )以及Cy3结合驴抗小鼠Ig抗体 (Jackson)对细胞进行染色，还使用100ng/迈lHoechst33342 (Sigma) 的PBS溶液对DNA进行20分钟的对比染色，使用具备lOOx PlanNeofluar相位差物镜(NA1.3 )以及SpotIICCD的Zeiss Axioplan收集困象.3.结果与观察拫告3. 1. GANP与MCM3的締合到此为止，通过共免疫沉淀证实了在B细胞系中的GANP与 MCM3的相互作用(Kuwahara， K.等"(2000) Blood 95， 2321-2328), 由于GANP的C末端结构域和所有Map80蛋白质相同，所以可以预 测GANP在该结构域与MCM3进行締合.为了确定哪个区域直接与 MCM3締合，本发明者使用如困32中所示的具有各种截短的GANP 蛋白的GST融合蛋白进行引入測定.使GST与困32所示的1至7 以及被称为5-7，的截短的GANP的N末端融合.困33下困中被称为 GANP5-7，的Map80结构域，如前所示(Kimura， H.等"(1994) EMBO J.13, 4311-4320)、由细胞提取物对MCM3进行引入.一个惊人的发现是GANP的部分片断即GANP1以及GANP2还 可以引入MCM3 (闺33的上围以及下困).接着通过网织红细胞裂解物系统，采用在体外进行合成的MCM3 对该结合进行了研究(困34). GST-GANP1以及GST-GANP2，也 可以由体外翻译"鸡尾酒混合物"引入了产S1-MCM3.单纯使用GST的阴性对照(第一道)，或与无关蛋白质进行融合 的GST没有显示信号.并且与GST-GANP1的结合比与Map糾区域 (GST-GANP5-7，)的结合更强.该结合也可以通过使用用FLAG标 记的构建体的DNA转染实验，在细胞中加以确认(困35).使COS7细胞与pCXN2- FLAG - Ganp、 pCXN2 - FLA&Gp以 及pCXN2-FLAG^Gmap80，结合pSRa-MCM3-HA或pSRa-I3-HA 进行共转染.经使用抗HA抗体的免疫沉淀后，用抗FLAG单克隆抗 体进行免疫印迹.在各道中用三角表示FLAG标记蛋白质的预计大 小.虽然左困和右困中的带的迁移是相同的，但是ECL检测的暴光 时间，左困是1分钟，右图是3分钟(闺35).FLAG"Ganp、 FLAG-Gp以及FLAG-Gmap80与野生型MCM3-HA (对HA抗原表位标记的MCM3)结合(困35左图).只有FLAG-Gsac没有结合.关于与13变异体MCM3 (MCM3ANLS)的结合， 只有FLAG- Gmap80呈现阳性结果(困35;右图).带有N末端NLS 的Gp区域，在具有大量MCM3的细胞中， 一直与MCM3締合(图 35;左困).这些结果表明GANP通过Gp区域与MCM3的NLS区 域締合.本发明者还研究了 Gp区域的Ser^的磷酸化状态是否对与MCM3 结合有影响的问題.使缺失引物酶位点的Ganp变异体(Ganp厶PD-GFP )以及作为GanpS502A或GanpS502E而制备的Ser仰2中的Ganp 变异体与GFP融合(困36A).与pCXN2-Ganp-gfp和pSR cx-MCM3-HA共转染细胞，裂解液用于使用抗HA抗体的免疫沉淀.通过抗GFP抗体可以检测出GFP信号(困36B;上困)，这意味 着GANP已结合在MCM上.同样也进行与Ganp-GFP变异体的共转染.为了确定各蛋白质的 预想位置，在SDS-PAGE上对裂解液进行分离，同样用抗GFP抗体 进行印迹(困36B;下困).非礴酸化性变异体(GanpS5(WA-GFP )与类似于野生型Ganp-GFP 或礴酸丝氨酸的变异体(Ganp S502E-GFP) —样与MCM3结合(困 36B;上困)，非常有意思的是GanpAPD-GFP没有与MCM3-HA产 生共沉淀(困36B;上困)，与Map80区域的潜在结合活性无关，GANP分子作为整体对其 与MCM3的结合而言，RNA引物酶区域(PD)是必要的.空白三角 表示Ganp厶PD-GFP的位置.用,果三角表示与Ga耶SS02A-GFP以 及Ganp S502E-GFP大小相等的Ganp-GFP的大小(田36B;下困)， 这些结果表明GANP与MCM3结合通过该PD区域，但是在SerSM部位的裤酸化不影响这一结合.通过使用截短的构建体的实验，可以显示GANP与MCM3在广 泛区域内的締合. 一般认为MCM3的NLS对于与GANP末端600 个氨基酸区域相关的所有GANP结合，是必要的.缺失NLS的MCM3 变异体在细胞中没有能够与所有GANP分子产生有效締合.Map80 区域与NLS阴性MCM3结合，这一情况表明GANP与MCM3的结 合主要是和其与Map80相互作用中所必需区域以外的区域结合.虽 然可以认为Map80是MCM3输入因子，但是也许GANP与MCM3 同时起着不同的作用.可以认为GANP具有多个有潜在的砩酸化部 位，并且在细胞中具有多个締合成分(Kuwahara，K,等.，(2000) Blood 95， 2321-2328),因此必需明确指出该区的砩酸化状态对GANP/MCM3 締合以及细胞质与(细胞)核区域之间的输送调节有影响的区域. 3. 2.由转染所显示的Map80和Ganp变异体在细胞内的定位GANP有两个有潜在的NLS. —个在N末端引物酶区域内，另一 个在C末端Map80区域内.同时GANP还具有两个核输出信号(NES) 样基元. 一个在与SAC3同源的结构域和Map80结构域之间，另一 个在Map洲结构域之内.用pCXN2漏Ganp醫g印或pCXN2陽G迈ap80-g印对NIH-3T3细胞进 行转染，48小时后进行固定.在进行固定的16小时之前添加LMB， 用PI对核进行预染色，采用共焦显微镜采集困象.把代表性的表达 特性表示在困37中.