专利名称:真菌激活蛋白在生物杀虫剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及从生物中提取的蛋白，具体涉及一种真菌蛋白。
背景技术：
从原核细菌Harpin(过敏蛋白)中研究开发而成的微生物蛋白农药是目前国际上公认的代表性抗虫防病微生物蛋白新农药，有关对Harpin的研究和Messenger的成功开发开创了植物分子免疫药物的新领域和促进微生物蛋白新农药的兴起。近年来，邱德文博士首次从真核微生物真菌(Alternaria)中分离出新结构的真菌激活蛋白(中国专利申请公开号为CN1344727A)，除了具有明显的增强植物免疫力，显著促生农作物增产效果(10％以上)，可大幅度提高农产品质量和国际竞争力以外，对植物烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病等多种病毒病害和蚜虫的防治效果也在75％以上，表现出了优秀的开发前景。而该激活蛋白对鳞翅目害虫是否有防治效果，特别是对具有很高市场占有率的生物杀虫剂苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis Bt)是否有杀虫增效作用，是农药研究中值得探索的问题。
发明内容
本发明旨在研究真菌蛋白在生物杀虫剂中的作用，以提高生物杀虫剂的杀虫效果。
本发明是通过以下技术方案实现上述发明目的的。
将3.0％的真菌激活蛋白可湿性粉剂与50000IU/μl苏云金杆菌原粉以激活蛋白按Bt用量的0.03～1.5∶1的比例混合后，用饲料染毒、浸叶浸虫或浸叶法处理鳞翅目害虫，使苏云金杆菌的杀虫增效指数达1.5～18.5。
下面进一步详述本发明。
本发明采用饲料染毒法、浸叶法、浸叶浸虫法等多种生物测定方法，用重要农业害虫棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾作为测试害虫，测定了真菌激活蛋白对Bt的增效作用。结果一致性的表明，这种激活蛋白对Bt具有良好的增效作用，而且随激活蛋白加入比例的增加，对Bt的增效作用越明显。
试验方法与试验结果如下1材料与方法1.1供试药剂50000IU/μl Bt原粉(武汉市Bt研究中心产品)3％真菌激活蛋白可湿性粉剂(中国农科院生防所蛋白药物工程实验室提供)
1.2供试虫种棉铃虫成虫1996年采自河北4个不同地区棉田，室内混合繁殖，用人工饲料饲养至今，饲养方法见范贤林1998[1]。本试验中供试幼虫虫龄为饲料混合法采用2龄幼虫、浸叶浸虫法和浸叶法采用3龄幼虫。
小菜蛾采自北京郊区蔬菜田，在室内用甘蓝叶片饲养多代，饲养温度25±1.0℃，光照周期16L∶8D，采用3龄幼虫供试。
甜菜夜蛾同小菜蛾。
1.3试验方法1.3.1饲料染毒法设激活蛋白、Bt粉剂、Bt与激活蛋白按一定比例混合3种处理。按测定所需将各药剂配置成系列浓度分别与人工饲料均匀混合后，加入24孔试验盒中。选择体重均匀的2龄幼虫分别移入孔中，每孔1头，加保鲜膜后加盖，用皮筋扎紧，置于25±1.0℃、光周期L∶D＝16h∶8h的培养箱中，每处理重复3次，每重复72头。5天后检查结果。
1.3.2浸渍法设激活蛋白、Bt粉剂、Bt与激活蛋白按一定比例混合3种处理。每个处理用水稀释6-8个浓度，待用。
棉铃虫用两种方法。浸叶法为，将新鲜油菜叶圆片浸入药液中10秒，取出后在纸上自然晾干，分别加入24孔试验盒中，每孔加入棉铃虫3龄幼虫1头。浸叶浸虫法为，分别将油菜叶圆片和幼虫在相同浓度的药液中浸10秒钟，待叶片晾干和虫体多余药液吸去后，移入24孔盒中每孔1叶1头。24孔盒用皮筋扎紧，每个浓度重复3次，幼虫72头，设空白对照。处理后的试虫置于25±1.0℃、光周期L∶D＝16h∶8h的培养箱中培养48小时和72小时后检查结果。
小菜蛾用浸叶法。将甘蓝叶片在药液中浸渍10秒，晾干，放入直径10厘米培养皿中，加入幼虫，其它同棉铃虫。
甜菜夜蛾用浸叶法，同小菜蛾用浸叶法。
上述试验的试虫死亡判断标准均为用拨针触动虫体，试虫完全不动者为死亡。用计算机计算出Bt原粉+激活蛋白和Bt原粉的LC50值、95％置信限、LC90值，并用LC50值计算增效指数。