对具有不同特性的细胞进行计数，用百分数表 示(围37).Ganp-GFP (用GFP进行标记的几乎GANP全长)，显示核显性 表达(N以及N>C; 38% )或细胞质显性表达(C以及ON; 31% ) 的细胞比例有变化(从总计500个细胞中任意计算数的％)，但是可 以发现Ganp-GFP存在于细胞质以及核区域双方(困37; Ganp-GFP， LMB-),而对照试样中大部分Gmap80-GFP可以在细胞质中找到， 没有显示按照发明者分类的核显性表达(N>C，0%; N=C，35%; C和 ON，65Vo)(闺37; Gmap80-GFP,LMB-), Ganp國GFP的定位不同于 Gmap80-GFP的定位.为了确认N末端NLS基元是否为功能性的，使带有RNA/DNA 引物醉结构域以及N末端NLS(但是不含NES样基元)的5，l-kb DNA片段与GFP融合(困38, Gp-GFP)。该Gp-GFP产物只存在于核中 (N以及N > C，94%)(闺38).可以确认缺失NLS的变异体Gp-GFP(GPANLS-GFP;如困38所示缺失氨基酸497至500)是细胞质 性的，N末端NLS与核定位有关系.本发明者对邻接的Sei^向丙氨酸的突变(GpS502A-GFP;非礴酸 化型)或向谷氨酸的突变(GpS502E-GFP;仿磷酸丝氨酸型)是否对 该定位产生影响进行了研究(闺38).并且本发明者观察到这些突变 不改变Gp的定位.这表明N末端NLS与Ser^的礴酸化状态无关， 是功能性的(困38).作为对照，可以认为既没有N末端NLS也没 有C末端NLS的Gac-GFP大部分存在于细胞质之中(N以及NXT,0。/。； N=C， 3%; C以及ON,97% )(困38),这些结果表明，在Ganp向核的移入过程中，N末端NLS具有功 能性作用，但是，也许NLS不是那么强烈地維持GANP在核内的表 达，因为Ganp-GFP也存在于细胞质之中(困37).为了进一步对这 个问趙进行研究，为了抑制向通过Crml为媒介向核中输出，在cDNA 转染后，用细霉素B (LMB)对细胞进行处理(Kudo，N.等.，(l"9) Proc.Natl,Acad.Sci.USA 96， 9112-9117 ) 在用LMB处理的细胞中，在大部分转染子中，Ganp-GFP在核 中进行定位(图37).显示显性细胞质表达的细胞部分从31%减少到 4%，而形成鲜明对比的是在核中显示显性表达的细胞从38%增加到 81%,因此可以认为Ganp向细胞质中的迁移是受LMB抑制的，Gmap80-GFP的定位在LMB处理后也有很大变化(困37).也 就是显示细胞质表达的细胞部分从65%减少到"％，显示显性核表 达的细胞部分从0%增加到41%.在含有COS7以及Ltk细胞的其它 细胞体系中，也可以重现这些观察结果，表明GANP由核向细胞质的 榆出是通过依赖Crml的途径而进行调节的.因此可以认为GANP以 及Map80在核与细胞质之间进行穿梭，并且它们的局布定位似乎依 赖于与其它分子一起进行的向核中移入以及输出机制之间的平衡， 3. 3,共转染细胞中MCM3以及GANP的定位接着本发明者研究了 GANP的迁移与MCM3表达是否相关的问 題.哺乳动物的MCM3在细胞周期中使与染色质(或核杂质)之间 的结合状态发生变化，但是在整个间期，它一直只存在于核中(Kimura，J.13, 4311-4320),通过pSRa-MCM3-HA或pSR a-I3-HA对NIH-3T3细胞进行转染，固定，并用抗HA抗体 (Alexa488)进行免疫标记，用PI进行染色.转染的MCM3-HA与典型NLG的存在相吻合(Kimura，H. 等.，(1994) EMBO J. 13,4311-4320 、Takei，Y. 等 ， (1998) J.Biol.Chem，273，22177-22180)，在核中进行定位(图39),该核定位 依赖于MCM3的NLS.这是由于缺失该NLS的变异体MCM3 (13; MCM3ANLS-HA)只在细胞质中表达的缘故(困39;右困).通过pCXN2-Ganp-gfp或pCXN2-Gmap80^g印以及pSR a -MCM3-HA对细胞进行共转染，固定，并用抗HA抗体(Alexa546) 进行免疫标记，用TOTO-3对核进行前染色(图40).把细胞数表示 在困的下部(困40).非常有意思的是使用Ganp-GFP进行共转染时，给17%的细胞中 带来了 MCM3的细胞质定位(困40，用白箭头表示)。使用 Gmap80-GFP或Gp-GFP的共转染中，观察不到这样的结果，为了证明Ganp对MCM3的效果是特异的，在不同ganp-g印构 建体转染的前后，对核中出现的ECFP-Nuc的表达进行了研究.困41 表示用Ganp-GFP进行转染的代表性困象(困41). ECFP-Nnc在核 中的定位不因使用Ganp-GFP (围41)或Gmap80-GFP或Gp-GFP的任意一种共转染而受影响.Ganp以及MCM3的共表达还会造成GANP定位的变化.与单独 使用Ganp-GFP (38%)以及单独使用Gmap80-GFP (0%)的转染 (图37)相比，使用MCM3的共转染可以提高Ganp-GFP (74%) 以及Gmap80-GFP (64%)的核表达水平(困40). MCM3把GANP 以及Map80保持在核内，但是只有Ganp过表达可以促进MCM3在 细胞质中出现，(困40;由Ganp-GFP表达，17%).另一方面，不 能促进Gmap80 MCM3在细胞质中的表达(由Gmap80-GFP表达， 4%), MCM3在NLS中的突变(13; MCM3厶NLS-HA)(结果形成 MCM3存在于细胞质中)没有导致Ganp-GFP或Gmap80-GFP向核 中积蓄(困42).如果综合考虑13变异体(MCM3ANLS-HA)不与Ganp或Gp 进行締合(困35)的亊实，则表明与野生型MCM3不同，MCM3的NLS基元对于细胞中与GANP的功能性締合以及核与细胞质之间的 GANP输送是必要的.DNA转染实验，当与MCM3 —起导入时，显示Ganp-GFP积蓄 在核区域之中，表明形成了核中的GANP/MCM3复合体.MCM3不 含可以通过Crml进行识別的明显的共同NES样基元，因此MCM3 从核中的输出可能是依赖于具有NES样基元的其它结合分子或不同 的榆出机理. 一般认为GANP上的2个NES样基元参与了 LMB感 受态Crml依赖性输出途径(困37).通过GANP带有的2个NES样 基元(这些也许可以通过Crml进行识别)有可能参与了复合体的输 送，最近的研究表明，带有GANP相同区域的酵母SAC3参与了某种 蛋白质的核输出，并且与核膜孔复合体成分进行締合(Jones，A丄. 等,，(2000)Proc Natl. Acad.Sci. USA 97， 3224-3229 ),与GANP的共表 达使得MCM3对细胞质区域的定位发生变化，采用细胞融合方法，对MCM3在核-细胞质之间的穿梭进行了研 究(Schmidt- Zachmann， M.S.等"(1993) Cell 74,493-504),最初用 MCM3-HA对HeLa细胞进行转染，接着使其与没有进行转染的小鼠 Swiss-3T3细胞进行融合.为了抑制蛋白质合成，在环己亚胺存在下， 进行5小时醉育，然后对细胞进衧固定，对MCM3-HA进行免疫标 记.通过赫斯特(Hoechst)染色对异核体进行了研究.该染色是把 具有"斑点(mottle)的"异染色质小鼠的核(箭头)与人HeLa核 加以区别，如闺43中的代表性结果所示，在人和小鼠的核的双方，在异核体 中都可以找到MCMIHA.没有被融合的小鼠细胞不显示这样的染 色.该结果表明MCM3-HA从HeLa核被输送到细胞质中，接着又被 移入到小鼠核中.从这些结果可以分析得出MCM3-HA是穿梭蛋白质的结论.通常要证实它以与转基因产物相同的灵敏度从内源性蛋白质核向细胞质的 迁移往往是很困难的(Kimura，H"Ohtomo，T.等"(1996)Genes Cells 1， 977-993、 Mizuno，T.等.，(1999) Mol.Cell.Biol. 19,7886-7896),对于本 实施中所示的结果，也是如此.要证实哺乳动物细胞中的内源性MCM 蛋白质，以与在如酵母那样更原始的细胞内所达到的相同灵敏度，从核向细胞质的迁移也是很困难的.但是，本发明者的研究结果(实验是通过DNA转染法进行的) 表明在未操作细胞中MCM蛋白质在核-细胞质之间的穿梭恐怕是很 重要的.要更简单地清楚了解在细胞周期进行中MCM复合体在核-细胞质之间的移动，也许还需要再发现其它成分. 3. 4.细胞周期间的GANP定位在RNA/DNA引物酶结构域GANP特有抗原表位(pSers°2 GANP)上，使用特异的单克隆抗体，通过共焦激光扫描显微镜检测研究了 NIH陽3T3细胞中的GANP定位(Kuwahara, IC等.，(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98， 10279-10283).用抗pSer柳GANP(Alexa488;绿)以 及抗MCM3 (Alexa546;红)对处于细胞周期不同时期的NIH-3T3细 胞进行免疫染色.用TOTO-3碘化物(蓝)对核进行前染色.在间期 间，上述单克隆抗体在除核小体以外核内的所有位置全部进行反应(困 44).通过使用对抗MCM3抗体以及核酸进行染色的TOTO-3的三重 标记，详细分析了有丝分裂期间的GANP定位.可以认为随着细胞由 前中期向中期进展，GANP从浓缩染色质上脱离(困44).重叠困象 的黄色信号表示GANP和MCM3的共定位，但是若干蓝染色表示在 前中期图象的中心部位，即使是孤立的也仍然可以看得到GANP.在 这个阶段，GANP以及MCM3与浓缩的染色体不重叠.在中期的细 胞中，在纺锤体区域可以检测出GANP.并且该信号在后期染色体分 离到2个子细胞的过程中减少.在减数分裂后期，至核形成为止(终期)在细胞质区域中可以看 得到大部分GANP.这些结杲表明GANP与MCM3的行为类似，二 者在整个间期间内，几乎在核中进行共定位.这一情况与二者的相互 締合是一致的.但是如在有丝分裂期间，用共焦显微镜检测所示，GANP 和MCM3也可以分别存在(闺44 )，关于笫2型RNA/DNA引物酶的核-细胞质间的GANP穿梭在生 物学上的意义还有待于今后弄清.它也许与DNA修复最后阶段中RNA 引物的生成有关联.在正常细胞中GANP的表达水平较低，但是在细 胞急速增殖的发生中心，GANP表达得以上调(Kuwahara， IC等" (2000) Blood 95,2321-2328、 Kuwahara, K.等.，(2001) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 98， 10279-10283).另外GANP在具有快速细胞终期 的某些种细胞中，还可以以更高的水平表达'这一情况表明与MCM 复合体的締合对刺激DNA复制的可能性(Kuwahara， K.等.，(2001) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 98， 10279-10283). RNA/DNA引物蘇活性、 MCM3结合能力以及具有乙Bfe基转移醉结构域(Takei， Y.等.，(2001) EMBO Rep. 2， 119-123)的GANP表达可能与细胞周期行进过程的调节有关. 序列表序列编号5:引物序列编号6:引物序列编号7:引物序列编号8:引物序列编号9:引物序列编号10:引物序列编号11:引物序列编号12:引物序列编号13:引物序列编号14:引物序列编号15:引物序列编号16:引物序列编号17:引物序列编号18:引物序列编号19:引物序列编号20:引物序列编号21:引物序列编号22:引物序列编号23:引物序列编号24:引物序列编号25:引物序列编号26:引物序列编号27:引物序列编号28:引物序列编号29:引物 序列编号30:引物 序列编号31:引物 序列编号32:引物 序列编号33:引物 序列编号34:引物 序列编号35:引物 序列编号36:引物产业上的实用性通过使用本发明所得的过表达GANP小鼠，可以迅速制备过去不 可能得到的对病毒抗原特异的、高亲和性的抗体.因此可以期待能足 够迅速地获得特异的有效的抗体，以赶上病毒抗原的突变速度，从而 防止由延误感染引起的病情恶化，如艾滋病和C型肝炎.同时通过本 发明可以对应于来自感染患者的病毒抗原变异，制备特制的特异抗 体.制备抗体所需要的免疫时间为10天左右即可，其中具有高亲和 性变异的抗体的产生效率可提高到接近60%.还可以期待使用来自卧 床患者试样的高亲合性抗体产生的方案成为替代疫苗疗法的新型免疫 疗法.序列表〈110> Kumamoto Technology & Industry Foundation<120〉导入GANP基因的转基因哺乳动物及其应用<130> P03-0152PCT<150> PCT/JP02/11598<151〉 2002-11-07〈160〉 36<170〉 Patentln version 3.2<210〉 1<211> 6429<212> 腿〈213〉 Mus musculus<220〉<221〉 CDS<222> (384).. (6299)<400〉 1gttgcggtgc ggtgggcccg gtagaggctg cacgcagact gtgggcgagc acaagcgctg 60gcgacagtgg ccgtatctgg cggacttgct cctccctccg cggcctccgc tgtcccttgt 120gtctttgccg agttgctgaa ggccttcact agtcttcgct cgaaggcgtc tgttaaccta 180gcggccggct tccggagtgt taagcatcgg ggataaaaag ctattatttc tagaccaggg 240catcgcaagt tcgagttacc gggagaaaaa tgagatggtc atcctgagga tgaaggagag 300cttcccctgg caacagataa tttaaagagg agagctactt gtgtatagtc catatttatt 360gccttcagat aattggcttg aag atg cac ccg gtg aac ccc ttc gga ggc age 413Met His Pro Val Asn Pro Phe Gly Gly Ser 1 5 10age cca agt get ttt gcg gta tct tec age acc acg gga aca tat cag 461 Ser Pro Ser Ala Phe Ala Val Ser Ser Ser Thr Thr Gly Thr Tyr Gin 15 20 25act aaa tea cca ttt cga ttt ggc cag cct tec ctt ttt gga cag aac 509 Thr Lys Ser Pro Phe Arg Phe Gly Gin Pro Ser Leu Phe Gly Gin Asn 30 35 40age aca ccc age aag age ctg gcg ttt tea caa gta cca age ttt gca 557 Ser Thr Pro Ser Lys Ser Leu Ala Phe Ser Gin Val Pro Ser Phe Ala 45 50 55aca ccc tct gga gga age cat tct tec tec 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Gly Ser Cys Val Ser Ser Leu Ser Thr Leu lie Gly Thr Val 580 585 590Ala Asp Thr Ser Glu Glu Lys Tyr Arg Leu Leu Asp Gin Arg Asp Arg 595 600 605lie Met Arg Gin Ala Arg Val Lys Arg Thr Asp Leu Asp Lys Ala Arg 610 615 620Ala Phe Val Gly Thr Cys Pro Asp Met Cys Pro Glu Lys Glu Arg Tyr 625 630 635 640Leu Arg Glu Thr Arg Ser Gin Leu Ser Val Phe Glu Val Val Pro Gly 645 650 655Thr Asp Gin Val Asp His Ala Ala Ala Val Lys Glu Tyr Ser Arg Ser 660 665 670Ser Ala Asp Gin Glu Glu Pro Leu Pro His Glu Leu Arg Pro Ser Ala 675 680 685Val Leu Ser Arg Thr Met Asp Tyr Leu Val Thr Gin lie Met Asp Gin690 695 700Lys Glu Gly Ser Leu Arg Asp Trp Tyr Asp Phe Val Trp Asn Arg Thr 705 710 715 720Arg Gly lie Arg Lys Asp lie Thr Gin Gin His Leu Cys Asp Pro Leu 725 730 735Thr Val Ser Leu lie Glu Lys Cys Thr Arg Phe His lie His Cys Ala 740 745 750His Phe Met Cys Glu Glu Pro Met Ser Ser Phe Asp Ala Lys lie Asn 755 760 765Asn Glu Asn Met Thr Lys Cys Leu Gin Ser Leu Lys Glu Met Tyr Gin 770 775 780Asp Leu Arg Asn Lys Gly Val Phe Cys Ala Ser Glu Ala Glu Phe Gin 785 790 795 800Gly Tyr Asn Val Leu Leu Asn Leu Asn Lys Gly Asp lie Leu Arg Glu 805 810 815Val Gin Gin Phe His Pro Asp Val Arg Asn Ser Pro Glu Val Asn Phe 820 825 830Ala Val Gin Ala Phe Ala Ala Leu Asn Ser Asn Asn Phe Val Arg Phe 835 840 845Phe Lys Leu Val Gin Ser Ala Ser Tyr Leu Asn Ala Cys Leu Leu His 850 855 860Cys Tyr Phe Asn Gin lie Arg Lys Asp Ala Leu Arg Ala Leu Asn Val 865 870 875 880Ala Tyr Thr Val Ser Thr Gin Arg Ser Thr Val Phe Pro Leu Asp Gly 885 890 895<formula>formula see original document page 74</formula>Leu Gin Val Asp Cys Glu Glu Val Ser Ser Ala Gly Ala Ala Tyr 1085 1090 1095Val Ala Ala Ala Leu Gly Val Ser Asn Ala Ala Val Glu Asp Leu 1100 1105 1110lie Thr Ala Ala Thr Thr Gly lie Leu Arg His Val Ala Ala Glu 1115 1120 1125Glu Val Ser Met Glu Arg Gin Arg Leu Glu Glu Glu Lys Gin Arg 1130 1135 1140Ala G工u Glu Glu Arg Leu Lys Gin Glu Arg Glu Leu Met Leu Thr 1145 1150 1155Gin Leu Ser Glu Gly Leu Ala Ala Glu Leu Thr Glu Leu Thr Val 1160 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Arg 1775 1780 1785Met Gin Thr Gin Arg Glu Leu Gin Leu Ser His Gly Arg Ser Gly 1790 1795 1800Met Arg Ser lie His Pro Pro Thr Ser Thr Phe Pro Thr Pro Leu 1805 1810 1815Leu His Val His Gin Lys Gly Lys Lys Lys Glu Glu Ser Gly Arg1820 18251830Glu Gly Ser Leu Ser Thr Glu Asp Leu Leu Arg Gly Ala Ser Ala1835 18401845Glu Glu Leu Leu Ala Gin Ser Leu Ser Ser Ser Leu Leu Glu Glu1850 18551860Lys Glu Glu Asn Lys Arg Phe Glu Asp Gin Leu Gin Gin Trp Leu1865 18701875Ser Gin Asp Ser Gin Ala Phe Thr Glu Ser Thr Arg Leu Pro Leu1880 18851890Tyr Leu Pro Gin Thr Leu Val Ser Phe Pro Asp Ser lie Lys Thr1895 19001905Gin Thr Met Val Lys Thr Ser Thr Ser Pro Gin Asn Ser Gly Thr1910 19151920Gly Lys Gin Leu Arg Phe Ser Glu Ala Ser Gly Ser Ser Leu Thr1925 19301935Glu Lys Leu Lys Leu Leu Glu Arg Leu lie Gin Ser Ser Arg Ala1940 19451950Glu Glu Ala Ala Ser Glu Leu His Leu Ser Ala Leu Leu Glu Met1955 1960Val Asp Met 1970<210> 3<211> 6114<212〉 DNA<213> Homo sapiens1965〈220〉<221〉 CDS〈222〉 (38).. (5977)<400〉 3gtaatactta attaccttct aataattgga gcagaag atg aac cca act aat cct 55Met Asn Pro Thr Asn Pro 1 5ttc agt ggg cag cag cct agt get ttt teg gcg tct tct agt aat gta 103 Phe Ser Gly Gin Gin Pro Ser Ala Phe Ser Ala Ser Ser Ser Asn Val 10 15 20gga aca ctt cca tct aag ccg cca ttt cga ttt ggt caa cct tct ctt 151 Gly Thr Leu Pro Ser Lys Pro Pro Phe Arg Phe Gly Gin Pro Ser Leu 25 30 35ttt gga caa aac agt acc tta tct ggg aag age teg gga ttt tea cag 199 Phe Gly Gin Asn Ser Thr Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Phe Ser Gin 40 45 50gta tec age ttt cca gcg tct tct gga gta agt cat tec tct tea gtg 247 Val Ser Ser Phe Pro Ala Ser Ser Gly Val Ser His Ser Ser Ser Val 55 60 65 70caa aca tta ggg ttc acc caa acc tea agt gtt gga ccc ttt tct gga 295 Gin Thr Leu Gly Phe Thr Gin Thr Ser Ser Val Gly Pro Phe Ser Gly 75 80 85ctt gag cac act tec acc ttt gtg get acc tct ggg cct tea agt tea 343 Leu Glu His Thr Ser Thr Phe Val Ala Thr Ser Gly Pro Ser Ser Ser 90 95 100tct gtg ctg gga aac aca gga ttt agt ttt aaa tea ccc acc agt gtt 391 Ser Val Leu Gly Asn Thr Gly Phe Ser Phe Lys Ser Pro Thr Ser Val 105 110 115ggg get ttc cca age act tct get ttt gga caa gaa get gga gaa ata 439 Gly Ala Phe Pro Ser Thr Ser Ala Phe Gly Gin Glu Ala Gly Glu lie 120 125 130gtg aac tct ggt ttt ggg aaa aca gaa ttc age ttt aaa cct ctg gaa 487 Val Asn Ser Gly Phe Gly Lys Thr Glu Phe Ser Phe Lys Pro Leu Glu 135 140 145 150aat gca gtg ttc aaa cca ata ctg ggg get gaa tct gag cca gag aaa 535 Asn Ala Val Phe Lys Pro lie Leu Gly Ala Glu Ser Glu155 160 165acc cag age caa att get tct ggg ttt ttt aca ttt tec cac cca att 583 Thr Gin Ser Gin lie Ala Ser Gly Phe Phe Thr Phe Ser His Pro lie 170 175 180agt agt gca cct gga ggc ctg gcc cct ttc tct ttt cct caa gta aca 631 Ser Ser Ala Pro Gly Gly Leu Ala Pro Phe Ser Phe Pro Gin Val Thr 185 190 195agt agt tea get acc act tea aat ttt acc ttt tea aaa cct gtt agt 679 Ser Ser Ser Ala Thr Thr Ser Asn Phe Thr Phe Ser Lys Pro Val Ser 200 205 210agt aat aat tea tta tct gcc ttt acc cct get ttg tea aac caa aat 727 Ser Asn Asn Ser Leu Ser Ala Phe Thr Pro Ala Leu Ser Asn Gin Asn 215 220 225 230gta gag gaa gag aag aga gga cct aag tea ata ttt gga agt tct aat 775 Val Glu Glu Glu Lys Arg Gly Pro Lys Ser lie Phe Gly Ser Ser Asn 235 240 245aat age ttc agt age ttc cct gta tea tct gcg gtt ttg ggc gaa cct 823 Asn Ser Phe Ser Ser Phe Pro Val Ser Ser Ala Val Leu Gly Glu Pro 250 255 260ttc cag get age aaa gca ggt gtc agg cag ggg tgt gaa gaa get gtt 871 Phe Gin Ala Ser Lys Ala Gly Val Arg Gin Gly Cys Glu Glu Ala Val 265 270 275tec cag gtg g幼cca ctt ccc age eta atg aaa gga ctg aaa agg犯g 919 Ser Gin Val Glu Pro Leu Pro Ser Leu Met Lys Gly Leu Lys Arg Lys 280 285 290gag gac cag gat cgc tec cca agg aga cat ggc cac gag cca gca gaa %7 Glu Asp Gin Asp Arg Ser Pro Arg Arg His Gly His Glu Pro Ala Glu 295 300 305 310gat teg gat cct ctg tec egg ggc gat cat cct cca gac aaa cga cct 1015 Asp Ser Asp Pro Leu Ser Arg Gly Asp His Pro Pro Asp Lys Arg Pro 315 320 325gtc cgc ctg aat cga ccc egg gga ggt act Ua ttt ggt egg acg ata 1063 Val Arg Leu Asn Arg Pro Arg Gly Gly Thr Leu Phe Gly Arg Thr lie 330 335 340cag gat gtt ttc aaa age aat aag gaa gta ggt cgt ctg ggc aac aag 1111 Gin Asp Val Phe Lys Ser Asn Lys Glu Val Gly Arg Leu Gly Asn Lys 345 350 355g3g gcc犯a Glu Ala Lys 360
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Glu
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1303
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1351
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33C
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333
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Ser 470
1447
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1495
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Lys
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1543
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Lys
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ccc Pro
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犯3 Lys
ccc Pro
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1591
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Asp
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1639
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Gly 545
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1831
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1879
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1927
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ctg Leu
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1975
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gtg Val
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CC3
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2023
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gC3
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2071
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ccc Pro
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ctg Leu
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ccc Pro
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2119
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3gg 3CC
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atg Met
gac Asp
tac Tyr
ctg Leu
gtg Val 705
3CC
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ate lie
3tg
Met
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2167
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gat Asp
tgg Trp
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gtg Val
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33C
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2215
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2263
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2359
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2407
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2455
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2503
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2551
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2647
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2695
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2743
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2791
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2935
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2983
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3gC
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3031
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ccc Pro 1005
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ggg Gly
3076
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gta Val 1020
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Ser
3121
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Leu Pro 1030
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gcc Ala 1035
cct gcg Pro Ala
ccc Pro
tea Ser
cca Pro 1040
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cct Pro
ctg Leu
3166
cct cct Pro Pro 1045
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acc Thr 1050
ccg tct Pro Ser
gtg Val
gcg Ala
ccc Pro 1055
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3211
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g幼 Glu 1065
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cct Pro
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gag Glu 1070
ccc Pro
gtg Val
ccc Pro
3256
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ctg Leu 1080
gcg cag Ala Gin
gtg Val
gtg Val
gac Asp 1085
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3tC
lie
3301
cag gag Gin Glu 1090
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gac Asp 1095
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g肌 Glu
gtt Val
ggc Gly 1100
tct Ser
gcg Ala
ggt Gly
3346
get gcc Ala Ala 1105
t3C gC3 gCt gCC
Tyr Ala Ala Ala
gcc Ala 1110
ctg ggt Leu Gly
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肪t Asn 1115
get Ala
get Ala
3tg
Met
3391
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gca Ala 1125
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ggc Gly
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ttg Leu 1130
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权利要求
1.导入GANP基因的转基因非人哺乳动物或其子代的制备方法，包括将GANP基因导入非人哺乳动物。
2. 根据权利要求1中所述的方法，其中，导入的GANP基因在 B细胞中表达。
3. 根据权利要求1或2中所述的方法，其中，转基因非人哺乳动 物是由GANP基因转染的ES细胞产生的。
4. 根据权利要求1或2中所述的方法，其中，哺乳动物是小鼠。
5. 导入GANP基因的转基因非人哺乳动物或其子代的组织、器 官或细胞的制备方法，包括从该转基因非人哺乳动物或其子代中回收 所述组织、器官或细胞。
全文摘要
本发明的目的在于提供作为诊断以及治疗各种疾病药剂而有效的高亲和性抗体、为产生该抗体的转基因哺乳动物、使用该高亲和性抗体或高亲和性抗体产生细胞的药剂。本发明还可以提供导入GANP基因的转基因哺乳动物、其子代或它们的一部分，以及采用这些转基因哺乳动物、其子代或其一部分产生高亲和性抗体的方法。
文档编号C12P21/08GK101240291SQ20071019391
公开日2008年8月13日 申请日期2003年11月7日 优先权日2002年11月7日
发明者阪口薰雄 申请人:医能高选工学