2试验结果2.1激活蛋白加入Bt中对棉铃虫的增效作用2.1.1饲料染毒法的测定结果饲料染毒法处理棉铃虫5天后，Bt+激活蛋白以1∶0.015、1∶0.03比例混合测定的LC50值与Bt单独使用比较，增效指数分别为1.1倍和2.1倍，结果显示，以1∶0.03的比例在Bt中加入激活蛋白对Bt有很好的增效作用(见表1)。
用此方法测定了3％激活蛋白可湿性粉剂本身的生物活性，在所设的激活蛋白为15.6μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml和1000μg/ml共7个浓度中，5天后棉铃虫的死亡率在8.8％-18.8％之间，与对照死亡率8.3％没有显著差异。
表1 饲料染毒法测定激活蛋白对Bt的增效试验(棉铃虫，5天)
注增效指数＝Bt原粉的LC50值/Bt原粉+激活蛋白的LC50值，下同。
2.1.2浸叶法测定结果用浸叶法测定不同药剂对棉铃虫的活性，Bt+激活蛋白以1∶0.095比例的用量加入，对Bt的增效指数可达2.74倍，与饲料染毒法相比，增加激活蛋白的用量后，增效作用更明显(见表2)。
表2浸叶法测定激活蛋白对Bt的增效试验(棉铃虫，72小时)毒力回归式 LC50值(95％置信限) LC90值药剂增效指数(Y＝) (μg/ml) (μg/ml)Bt原粉+激活蛋2.54+0.92X 484.7(223.70-1050.25) 12176.41 2.74白1∶0.0951328.19(592.759-2976.
Bt原粉 1.75+1.04X 22667.61 1.00893)2.1.3浸叶浸虫法的测定结果用浸叶浸虫法对棉铃虫进行测定，Bt+激活蛋白以1∶1.5比例的用量加入，对Bt的增效指数更高达18.5倍，进一步说明了这种新型激活蛋白不仅对Bt的增效作用显著。而且，随激活蛋白加入比例的增加，对Bt的增效效果越好(见表3)。
表3浸叶浸虫法测定激活蛋白对Bt的增效试验(棉铃虫，72小时)毒力回归式 LC50值(95％置信限) LC90值药剂 增效指数(Y＝) (μg/ml) (μg/ml)Bt原粉+激活蛋4.51+0.81X 4.08(0.66-25.23) 158.1402 18.5白1∶1.575.50Bt原粉 3.85+0.61X 9326.626 1.0(20.51-277.92)激活蛋白 ＞110002.2激活蛋白加入Bt中对小菜蛾的增效作用用浸叶法对小菜蛾的测定结果表明，处理60小时后，按Bt蛋白用量的60％加入激活蛋白也对Bt具有显著的作用，增效指数高达5.5倍(见表4)。
表4浸叶法测定激活蛋白对Bt对的增效作用(小菜蛾，60小时)
2.3激活蛋白加入Bt中对甜菜夜蛾的增效作用用浸叶法对甜菜夜蛾3龄幼虫的测定结果表明；在Bt稀释1000倍的情况下，加入少量的激活蛋白Ap，使甜菜夜蛾的死亡率与使用稀释500倍Bt的效果相同(表5)表5激活蛋白对Bt的增效试验(甜菜夜蛾)
注药剂浓度为Bt(稀释倍数)+激活蛋白(％)方法浸叶法；虫种甜菜夜蛾3龄幼虫由于激活蛋白本身无毒，不改变植物的DNA，在植物体内和土壤中易分解，无残留，在促进作物生长，防治病虫害的作用显著，又可明显提高Bt的杀虫效果，通过更加系统的研究，有可能开发出Bt的新型增效剂，促进以Bt为代表的生物农药的大发展。因此有希望开发成农业健康生产技术体系中一种新型多功能蛋白农药。
权利要求
1.真菌激活蛋白在生物杀虫剂中的应用，其特征在于将3.0％真菌激活蛋白可湿性粉剂与50000IU/μl的苏云金杆菌原粉，以激活蛋白按Bt用量的0.03～1.5∶1的比例混合后处理鳞翅目害虫，使苏云金杆菌的杀虫增效指数达1.5～18.5。
专利摘要
本发明涉及一种真菌蛋白。将3.0％的真菌激活蛋白可湿性粉剂与50000IU/μl的苏云金杆菌原粉，以激活蛋白按Bt用量的0.03～1.5∶1的比例混合后用饲料染毒、浸叶浸虫或浸叶法处理鳞翅目害虫，使苏云金杆菌的杀虫增效指数达1.5～18.5。有望开发出Bt的新型增效剂，促进以Bt为代表的生物农药的大发展。
文档编号A01N63/04GKCN1555707SQ200410022821
公开日2004年12月22日 申请日期2004年1月8日
发明者邱德文, 于耀平 申请人:邱德文导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan